Идентификация генетических маркеров, сцепленных с сахарным диабетом типа 1

Для картирования областей сцепления с сахарным диабетом (СД) типа 1 обследовали 2 группы семей русских жителей Москвы и Самары с конкордантными (33 семьи) и дискор- дантными (65 семей) парами сибсов. Для анализа сцепления с СД типа 1 гена CTLA4, кодирующего один из поверхностных антигенов Т-лимфоцитов и расположенного в локусе ID DM 12 (2q32. l-q33), использовали полиморфный микросателлит (АТ)п в 3'-нетранслируемой области этого гена и полиморфный мононуклеотидный полиморфизм в положении 49 экзона 1 (A49G). Дгя обоих полиморфных маркеров показано сильное сцепление с СД типа 1. Таким образом, можно сделать вывод о том, что данная область хромосомы 2, содержащая локус IDDM12, сильно сцеплена с СД типа 1 и в русской популяции. При анализе сцепления нескольких групп полиморфных маркеров, расположенных в локусах 1DDM8 (6q25-q27), 1DDM9 (3q21-q25) и IDDM 10 (Юр 12.2), для некоторых из использованных маркеров показано сильное сцепление с СД типа 1, что позволяет сделать вывод о том, что данные локусы сцеплены с СД типа 1 и в русской популяции. При комплексном анализе ассоциации и сцепления с СД типа 1 ряда полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 11р 13, с использованием групп случай/ контроль и 2 групп семей обнаружен новый локус сцепления с СДтипа 1, расположенный около гена каталазы (CAT), для которого предложено обозначение IDDM 16. Two groups of Russian families in Moscow and Samara with concordant (33 families) and discordant sibs pairs (65families) were examined for mapping type 1 diabetes mellitus (DM1) coupling domains. Polymorphic microsatellite (AT)n in the 3’- nontranslated domain of gene CTLA4, coding for one ofT lymphocyte surface antigens and situated in locus IDDM 12 (2q32. l-q33), and polymorphic mononucleotide polymorphism in exon 1 position 49 (A49G) were used for analysis of this gene coupling with DM1. Strong coupling with DM1 was shown for both polymorphic markers. We therefore conclude that this region of chromosome 2, containing locus IDDM 12, is strongly coupled with DM1 and in the Russian population. Analysis of coupling of several groups ofpolymorphic markers located in lo- cuses IDDM8 (6q25-q27), IDDM9 (3q21-q25), and IDDM 10 (I Op 12.2) showed strong coupling of some of the markers with DM1, which means that these locuses are coupled with DM1 and in the Russian population. Complex analysis of association and coupling of polymorphic markers located in 1 lp 13 chromosomal region with DM 1, using the accident/control groups and 2 groups of families, showed a new locus of coupling with DMq, located near the catalase gene (CA T), which is suggested to be denoted as IDDM 16. Сахарный диабет (СД) типа 1 - одно из наиболее серьезных эндокринных заболеваний человека. Для него характерно прогрессирующее разрушение р-клеток поджелудочной железы, ответственных за синтез инсулина в организме человека. СД типа 1 относится к полигонным, многофакторным заболеваниям. В отличие от моногенных синдромов, сочетающихся с различными нарушениями углеводного обмена, при аутоиммунном СД типа 1 причина заболевания лежит не в мутациях отдельных генов. Генетическая предрасположенность к СД типа 1 связана с наследованием определенных аллелей обычных "здоровых" генов. Иногда эти аллели, которые определяют предрасположенность к СД типа 1 и сцеплены с заболеванием, называют этиологическими мутациями или вариантами. Большинство этиологических вариантов широко распространены в популяциях, но наличие у индивида какой-либо этиологической мутации само по себе не приводит к развитию СД типа 1. Только наличие определенной комбинации этиологических вариантов в генах, предрасполагающих к заболеванию, потенциально может приводить к физиологическим нарушениям, находящим свое вы данное исследование финансировалось Федеральной программой РФ "Сахарный диабет" и подпрограммой "Геном человека" Государственной научно-технической программы РФ. ражение в развитии СД типа 1. Однако даже такая наследственная отягошенность сама по себе недостаточна для развития СД типа 1. У генетически предрасположенных