Показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных сахарным диабетом на ранних этапах его развития; опыт лечения иммуносупрессантом азатиоприном

Общеизвестна концепция аутоиммунного механизма развития сахарного диабета I типа (ИЗСД), а также конкретная роль различных звеньев иммунной системы в процессе агрессии против (-клеток поджелудочной железы и как следствие их гибели — дефицит инсулина — мощный шлейф гормонально-метаболических нарушений [4, 5], которые со временем приводят к нарушению практически всех функциональных систем организма. Аутоиммунные процессы носят генерализованный характер, что подтверждено высокой частотой определяемости аутоантител не только к (J-клеткам, но и к антигенам многих органов больного ИЗСД. Поэтому совершенно реальным представляется допущение инициальной роли аутоиммунной агрессии в формировании поздних диабетических осложнений и прежде всего микро- и макроангиопатии, особенно поражения микроциркуляторного русла — основного поля действия иммунокомпетентных клеток, места перехода лимфоидных клеток и гранулоцитов в интерстиций сосудов [6]. В основе развития микроангиопатии лежат не только метаболические нарушения, но и глубокие изменения со стороны иммунологического «надзора» организма, в частности установлены прямая связь с системой гистосовместимости, дефект Т-супрессоров, появление клонов Т-киллеров и Т-хелперов, ■ включение цитолитических процессов через комплемент и т. д. [7,     12,                                                                                      14].

Определяющую роль преимущественного поражения тех или иных органов и тканей, возможно, играют генетические структуры, в частности антигены главного комплекса гистосовместимости человека, локализованного на коротком' плече 6-й хромосомы. Вероятно, высокая степень поражения сосудов сетчатки и почек у больных сахарным диабетом I типа обусловлена и интенсивностью кровотока в этих органах. Поэтому в последнее время наряду с обычной лечебной тактикой ведения больных ИЗСД — оптимальная компенсация дефицита инсулина и коррекция гормонально-метаболических нарушений — ведется поиск средств, направленных на подавление аутоиммунной агрессии, на нормализацию ключевых звеньев иммунной системы [8, 10, 13, 15].

При использовании иммуносупрессоров в комплексной терапии ИЗСД получены обнадеживающие результаты: снижение титра антител к антигенам (-клеток (в острую фазу распада), повышение функциональных резервов оставшегося пула (-^ле^ток, снижение дозы инсулина вплоть до полной его отмены и др.

В настоящей статье обобщен наш первый опыт лечения больных ИЗСД иммуносупрессан- том азатиоприном. В качестве органа-мишени для изучения была взята почка.

Материалы и методы

Обследовано 40 больных сахарным диабетом I типа с длительностью диагностированного заболевания от 1до 12 мес, в том числе 22 женщины и 18 мужчин в возрасте от 16 до 32 лет. Исследование проводилось в условиях компенсации заболевания. Критериями компенсации служили уровень гликемии натощак до 8 ммоль/л, через 2 ч после приема пищи до 11 ммоль/л, средняя амплитуда гликемических колебаний не превышала 5,5 ммоль/л, суточная глюкозурия, не превышающая 5 % сахарной ценности пищи, отсутствие кетоновых тел в моче, нормолипидемия. Всем больным проводилась интенсифицированная инсулинотерапия посредством применения инъекторов типа «Новопен» и «Пливапен» препаратами инсулина человека. Адекватность дозы получаемой больным инсулинотерапии определялась с помощью расчета требуемой дозы с учетом остаточной функции поджелудочной железы (С-пептид) [1|. Таким образом, больные были обследованы в условиях, исключающих передозировку инсулина. Все обследованные больные не имели клинических признаков осложнений диабета. Контрольную группу составили 50 здоровых лиц, проживающих в Москве, сходных по возрасту и полу с обследованными больными ИЗСД.

