Иммунотерапия сахарного диабета 1-го типа: современное состояние проблемы и ее перспективы. Часть 2

Антигеннеспецифичная терапия после манифестации сахарного диабета

Завершенные исследования

В качестве одного из первых иммунотерапевтических препаратов (ИТП) для профилактики и лечения сахарного диабета (СД) 1-го типа был использован циклоспорин, который быстро давал протективный эффект. Однако эффект применения циклоспорина заканчивался с прекращением терапии, а серьезные побочные эффекты, в первую очередь нефротоксичность, сделали его использование неприемлемым как для клинического применения, так и для широкого научного исследования [3, 11, 17, 29, 38]. Азатиоприн в суточной дозе 2 мг/кг также давал незначительный позитивный эффект при менее выраженных побочных явлениях (табл. 1).

Линомид (Linomide, quinoline-3-carboxamide; не путать с препаратом линамид (лат. — Lynamide, международное название — Pyrazinamide), применяющимся для лечения туберкулеза) является иммуномодулятором, который при введении NOD-мышам с 5-недельного возраста в дозе 0,02 мг/дл предотвращает развитие СД [19]. Даже у животных старше 16-недельного возраста линомид сохраняет свою активность. Механизм его действия может быть связан с индукцией активации регуляторных клеток. Предотвращение диабета у NOD-мышей сочетается с устранением Т-клеточного пролиферативного дефекта [26] и улучшением регуляции Т-клеточной трансдукции сигнала p21ras [34]. Кроме того, линомид уменьшает продукцию фактора некроза опухолей (ФИО) [18], стимулирует натуральные киллеры (НК) [22] и, возможно, ингибирует процесс апоптоза р-клеток [13]. Показано также, что линомид подавляет апоптоз в гепатоцитах, вызываемый Fas-антителами [35]. Линомид дал хороший протективный эффект на различных экспериментальных моделях, таких, как аутоиммунный энцефаломиелит, миастения гравис, гломерулонефрит. К настоящему времени проведено единственное клиническое исследование линомида при СД 1-го типа [13]. 63 пациента в возрасте 10—20 лет с недавно диагностированным СД 1-го типа (не более 10 дней) были рандомизированы в 2 группы: 1-я группа — 42 человека получали линомид в течение 1 года в дозе 2,5 мг, 2-я группа — контрольная. Через 9 и 12 мес уровень гликированного гемоглобина (НЬА_1С) был на 10—15% ниже у больных, получавших линомид (р = 0,003и/?<0,05 соответственно). Доза инсулина была также ниже на 32—40% на фоне применения линомида на 3-м (р < 0,03), 6-м (р < 0,02), 9-м (р < 0,001) и 12- м месяце (р = 0,01), секреция С-пептида была выше в группе, получавшей лечение, однако недостоверно. Из побочных эффектов линомида у больных СД были зарегистрированы лишь незначительная транзиторная анемия, тромбоцитопения и субъективные боли в суставах. Однако зарегистрировано 13 случаев экссудативного перикардита среди 754 пациентов с рассеянным склерозом и лейкемией, получавших линомид [23]. И хотя в этом исследовании не выявлено тяжелых осложнений, высокая кардиоваскулярная токсичность послужила поводом для прекращения нескольких клинических исследований по линомиду.

Диазоксид является АТФ-чувствительным активатором К⁺-каналов, который ингибирует секрецию инсулина. Было установлено, что экспрессия аутоантигенов регулируется концентрацией глюкозы и увеличивается при стимуляции секреции инсулина [7, 20]. Постепенно увеличивающаяся концентрация глюкозы приводит к повышенной чувствительности клеток, к деструктивному действию стрептозоцина [15], которое, как было показано на животных моделях, может быть предотвращено введением диазоксида [25]. У людей снижение функции β-клеток носит частичный характер и не всегда достижимо, что в исследованиях отражается различным уровнем секреции С-пептида за время лечения [8]. Тем не менее применение диазоксида может приводить к сохранению остаточной секреции инсулина и задерживать период ремиссии. Результаты применения диазоксида у детей хуже, чем у взрослых [31]. Высокая частота несерьезных осложнений в сочетании со стандартной инсулинотерапией и/или другими методами иммунотерапии и меньшая эффективность диазоксида у детей делают его применение в этой группе менее привлекательным. Появление новых высокоселективных АТФ-чувствительных активаторов К⁺ каналов может быть перспективным направлением.