индивидов СД типа 1 развивается только вследствие взаимодействия между не изученными до конца генетическими факторами и совсем не известными факторами внешней среды. В настоящее время для выявления локусов, содержащих гены, предрасполагающие к СД типа 1, используется подход, основанный на анализе наследования аллелей полиморфных маркеров в ядерных семьях с двумя сибсами, больными СД типа 1 (семьи с конкордантными сибсами). Несмотря на трудности при подборе семей, несколько групп исследователей провели изучение сцепления большого числа полиморфных локусов генома человека с СД типа 1. Дополняющий подход основан на использовании полных семей с дискордантными сибсами. В первой работе по полному геномному поиску, направленной на выявление локусов, предрасполагающих к развитию СД типа 1, использовали коллекцию из 96 ядерных семей (Великобритания) и панель из 290 высокополиморфных микросател- литных маркеров, более или менее равномерно расположенных на всех хромосомах человека. Это исследование позволило обнаружить в геноме человека 18 локусов возможной предрасположенности к СД типа 1 на разных хромосомах |5]. Параллельно был проведен еще один геномный поиск, при котором удалось найти область сцепления с СД типа 1 на хромосоме 11 [6]. Несколько позже с использованием большего количества семей было проведено еще 2 полных геномных поиска "второго поколения" [4, 9] и 1 частичный поиск [7], что позволило уточнить положение ряда ранее обнаруженных локусов и выявить дополнительные локусы сцепления с СД типа 1. Данные обо всех потенциальных локусах предрасположенности к СД типа 1 суммированы в табл. 1. Часть из потенциальных локусов сцепления с СД типа 1 была обнаружена только с использованием подхода ген-кандидат. К ним относятся локус 1DDM18 (ген IL12B) и гены CD4 и NOS2. Целью настоящего исследования было изучение сцепления с СД типа 1 ряда полиморфных маркеров, расположенных в локусах IDDM8, IDDM9, 1DDM10 и IDDM 12 с использованием семей с конкордантными и дискордантными парами сибсов из русской популяции. Эти локусы были выбраны потому, что именно для этих локусов было показано сильное сцепление с СД типа 1 в семьях из популяций Великобритании и США [4, 5, 9]. Кроме того, нами проведено изучение сцепления области хромосомы 11 р 13 рядом с геном каталазы (CAT) с СД типа 1, для которой ранее была показана ассоциация с СД типа 1 с использованием подхода, основанного на сравнении частот аллелей в группах здоровых индивидов и пациентов с СД типа 1 [2|. Материалы и методы Пациенты. Обследовали 2 группы ядерных семей русских жителей Москвы и Самары с конкордантными (33 семьи) и дискордантными (65 семей) парами сибсов. Выделение ДНК и идентификация аллелей полиморфных маркеров. Геномную ДНК выделяли из крови пациентов методом экстракции фенолом и хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в 0,1% растворе SDS [8]. Термостабильная ДНК-полимераза Taq получена от фирмы "Ферментас" (Вильнюс, Литва), протеиназа К - от фирмы "Merck" (Германия). Синтез использованных в работе олигонуклеотидных праймеров выполнен ЗАО "Синтол" (Москва). Последовательности праймеров рассчитывали с использованием программы "Олиго" на основании известных нуклеотидных последовательностей. ДНК амплифицировали методом ПЦР на термоциклерах РНС-2 ("Techne", Великобритания) и "Терцик" (Россия) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей буфер 1, 0,2 мМ каждого dNTP, по 10 пмолей каждого из праймеров, 100-200 нг геномной ДНК и 1,0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Буфер 1 содержал 67 мМ трис-НС! (pH 8,8), 16,6 мМ сульфата аммония и 0,1% твин-20. Концентрация хлорида магния зависела от амплифицируемого локуса. В реакционную смесь вносили ДМСО в конечной концентрации 10%. На начальной стадии ПЦР денатурировали ДНК при 94°С в течение 3 мин, на конечной - проводили синтез второй цепи при 72°С в течение 7 мин. В промежутке между данными стадиями Табл и ца I Значения X, и MLS, полученные на европейских семьях из Великобритании, для локусов, определяющих генетическую предрасположенность к СД типа 1 [5, 9] Локус Ген-кандидат Хромосомная локализация X 1 MLS 1DDMI МНС 6q21,3 2,60 