Всем больным было проведено общеклиническое обследование. Субпопуляции лимфоцитов (LT1, LT4, LT8, DR, CD21) определяли методом проточной цитометрии. В основе метода лежит выявление на поверхности иммунокомпетентных клеток специфических рецепторов (кластеров дифференцировки) с помощью моноклональных антител. Фагоцитарное звено иммунитета (фагоцитарный индекс, фагоцитарное число) определяли с помощью St 883. Иммуноглобулины классов М, G, А определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле с использованием моноспецифнче- ских сывороток.

HLA-типирование проводили стандартным методом компле- ментзависимой цитотоксичности с использованием набора гистотипирующих сывороток производства «Behring Institute» и Санкт-Петербургского НИИ гематологии и переливания крови.

Уровень пяти первых компонентов комплемента и общую активность классического пути определяли на микропанелях методом половинного лизиса эритроцитов барана, используя реагенты производства «Реком» Вятского НИИ гематологии и переливания крови.

Уровень С-пептида изучали радиоиммунологическим методом с использованием стандартных тест наборов Минского завода эндокринных препаратов.

Для морфологического исследования ткань почек была получена с помощью прижизненной чрескожной пункционной биопсии органа. Для световой микроскопии ткань почки окрашивали гематоксилином и эозином, азаном, толуидиновым синим, конго красным и по Ван Гизону. Для проведения электронной микроскопии ткани почек материал фиксировали в жидкости Карновекого. Полутонкие срезы окра-

Таблица 1

Распределение антигенов HLA-системы у больных ИЗСД длительностью до 1 года с разными показателями клеточного иммунитета

Примечание. Достоверность показателя в сравнении с контролем одна звездочка — р<0,05, две — р<0,01, три звездочки — достоверность различий между 1-й и 2-й группами р<0,05.

шивали метиленовым синим — азуром П-фуксином, ультра- тонкие срезы окрашивали уранилацетатом и нитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в электронном микроскопе ЕМ-410 фирмы «Филипс» (Голландия). Для проведения электронно-микроскопической иммуногистохимии ткани почки материал замораживали в жидком азоте при —156 °C, готовили криостатные срезы толщиной 14 мкм, обрабатывали антисыворотками к иммуноглобулинам А, М, G, компонентам СЗ и С9 комплемента, антигенам DR, инсулину; далее срезы фиксировали в тетраоксиде осмия и готовили биопта- ты для электронной микроскопии по обычной методике, просматривали в электронном микроскопе ЕС-410 фирмы «Филипс» (Голландия).

Статистическую обработку материала проводили на копью- тере IBM с использованием программ «Microstat» и «Statgraph».

Результаты и их обсуждение

При анализе субпопуляций лимфоцитов в крови больных ИЗСД с длительностью заболевания до 1 года обнаружены сдвиги в сторону активации иммунной системы. Содержание Т-лимфоцитов у больных было значительно выше контрольного значения (84+4 и 70+5 % соответственно; р<0,05); абсолютное количество Т-лимфоцитов составило (3,6+0,18) • 10⁹/л и (2,0+0,15) • 10⁹/л соответственно (р<0,05). Распределение субпопуляций Т-лимфоцитов было сдвинуто в сторону Т-хелперов-индукторов и соотношение Т-хелперы- индукторы/Т-супрессоры-цитотоксические равнялось 2,7+0,7 у больных и 1,5+0,7 в контрольной группе (р<0,05). Содержание В-лимфоцитов несущественно превышало контрольные значения: 17,3+3 % у больных и 12+2 % в контроле, абсолютное количество (О,67±О,7) • 10⁹/л и (0,45±0,04) • 10⁹/л соответственно (р<0,05). Количество клеток, несущих HLA-DR-рецепторы (В-лимфоциты, активированные Т-лимфоциты, моноциты, макрофаги), достоверно превышало таковое у здоровых людей (14±4 и 7+2 %, (0,56±0,04) • 10⁹/л и (0,30±0,02) • 10⁹/л соответственно; р<0,05). Показатели фагоцитоза на ранней стадии заболевания не отличались от группы контроля: фагоцитарный индекс 92±4 и 85±10 соответственно (р>0,05), фагоцитарное число 9+3 и 10+2 соответственно (р>0,05).