Таблица 1. Антигеннеспецифичная иммунотерапия после манифестации СД 1-го типа

Исследования, проходящие в настоящее время

СhOKT3yl(Ala-Ala) и ChAgly0D3(Teplizumab) являются рекомбинантными моноклональными антителами (МКАТ) с мутированным или агликозилированным Fc- регионом соответственно, которые связываются с CD3 (Т-клеточным рецептором) Т-клеток человека. У этих МКАТ имеется измененный Fc-фрагмент, делающий связывание с Fc-рецептором невозможным. Связывание с этим рецептором в норме приводит к активации Т-клеток с высвобождением цитокинов. МКАТ, направленные против CD3, приводят только к синдрому кратковременного выделения цитокинов с потерей или перераспределением Т-клеток, однако сразу после курса лечения восстанавливается полная иммунокомпетентность с увеличением популяции CD4⁺ CD25⁺ Т-клеток, экспрессирующих РохРЗ-транскрипционный фактор, которая, как считается в настоящее время, выполняет имму- норегуляторную функцию. FoxP3 (Fork-head Box Protein 3) входит в состав fork-head-семейства белковых транскрипционных факторов. РохРЗ-белки являются важнейшим элементом в дифференциации и развитии регуляторных Т-клеток [1]. Увеличение популяции этих Т-клеток может быть связанно с длительной защитой р-клеток после курса МКАТ. Хотя механизм действия анти-СЭЗ МКАТ не вполне ясен, показано, что короткий курс лечения ими приводит к снижению уровня аутоагрессивных Т-клеток вместе с увеличением популяции регуляторных Т-клеток, экспрессирующих ос-цепь рецептора ИЛ-2 (CD25), опосредованную TGF-p [4]. Как показано в двух завершенных к настоящему времени исследованиях это сопровождается улучшением секреции С-пептида, снижением уровня НЪА_1С и дозы инсулина [21, 24]. Получение положительных результатов от применения ан- ти-СЭЗ МКАТ способствовало началу еще нескольких исследований в этом направлении (см. табл. 1).

Otelixizumab (TRX4, ChAglyCD3) разработан совместно "Tolerx" (США) и ’’GlaxoSmithKline” (Великобритания) специально для лечения СД 1-го типа, в отличие от других анти-СИЗ МКАТ. Однако производители в дальнейшем планируют использовать Otelixizumab и для лечения других болезней, таких, как псориаз и ревматоидный артрит. В настоящее время продолжается набор в III фазу центрального исследования DEFEND-1 (Durable-Response Therapy Evaluation For Early or New-Onset Type 1 Diabetes), а также продолжается II фаза исследования TTEDD (Therapeutic Evaluation of Different Multi-Dose Regimens in Type 1 Diabetes Mellitus), целью которого является изучение режимов дозировки препарата.

К сожалению, повысить эффективность применяемых в настоящее время анти-СЬз МКАТ путем увеличения дозы не представляется возможным, даже в используемых сейчас дозах МКАТ приводят к реактивации латентно протекающей вирусной инфекции Эпштейна- Барр [24] и продукции антител к самим МКАТ [21]. Таким образом необходимо искать новые подходы к применению МКАТ, например используя их до манифестации СД или в комбинации с другими иммунотерапевтическими препаратами.

CD20— пан-В-маркер, как и CD19, часто использующийся для идентификации В-клеток. CD20 — фосфопротеин, молекулярная масса которого равна 33—37 кД, экспрессирован у человека и мышей только на В-лим- фоцитах. У человека он встречается как на покоящихся, так и на активированных В-лимфоцитах, но отсутствует на плазматических клетках. CD20 принимает участие в В-клеточной активации и В-клеточной пролиферации. Моноклональные антитела к CD20 (Rituximab) ингибируют клеточную пролиферацию, вызванную анти-Ig. Rituximab одобрен FDA для лечения В-лимфоцитарных лимфом. В настоящее время проводится исследование по его клиническому применению при СД 1 -го типа.