34 IDDM2 INS 11р15,5 1,29 2,8 IDDM3 - 15q26 -■ 2.5“ IDDM4 LRP5 Ilql3 1,07 2,5 IDDM5 - 6q25 1,15 4,5“ 1DDM6 DCC 18q 1,10 3,2 IDDM7 - 2q31 1,13 1,5 IDDM8 - 6q27 1,17 3,4“ IDDM9 - 3q21-25 1,26 2,4 IDDM10 - 10pll.2 1,56 4,7 IDDM 11 - 14q24-q31 - 4,0“ 1DDM12 CTLA4 2q33 1,61 3,4“ IDDM13 - 2q33 1,60 3,3“ IDDM15 TN DM 6q2l 1,34 4,2“ 1DDM17 AIRE1 21q22,3 - - IDDMI8 ILI2B 5q31 -q33 - - DXS1068 - Xpll,4-p21,l - - GCK GCK 7p - - NOS2 NOS2 I7ql 1,2 - - CD4 CD4 12pl2-pter - - Примечание, а - значения MLS получены другими группами исследователей [4, 6-7]. \ - уровень семейной ассоциации с СД типа 1 (degree of familial clustering of type I diabetes mellitus). Для европейских популяций суммарное значение А, для всех локусов, определяющих предрасположенность к СД типа 1. равно 15. осуществляли 25-35 циклов ПЦР в зависимости от маркера и количества исходной ДНК по трехступенчатой программе, включающей в себя денатурацию ДНК (94°С/1 мин), отжиг праймеров в течение 1 мин и синтез второй цепи (72°С/1 мин). Статистический анализ. Анализ наследования аллелей полиморфных маркеров в конкордантных и дискордантных семьях проводили с использованием объединенного теста TDT (Transmission Dis- equlibrium Test) [11] и S-TDT (Sib Transmission Dis- equlibrium Test) [12]. Результаты и их обсуждение Для картирования областей сцепления с СД типа 1 обследовали 2 группы семей русских жителей Москвы и Самары, с конкордантными (33 семьи) и дискордантными (65 семьи) парами сибсов. Анализ сцепления с СД типа 1 в русской популяции был проведен на 5 районах хромосом 2, 3, 6, 10 и 11. При анализе сцепления области 2q33 с СД типа 1 использовали два полиморфных маркера. Один из них представляет собой микросателлит (АТ)п, который расположен в З’-нетранслируемой области гена CTLA4 [10]. Другой полиморфный маркер расположен внутри кодирующей области гена CTLA4 и представляет собой мононуклеотидный полиморфизм в положении 49 экзона 1 (A49G), которому соответствует аминокислотный полиморфизм Thrl7Ala, расположенный в лидерном пептиде антигена CTLA-4 [10]. В настоящее время ген Таблица 2 Значения MLS и Z’, полученные с использованием конкордантных и дискордантных семей и 2 полиморфных маркеров гена CTLA4, расположенного в локусе IDDM 12 на хромосоме 2q33 Полиморфный маркер Тип полиморфизма Число алле- лей Конкордантные семьи Дискордантные семьи MLS х2 Z’ Р Ala 17Thr SNP 2 4,11 15,68 4,07 < 0,0001 (AT)n STR 17 3,84 15,70 3,96 < 0,0001 Таблица 4 Значения MLS и Z’, полученные с использованием конкордантных и дискордантных семей и 3 полиморфных маркеров, расположенных в локусе IDDM8 на хромосоме 6q25-q27 Полиморфный маркер Тип полиморфизма Число аллелей Конкордантные семьи Дискордантные семьи MLS X2 Z’ р А1а(-9)Val SNP 2 2,06 8,70 2.25 0,003 D6S503 STR 4 0,81 3,00 0,93 NS CTLA4, кодирующий один из поверхностных антигенов цитотоксических Т-лимфоцитов, является одним из наиболее вероятных генов-кандидатов, определяющих предрасположенность к СД типа 1. Обследование как конкордантных, так и дискордантных семей позволило установить, что оба полиморфных маркера гена CTLA4 сцеплены с СД типа 1 в русской популяции (табл. 2). Величины MLS, рассчитанные с использованием конкордантных семей, достигают значений 4,11 в случае маркера Thrl7Ala и 3,84 в случае полиморфного микросателлита, а величины Z’, рассчитанные с использованием дискордантных семей, составляют 4,07 и 3,98 соответственно, что позволяет сделать вывод о том, что данная область хромосомы 2, содержащая локус IDDM12 и ген CTLA4, определяет предрасположенность к СД типа 1 и в русской популяции. При анализе сцепления локуса 1DDM9 с СД типа 1 использовали 2 полиморфных микросателлита D3S1769 и D3S4015. Данный локус расположен на хромосоме 3 (3q21- q25), и величины MLS и Z’, рассчитанные с использованием обеих групп семей, приведены в табл. 3. Эти значения находятся в интервале 1,73-2,19, что позволяет сделать вывод о том, что оба маркера сцеплены с СД типа 1 в русской популяции. При анализе сцепления с СД типа 1 локуса IDDM8, расположенного на хромосоме 6 (6q25- q27), использовали 2 полиморфных маркера: микросателлит D6S503 и мононуклеотидный полиморфизм С1183Т в гене