Изучение гуморального иммунитета по трем основным классам иммуноглобулинов А, М, G выявило характерную динамику их изменений: на ранних сроках заболевания оказалась достоверно повышенной концентрация IgG (2500+ ±65 мг%, в контроле 1200+37 мг%; р< <0,01) и IgM (775+77 мг%, в контроле 482+11 мг%; р<0,01) при менее значимом повышении концентрации IgA (351 + 17 мг%, в контроле 300± 17 мг%; р<0,05).

Таким o6pa3OM_s на ранних этапах развития сахарного диабета (до 1 года) обнаружены дисбаланс между Т- и В-клеточными составляющими иммунитета и особо выраженные изменения в его гуморальном звене.

Общепризнанная концепция ассоциации антигенов системы HLA с развитием ИЗСД и его осложнений учитывает многообразие ее функций, включая механизмы двойного распознавания, межклеточного взаимодействия и т. д. Широко известны корреляции антигенов различных классов HLA-системы со степенью риска заболевания диабетом, определена ведущая роль антигенов II класса в развитии ИЗСД и его осложнений. Полагают, что повышенная экспрессия HLA-антигенов I класса (В8, В15, В18) вторична к повышению экспрессии HLA-DR3- и HLA-DR4- антигенов как неравновесное сцепление между ними [11].

Нами предпринята попытка выявить ассоциацию антигенов I и II классов HLA со степенью изменений клеточного звена иммунитета, что позволило бы определить зависимость активации иммунных реакций от генетических маркеров. Критерием степени выраженности изменений в иммунном статусе выбран процент отклонения от контрольных величин показателей клеточного иммунитета: значительные отклонения — более 10 %, малые изменения — 3—5 % в сторону как повышения, так и снижения. Таким образом, были сформированы две группы больных: 1-я группа — со значительными отклонениями (п=30), 2-я группа — с малыми изменениями (и=10), в том числе 4 больных с умеренно сниженными показателями клеточного иммунитета. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Кроме известной уже гиперэкспрессии антигенов HLA А9,      В8,         В15,       В18, DR3, DR4,

ассоцированной с сахарным диабетом I типа, наше исследование показало прямую зависимость степени иммунологических изменений от экспрессии антигенов HLA А9, наиболее выраженной для HLA DR3 и DR4. В группе больных со значительными иммунными отклонениями (1-я группа) частота экспрессии указанных антигенов достоверно выше, чем в группе больных с малыми иммунными изменениями (2-я группа). Таким образом, HLA-антигены DR3 и DR4 могут служить генетическими маркерами возможной активации иммунной системы.

При исследовании титров С1—С5-компонентов и общей активности классического пути активации комплемента в сыворотке крови больных отмечено достоверное повышение титра С1- компонента комплемента в сравнении с группой контроля. По остальным компонентам достоверных различий в группах больных и здоровых не было. Однако у 4 больных был отмечен исходно низкий их уровень, что в дальнейшем нами было использовано при решении вопроса о назначении иммуносупрессивной терапии.

Таким образом, исследование показало, что при ИЗСД имеют место иммунологические факторы, которые могут способствовать повреждению компонентов сосудистой стенки в процессе адгезии и проникновения иммунореактивных клеток в ин- терстиций и мезангиум с последующим формированием характерных диабетических микрососу- дистых изменений. Это дисбаланс Т- и В-кле- точного иммунитета, активация гуморального звена иммунитета, острая фаза активации комплемента, а также гиперэкспрессия HLA-антигенов I и II классов. Каково же значение этих факторов воздействия непосредственно на уровне стенки микрососудов?