Стволовые клетки предоставляют перспективный метод лечения СД 1-го типа. Пересадки костного мозга давно уже используются для терапии больных с различными опухолевыми процессами, пациентов, подвергшихся химиотерапии, а также для лечения различных аутоиммунных заболеваний, таких, как рассеянный склероз, красная волчанка и ревматоидный артрит. Недавние исследования на мышах с иммунодефицитом показали, что стволовые клетки костного мозга могут инициировать регенерацию [3-клеток. Пуповинная кровь представляет собой идеальный источник стволовых клеток, в ней содержится гораздо больше стволовых клеток, чем в костном мозге. Пуповинная кровь успешно используется для лечения острого лимфобластного и миелобластного лейкоза, лимфом и т. д. Кроме того, пуповинная кровь содержит большое количество так называемых регуляторных Т-клеток. Эти клетки могут уменьшить аутоиммунные процессы. Необходимость восстановления иммунологической толерантности у больных СД 1-го типа делает применение стволовых клеток пуповинной крови у этой категории больных очень перспективным. В настоящее время Университетом Флориды (США) проводится исследование по применению стволовых клеток пуповинной крови у больных старше 1 года с впервые выявленным СД 1-го типа и замороженной пуповинной крови. Цель переливания аутологичной пуповинной крови состоит в попытке восстановить иммунологическую толерантность и, возможно, вызвать регенерацию панкреатических р-клеток. Также в процессе исследования будут изучены потенциальные изменения в метаболических/ иммунных функциях, приводящие к регенеративным процессам.

Активным компонентом препарата PROCHYMAL™ ("Osiris Therapeutics, Inc.", США) являются культивированные ex vivo мезенхиальные (печеночные) стволовые клетки (МСТ) взрослого человека. Эти клетки производятся от здоровых взрослых добровольцев, а не от плодов, эмбрионов или животных. Перед введением пациенту препарат подвергается ряду серьезных проверок, в частности на наличие инфекционных агентов. Исследованиями показано, что МСТ являются универсально совместимыми и могут быть использованы без учета тканевой совместимости. На животных моделях было установлено, что МСТ мигрируют в очаги воспаления организма. Взаимодействуя с иммунокомпетентными клетками, они уменьшают воспалительные явления и способствуют регенерации поврежденной ткани. Компанией "Osiris Therapeutics" при поддержке JDRF ("Juvenile Diabetes Research Foundation") в настоящее время проводится исследование по клиническому применению препарата PROCHYMAL™ у больных с недавно манифестировавшим СД 1 -го типа.

CTLA-4 Ig (Abatacept) представляет собой объединенный протеин из внешнего домена CTLA4 и тяжелой цепи Fc-фрагмента молекулы IgG, который модулирует Т- клеточную ко-стимуляцию, опосредованную через CD28/CD80/CD86. На рисунке (см. на вклейке) представлен механизм активации Т-клеток. Активация Т- клетки требует двух сигналов. Первый — антигенспеци- фическое взаимодействие Т-клеточного рецептора (ТКР) с комплексом МНС/АГ на поверхности АПК. В активации Т-клеток, распознавших антиген, помимо белков CD3 принимают участие белки CD4/CD8. Долгое время функция этих белков оставалась неизвестной. Впоследствии стало ясно, что они принимают самое непосредственное участие в качестве корецептора в процессе взаимодействия ТКР с молекулами МНС. На клеточной поверхности ТКР и CD4/CD8 представлены независимо друг от друга. Их встреча происходит в процессе формирования ответа на антиген. После распознавания Т-кле- точным рецептором антигенного комплекса происходит взаимодействие CD4/CD8 с молекулой МНС.

Второй сигнал (костимуляция) может быть опосредован множеством потенциальных костимуляторных механизмов, основным из которых является взаимодействие между молекулой CD28 на поверхности Т-клетки и CD80/CD86 на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АПК). Костимуляция необходима для Т-клеточ- ного ответа, без нее происходит анэргия Т-лимфоцита. Т-клетки могут экспрессировать на своей поверхности CTLA-4, который в 20 раз активней связывается с CD80/ CD86 по сравнению с CD28, но при этом не активируют Т-клетки. Это приводит к блокировке стимуляции через CD80/CD86 и ингибированию активации Т-клеток.