SOD2, который кодирует су- пероксиддисмутазу митохондрий, зависимую от ионов Мп2+. Полиморфизму С1183Т соответствует аминокислотный полиморфизм: остатки аланина или валина в положении 9 сигнального пептида - Ala(-9)Val [3]. Величины MLS и Z’, рассчитанные с использованием обеих групп семей для этих маркеров, приведены в табл. 4. Для 1 из 2 использованных маркеров (Ala(-9)Val) обнаружено сцепление с СД типа 1. Таблица 3 Значения MLS и Z’, полученные с использованием конкордантных и дискордантных семей и двух полиморфных маркеров, расположенных в локусе IDDM9 на хромосоме 3q21-25 Полиморфный маркер Тип полиморфизма Число алле- лей Конкордантные семьи Дискордантные семьи MLS X2 Z’ Р D3S1769 STR 7 1,73 4,36 2,06 0,02 D3S4015 STR 6 1,91 4,91 2,19 0,01 Для анализа сцепления с СД типа 1 локуса 1DDM10, расположенного на хромосоме 10 (10р12.2), использовали 4 полиморфных микросателлита, обозначения которых, а также величины MLS и Z’, рассчитанные с использованием обеих групп семей для всех этих маркеров, приведены в табл. 5. Выраженное сцепление было показано для 2 полиморфных маркеров (D10S1243 и D10S2326), расположенных в данной области хромосомы 10. Для проверки предположения о том, что ген CAT может быть ассоциирован с развитием диабетической нефропатии (ДН) при СД типа 1, нами были разработаны полиморфные микросателлиты D11S907 и D11S2008, расположенные рядом с этим геном [1, 2]. Однако при анализе ассоциации этих полиморфных микросателлитов с ДН при СД типа 1 с использованием групп случай/контроль мы обнаружили ассоциацию этих полиморфных маркеров не с ДН, а с собственно СД типа 1. В связи с этим нами был разработан полиморфный мононуклеотидный маркер С1167Т, расположенный внутри кодирующей последовательности гена CAT, анализ ассоциации которого подтвердил, что данная область хромосомы 11 ассоциирована с СД типа 1 [2]. Для проверки полученных данных мы использовали полиморфные микросателлиты D11S2008, D11S1392 и D11S1977, расположенные рядом с геном CAT, и маркер С1167Т внутри этого гена, а также коллекцию конкордантных и дискордантных семей (табл. 6). Анализ полученных данных показал, что из 4 использованных маркеров 3 полиморфных маркера выраженно сцеплены с СД типа 1 в русской популяции (см. табл. 6). Наибольшие величины MLS и Z’ получены в случае маркера D11S2008 и составляют 4,93 и 5,62 соответственно, что позволяет сделать вывод о сильном сцеплении данной области хромосомы 11р13, расположенной рядом с геном CAT, с СД типа 1 в русской попу- Таблица 5 Значения MLS и Z’ полученные с использованием конкордантных и дискордантных семей и 4 полиморфных маркеров, расположенных в локусе 1DDM10 на хромосоме 10р11.2 Полиморфный маркер Тип полиморфизма Число аллелей Конкордантные семьи Дискордантные семьи MLS г Z’ Р D10S1243 STR 15 3,20 15,12 3,83 <0,0001 D10S507 STR 6 1,06 2,44 1,49 NS D10S2326 STR 12 1,62 5,40 2,07 0,02 D10S1426 STR 7 0,97 2,69 149 NS Таблица 6 Значения MLS и Z’, полученные с использованием конкордантных и дискордантных семей и 4 полиморфных маркеров, расположенных рядом с геном CAT и внутри него, на хромосоме Ир 13 Полиморфный маркер Тип полиморфизма Число аллелей Конкордантные семьи Дискордантные семьи MLS X2 Z’ р Cl 167Т SNP 2 3,50 11,95 3,37 <0,0001 D11S1392 STR 6 3,71 16,13 4,02 <0,0001 D1IS1977 STR 5 0,93 3,00 1,44 NS D11S2OO8 STR 5 4,93 31,1 5,62 <0,0001 ляции. На основании полученных в данном исследовании данных можно сделать вывод о том, что нами обнаружен новый локус сцепления с СД типа 1, для которого предложено обозначение IDDM16. Выводы 1. Проведено картирование областей сцепления с СД типа 1 на хромосомах 2, 3, 6, 10 и 11 с использованием 2 групп семей, собранных среди русских жителей Москвы и Самары, с конкордантными (33 семьи) и дискордантными (65 семей) парами сибсов. 2. Обнаружено, что в русской популяции Москвы и Самары полиморфные маркеры, расположенные в локусах IDDM8, 1DDM9, IDDM 10 и IDDM12, сцеплены с СД типа 1. 3. На хромосоме 11р13 обнаружено сильное сцепление 3 полиморфных маркеров, расположенных рядом с геном CAT, с СД типа 1, что расценивается как новый локус сцепления с СД типа 1, для второго предложено обозначение IDDM 16.