С целью определения роли обнаруженных изменений в процессе формирования микроангиопатии на ранней стадии заболевания, в частности диабетической нефропатии, была произведена пункционная биопсия почки 6 больным с длительностью ИЗСД от 2 до 12 мес без микроальбуминурии. Данные световой и электронной микроскопии показали различную степень повреждения нефрона: от минимальных изменений, носящих неспецифический характер, до картины начинающегося диабетического гломерулосклероза [2]. Иммунный механизм поражения почек на доклинической стадии формирования диабетической нефропатии был подтвержден им- мунофлюоресцентным свечением IgG, IgM, реже IgA, СЗ- и С9-компонентов комплемента вдоль базальной мембраны капилляров клубочка оча- гово-грануляторного и линейного характера при электронном иммуногистохимическом исследовании биоптатов. К. Ina и соавт. [9] на экспериментальных животных показали, что гиалиноз афферентной артериолы является ранним проявлением диабетической нефропатии. В нашем исследовании гиалиноз афферентной артериолы был обнаружен у больных без микроальбуминурии. Электронно-микроскопическое исследование показало, что гиалиновые массы аккумулируются в веществе базальной мембраны, при электронной иммуногистохимии была обнаружена положительная реакция на IgM и IgG. Нами также отмечена корреляция высокого содержания IgM и IgG в сыворотке крови с отложением этих же классов иммуноглобулинов вдоль базальной мембраны на ранних стадиях заболевания. При электронно-микроскопическом исследовании биоптатов почек на доклинической стадии были найдены макрофагальная и лейкоцитарная инфильтрация интерстиция, нейтрофилы, макрофаги и тромбоциты в просвете капилляров клубочка, субэндотелиальные и мезангиальные отложения иммунных комплексов. Эти находки свидетельствуют об активности местных иммунных реакций, перераспределении и переходе клеток иммунитета в интерстиций сосудов и мезангий и позволяют предположить их ведущую роль в развитии последующих структурных нарушений с исходом в диабетический узелковый гломерулосклероз. Уместно будет упомянуть об усилении влияния местной гипертензии на активацию миграции гранулоцитов и лимфоцитов в интерстиций и мезангий, что в условиях гиперфильтрации и повышения внутриклубочкового давления усугубляет этот процесс.

При электронной иммуногистохимии с инсулиновыми антисыворотками в субэндотелиальных и мезангиальных отложениях иммунных комплексов была выявлена положительная реакция. Не исключено, что этот инсулиноподобный эффект обусловлен иммунологически активными неферментативно гликозилированными структурами в условиях хронической гипергликемии, на реальность которого указывают ряд авторов [3]. Антигенная стимуляция, несомненно, усиливает переход клеток иммунной системы, в особенности в местах инвазии этого антигена [13]. На ранних стадиях заболевания условием дополнительной антигенной стимуляции может явиться хроническая гипергликемия, отсюда следует крайняя необходимость строгой коррекции углеводного обмена с самых первых дней клинической манифестации ИЗСД. Следующей волной дополнительной антигенной стимуляции становится инсулинотерапия, результатом которой может явиться отложение специфических инсулинсодержащих иммунных комплексов в стенках микрососудов. Эти данные позволяют сделать как минимум три практические рекомендации в тактике лечения ЙЗСД: 1) применение инсулинов человека; 2) использование интенсифицированной инсулинотерапии с преимущественным применением инсулинов короткого действия; 3) оптимальная коррекция углеводного обмена, исключающая передозировку инсулина.

Как видно из проведенного исследования, иммунные механизмы являются мощным фактором и в развитии диабетических осложнений, в частности диабетической нефропатии. При этом становится очевидной необходимость корректировать тактику лечения больных ИЗСД начиная с дебюта болезни. Наряду с оптималь-

Таблица 2

Клиническая характеристика больных, леченных азатиоприном в суточной дозе 2 мг на 1 кг массы тела

* Клиническая ремиссия продолжается до настоящего времени.