В отличие от животных моделей, иммунотерапевтические препараты (ИТП), использованные в качестве системных иммуномодуляторов, показали значительно худший результат. Иммунизация с использованием БЦЖ не привела к успеху. Терапию ИФН-а проводили небольшой группе из 10 человек, было продемонстрировано увеличение секреции С-пептида минимум на 30% у 8 пациентов, предполагая лишь возможную эффективность этого подхода (см. табл. 1).

Цитокины

Введение цитокинов для лечения СД 1-го типа рассматривается уже давно. К настоящему времени описано множество положительных и побочных эффектов от их применения на лабораторных животных. При этом в основном используются цитокины — Т-хелперы 1-го (Тх1)- и 2-го (Тх2) типа для уменьшения количества аутоагрессивных и увеличения регуляторных Т-клеток. Важным обстоятельством является то, что эффект при использовании цитокинов зависит от времени, дозы и пути введения (системно или в виде ДНК-вакцин). Например, экспрессия ИЛ-10 в 0-клетках способствует прогрессированию аутоиммуного процесса при СД, в то время как использование ДНК-вакцины частично предотвращает развитие болезни [41]. Например, введение ИЛ-18 NOD-мышам на 4-й неделе жизни приводит к усилению Тх1-опосредованного иммунного ответа при развитии СД [30]. При введении на 10-й неделе жизни ИЛ-18 играет супрессорную роль, изменяя Тх1/Тх2 баланс [36]. Кроме того, локальная экспрессия специфического цитокина может снижать любой антидиабетический эффект от его системного применения. Все это подчеркивает сложность использования цитокинов для лечения СД 1-го типа.

Комбинированная иммунотерапия

Как следует из предыдущих разделов, в настоящее время какой-либо ИТП в виде монотерапии не дал достаточного эффекта при лечении СД 1 -го типа. Позитивные результаты отмечены лишь для нескольких ИТП. Перспективным представляется использование комбинированной терапии, которая будет направлена на увеличение точек приложения или на усиление эффекта иммунотерапии (табл. 2).

В исследовании D. Bresson и соавт. [9] на 2 линиях мышей были показаны великолепные результаты применения анти-СЭЗ МКАТ в сочетании с проинсулином, вводимым интраназально, которые значительно превосходили результаты монотерапии каждым из этих ИТП. Возможно, это связано с тем, что анти-СБЗ и иммунизация аутоантигенами оказывают синергетическое действие и способствуют увеличению количества и распространению Т-клеток, обладающих регуляторными свойствам. Кроме того, уменьшение количества аутоагрессивных Т-клеток под действием МКАТ создаст "окно", которое будет способствовать пролиферации новых регуляторных Т-клеток. Предполагается, что вновь образующиеся регуляторные Т-клетки не способны подавлять активность уже циркулирующих, активированных аутоагрессивных Т-клеток, эту задачу и призваны выполнить анти-СБЗЗ МКАТ [27].

В настоящее время DiabetesTrialNet проводит исследование эффективности сочетания ингибитора инозинмонофосфатдегидрогеназы микофенолата мофетила (Mycophenolate mofetil/CellCept®), и анти-СЭ25 МКАТ даклизумаба (Daclizumab/Zenapax®). Оба препарата с успехом используются для лечения других аутоиммунных заболеваний и при трансплантации, в том числе островковых клеток.

Сочетание ИЛ-2 с сиролимусом (Sirolimus) показало превосходный результат в преклинических исследованиях [33]. Сиролимус является иммуносупрессантом, который ингибирует Т-клеточную пролиферацию, опосредованную ИЛ-2, при этом не влияя на ИЛ-2-индуцирован- ный апоптоз Т-клеток. Совместное введение этих препаратов ведет к смещению от пролиферации к апоптозу Т- клеток. Кроме того, комбинация этих ИТП защищает р- клетки от рекуррентного аутоиммунного разрушения при трансплантации их у NOD-мышей. В 2007 г. стартовала 1-я фаза клинического исследования комбинации этих препаратов.

Регенеративная терапия

В дополнение к иммунотерапии в перспективе можно будет использовать препараты, активирующие регенерацию р-клеток. Например, комбинация эпидермального ростового фактора (epidermal grow factor — ЭРФ) с гастрином приводят к значительному увеличению массы р- клеток, культивируемых ex vivo [39].