Таблица 3

Влияние иммуносупрессивной терапии азатиоприном в дозе 2 мг/кг в сутки на показатели клеточного иммунитета у больных вновь выявленным сахарным диабетом I типа (Af+m)

Примечание. Достоверность различий между показателями до лечения и через 2, 3, 4, 5, 6 мес лечения: одна звездочка — р<0,05, две — р<0,01.

ным режимом компенсации углеводного обмена (диета, физические нагрузки, интенсифицированная инсулинотерапия) целесообразно подключение средств воздействия на иммунную систему организма с самых ранних этапов развития заболевания.

Учитывая патогенетическое действие иммуно- супрессантов на клеточные иммунные реакции, выработку антител, образование иммунных комплексов, подавление продукции интерферона, мы начали использовать их в лечении впервые выявленного ИЗСД с 1985 г. В качестве им- муносупрессанта использовали азатиоприн. На фоне интенсифицированной инсулинотерапии с помощью шприц-ручек «Новопен» (Дания) и «Пливапен» (СФРЮ) по достижении компенсации нарушений углеводного обмена 16 больным с вновь выявленным ИЗСД назначали азатиоприн в суточной дозе 2 мг на 1 кг массы тела в два приема, начиная с 25 мг в сутки, постепенно увеличивая дозу под строгим ежедневным контролем элементов периферической крови. По достижении указанной терапевтической дозы лечение проводилось при еженедельном контроле количества лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов в периферической крови. При появлении у больного интеркуррентного заболевания (ОРВИ, грипп в нашем исследовании) в условиях проведения иммуносупрессивной терапии дозу препарата временно снижали до 50 мг в сутки. При такой тактике назначения азатиоприна только у 1 больного был отмечен побочный эффект в виде снижения уровня лейкоцитов до 4,0- 10⁹/л, нивелированный снижением дозы препарата с последующим введением больного на дозе 1,5 мг/кг в сутки. Длительность курса лечения 5—6 мес. Контрольную группу составили 13 больных вновь выявленным ИЗСД, получавших интенсифицированную инсулинотерапию посредством шприц-ручек «Новопен» и «Пливапен», сходных по полу, возрасту, длительности заболевания, показателям клеточного и гуморального иммунитета, комплементарному статусу с исследуемой группой больных. Из исследования были исключены больные с исходно сниженными показателями клеточного иммунитета и комплементарного статуса.

Клиническая характеристика и результаты иммуносупрессивной терапии представлены в табл. 2.

Полная (отмена инсулинотерапии) клиническая ремиссия была достигнута у 8 больных с сохраненной остаточной функцией р-клеток на 2-м и 3-м месяце приема препарата. Длительность ремиссии составила 36, 21, 5 и 4 мес (у этих 4 больных продолжается до настоящего времени), 7 мес (через 4 мес после окончания курса лечения у больной наступила беременность и мы сочли необходимым назначение дробной инсулинотерапии в суточной дозе 10—12 ЕД) и у 3 больных — 4 мес (самостоятельно прекратили прием препарата через 3 мес лечения по достижении признаков клинической ремиссии и в среднем через 1 мес была отмечена декомпенсация заболевания). У больных с развившейся клинической ремиссией было отмечено повышение уровня С-пептида до нормальных цифр на 3—5-м месяце иммуносупрессивной терапии. У больных с исходным нулевым уровнем С-пептида клиническая ремиссия не была достигнута. Однако уровень С-пептида на фоне приема азатиоприна повысился в среднем до 0,2±0,04 нг/мл, что позволило в ряде случаев уменьшить дозу вводимого инсулина. Необходимо отметить, что больные с развившейся ремиссией имели срок заболевания от 1 до 5 мес, а остальные — более 1 года, только 3 больных с длительностью ИЗСД до полугода не имели клинической ремиссии.

В контрольной группе из 13 больных спонтанная клиническая ремиссия развилась только у 1 больного с длительностью заболевания 2 мес, продолжительность ремиссии составила 3 мес (продолжается до настоящего времени), уровень С-пептида повысился с 0,5 до 1,1 нг/мл. У остальных больных контрольной группы выраженной динамики уровня С-пептида обнаружено не было.

Мы изучали влияние иммуносупрессивной терапии на показатели клеточного и гуморального иммунитета, комплементарного статуса. Результаты исследования представлены в табл. 3, которая демонстрирует достоверное снижение в процессе лечения исходно повышенных в сравнении с нормой показателей клеточного иммунитета (общего числа Т- и В-лимфоцитов, Т-хел- перов-индукторов, а также DR-несущих клеток). В группе контроля такая динамика не отмечена. Кроме того, на фоне лечения азатиоприном выявлена тенденция к снижению активности всех компонентов и общей активности классического пути активации комплемента преимущественно за счет С1- и С5-компонентов. В группе контроля эти показатели не изменялись при некотором повышении активности С4-компо- нента. При исследовании содержания в периферической крови иммуноглобулинов выявлено достоверное снижение содержания IgG и IgA.

Таким образом, наше исследование подтвердило эффективность применения иммуносупрессанта азатиоприна в лечении вновь выявленного ИЗСД, причем показана неоспоримая зависимость эффективности иммуносупрессии в достижении клинической ремиссии от длительности заболевания: чем короче период клинических симптомов и длительность заболевания, тем более вероятно развитие клинической ремиссии. Тактика кратковременного перевода на интенсифицированную инсулинотерапию в суточной дозе 10—16 ЕД в периоды психоэмоционального напряжения (например, экзаменационной сессии и т. п.) и при ин- теркуррентных заболеваниях (ОРВИ, грипп и т. п.) во время клинической ремиссии способствует пролонгированию последней. При назначении больным иммуносупрессивной терапии необходимо предварительное исследование ряда иммунологических показателей: общего числа Т- и В-лимфоцитов, количества Т-хелперов-индукторов, Т-супрессоров-цитотоксических, DR-несущих клеток, статуса комплемента, а также содержания иммуноглобулинов классов А, М, G в периферической крови. Противопоказанием к иммуносупрессии являются исходно сниженные их уровни. Проведенное мониторирование показателей клеточного, гуморального иммунитета, активности классического пути активации комплемента позволило нам косвенно судить и о пользе иммуносупрессии в коррекции иммунологических нарушений как факторов развития микрососуди- стых осложнений ИЗСД.

Выводы

1. Зависимость степени иммунологических изменений от экспрессии антигенов HLA-Ag наиболее выражена для HLA DR3 и DR4: в группе больных со значительными иммунными отклонениями частота экспрессии указанных антигенов достоверно выше, чем в группе больных с малыми иммунными изменениями.
2. На ранних этапах развития сахарного диабета обнаружены дисбаланс между Т- и В-кле- точными составляющими иммунитета, достоверное повышение титра Cl-компонента комплемента в сравнении с группой контроля.
3. Эффективность иммуносупрессивной терапии неоспоримо зависит от длительности заболевания: чем короче период клинических симптомов и длительность заболевания, тем вероятнее развитие клинической ремиссии.
4. В процессе лечения иммуносупрессантом азатиоприном отмечено достоверное снижение исходно повышенных в сравнении с нормой показателей клеточного иммунитета (общего числа Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов-индукторов, а также DR-несущих клеток), выявлена тенденция к снижению активности всех компонентов и общей активности классического пути активации комплемента преимущественно за счет С1 и С5 компонентов.
5. Мониторирование показателей клеточного, гуморального иммунитета, активности классического пути активации комплемента позволило косвенно судить и о пользе иммуносупрессии в коррекции иммунологических нарушений как факторов развития микрососудистых осложнений ИЗСД.