Метод генерации новых р-клеток воссоздает процесс неогенеза в развивающемся плоде, когда р-клетки развиваются из примитивных предшественников (прекурсоров). Этот процесс может быть заново активирован сочетанием ЭРФ и гастрина, с включением клеток-предшественников, присутствующих в панкреатическом протоке любого человека. Новые исследования показали, что сочетание этих 2 ростовых факторов может увеличить количество р-клеток в 3 раза. ЭРФ способствует делению прекурсорных клеток, а гастрин способствует их дифференцировке в р-клетки. Таким образом отдельно ни один ростовой фактор не эффективен, только сочетание дает должный результат. Процесс неогенеза можно остановить в любой момент, прекратив введение факторов роста и дифференцировки.

Регенерация позволит восстановить функцию р-клеток без трансплантации, которая требует источника островковых клеток. Кроме того, в настоящее время чтобы получить достаточное количество р-клеток для одной трансплантации необходимо 2—3 поджелудочные железы. Культивирование р-клеток in vitro позволит получить достаточное их количество для 3 пересадок (http:// www.jdrf.org). Успешный результат применения ЭРФ с гастрином способствовал началу новых клинических исследований (http://www.transitiontherapeutics.com/).

Вероятно, для больных СД 1-го типа с большим стажем заболевания, т. е. с очень низкой или полностью отсутствующей собственной остаточной секрецией инсулина, необходимо будет применять иммунотерапию в сочетании с трансплантацией р-клеток.

Дендритные клетки

Дендритные клетки (ДК) относятся к группе антигенпрезентирующих клеток. Следовательно, основной их функцией является обработка и презентация антигенного материала другим иммунным клеткам. Больше всего ДК находится в тканях, которые соприкасаются с внешней средой, например в толще эпителиального слоя слизистой оболочки кишечника, в подслизистой респираторного, желудочно-кишечного и урогенитального трактов. Развитие иммунологической толерантности в первую очередь связывают именно с ДК.

При попадании в очаг воспаления незрелые ДК, взаимодействуя с антигенами и подвергаясь воздействию провоспалительных сигналов, претерпевают процесс созревания посредством ряда внутренних механизмов. Затем они мигрируют в анатомически ближайшие лимфатические узлы, где происходит процесс антигенпрезен- тации комплекса МНС/антиген наивным (не активированным) Т-клеткам через ТКР. Активация Т-клетки требует двух сигналов. Первый — это антигенспецифиче- ское взаимодействие ТКР с комплексом МНС/АГ на поверхности АПК. Второй сигнал опосредован взаимодействием между молекулой CD28 на поверхности Т-клетки и CD80/CD86 на поверхности АПК. Т-клетки экспрессируют на своей поверхности CTLA-4(CD152), который в 20 раз активней связывается с CD80/CD86 по сравнению с CD28, но при этом не активирует Т-клетки. Отсутствие ко-стимуляторных молекул или ко-стимулятор- ного сигнала приводит к нарушению активации Т-клет- ки, что ведет к апоптозу или функциональной анэргии (см. рисунок).

Многими исследованиями установлено, что незрелые ДК играют огромную роль в создании иммунологической толерантности. Экзогенное введение функционально незрелых ДК сопровождается длительным и стабильным выживанием аллогенного трансплантата у различных животных моделей [40]. Механизм, посредством которого осуществляется создание иммунологической толерантности, состоит в прямом и непрямом (через цитокины) воздействии ДК на Т-клетки, а также в стимулировании функционирования и развития регуляторных CD4⁺CD25⁺Foxp32⁺-T-KneTOK [28].

В настоящее время проходит I фаза клинического исследования у взрослых больных СД 1 -го типа с длительностью заболевания более 5 лет. ДК получают in vitro из аутологичных лейкоцитов и добавляют к ним олигодиоксинуклеотиды (AS-ODN). Такие ДК экспрессируют очень малое количество котимуляторных молекул CD80/ CD86, их вводят пациентам внутрикожно в область проксимальнее поджелудочной железы с целью добиться миграции введенных ДК в ближайшие к поджелудочной железе лимфатические узлы. В лимфатических узлах происходит взаимодействие этих ДК с аутоантигенами и затем с Т-клетками. Недостаток ’’второго сигнала" приведет к снижению активности аутореактивных и формированию регуляторных Т-клеток.

Использование ДК до манифестации или сразу после нее должно значительно усилить эффект от их применения, что будет сопровождаться значительно лучшим результатом. Такое исследование планируется сразу после окончания 1-й фазы проходящего в настоящее время, которое должно показать безопасность применения аутологичных ДК у людей.

Заключение

Первые клинические результаты применения некоторых ИТП обнадеживают. Положительные результаты отмечены для анти-СЭЗ МКАТ, DiaPep277 и GAD65 (DIAM YD®). Однако ни у кого из пациентов в этих исследованиях не была достигнута эугликемия и толерантность к р-клеткам. Еще рано говорить о широком применении данных препаратов, необходимо дождаться окончания проводимых в настоящее время исследований на больших группах больных СД, оценить эффективность и выявить возможные побочные эффекты в течение более длительного периода времени.

Существуют два основных направления в поиске новых 14ТП: антигенспецифичная и антигеннеспецифичная терапия. Преимущества антигенспецифичной терапии состоят в локальности ее воздействия, с минимумом или полным отсутствием побочных эффектов, а эффект от такого лечения должен быть длительным и не требовать повторных введений. Однако надо помнить, что не все аутоантигены одинаково эффективны. Нельзя исключать возможность того, что они могут приводить к прогрессированию СД, как в случае с рассеянным склерозом [5]. К сожалению, среди всех апробированных аутоантигенов лишь только рекомбинантный GAD65 (DI- AMYD®) у пациентов с LADA и пероральный инсулин в группе больных с высоким титром LAA оказались эффективными. Тем не менее ученые не оставляют попыток найти эффективные методы антигенспецифичной терапии, о чем свидетельствуют продолжающиеся исследования в этом направлении. В таком случае, казалось бы, перспективней должны выглядеть методы антигеннеспе- цифичной терапии. Однако они имеют свои недостатки, основной из которых — побочные эффекты.

Также существенным является вопрос о времени начала иммунотерапии. С одной стороны, чем раньше будет начато лечение СД, тем выше вероятность успеха. Для решения этой задачи в настоящее время имеются мощные средства: исследование генетических HLA-мар- керов, антител к р-клеткам, исследование секреции инсулина и толерантности к глюкозе. Дополнением к этому будет служить идентификация новых аутоантигенов, участвующих в аутоиммунном процессе, например ZnT8(Slc30A8), который обнаруживается у 26% больных СД 1-го типа, негативных по IAA, GAD, ICA и IA-2 [40]. С другой стороны, иммунотерапия после манифестации СД связана с более оправданным риском вмешательства и меньшей длительностью иммунотерапии, с быстрым получением результата.

Далеко не все проведенные иммунотерапевтические вмешательства были эффективны. Использование широкого спектра ИТП отчасти связано с недостаточно ясным пониманием в настоящее время как самого патогенетического механизма аутоиммунного поражения р-клеток, так и факторов, провоцирующих и предрасполагающих к этому. СД 1-го типа — Т-клеточноопосредованное тканеспецифичное аутоиммунное заболевание, основным патогенетическим звеном которого является возникновение аутоагрессивных Т-клеток. В-клетки также играют роль в аутоиммунном процессе, однако их значение в нем до конца не ясно [6]. Появление АТ к р-клеткам не всегда связано с развитием СД l-го типа, а отсутствие иерархии в появлении аутоантител свидетельствует либо о том, что инициализирующий антиген еще не известен, либо о том, что существует множество путей развития и различных форм СД 1-го типа в зависимости от иммунологической перспективы. Комплексность развития заболевания может быть дополнена независимыми этиологическими событиями, запущенными различными внешними факторами. Результаты завершенных к настоящему времени иммунотерапевтических исследований при СД также свидетельствуют в пользу достаточно гибкого и полиморфного иммунопатологического процесса, лежащего в основе аутоиммунного поражения при СД. Такие иммунотерапевтические вмешательства, как DiaPep277, GAD65 и др., оказываются эффективными не у всех больных: например, применение инсулина с профилактической целью оказалось эффективным только в группе высокого риска по развитию СД с высоким титром IAA. Таким образом, дальнейшее продвижение в понимании аутоиммунного процесса при СД, очевидно, будет способствовать появлению и внедрению других — новых и более эффективных ИТП.