Возобновляющаяся гипогликемия и структура сосудистых сплетений боковых желудочков головного мозга крыс

ОБОСНОВАНИЕ

Возобновляющаяся гипогликемия (ВГ) возникает при инсулинотерапии сахарного диабета и является существенной причиной нарушений функций мозга у пациентов с сахарным диабетом (СД) 1-го и 2-го типов. При этом повторные эпизоды гипогликемии вызывают снижение контррегуляторного и вегетативного ответов, что ведет к нарушению распознавания пациентом гипогликемии и увеличивает риск развития последующих гипогликемий [1–5].

Мозг исключительно зависим от снабжения глюкозой. Гипогликемия приводит к нарушению функций нейронов, и в основе повреждения клеток мозга лежит глутаматная эксайтотоксичность [5–7].

Большое значение в обеспечении работы головного мозга имеет функционирование гематоликворного барьера и производство спинномозговой жидкости (СМЖ, ликвор). Основной объем СМЖ образуют сосудистые сплетения боковых желудочков (БЖ) головного мозга и глимфатическая система мозга [8][9]. Эпителиальные клетки сосудистых сплетений секретируют в ликвор множество метаболитов, нейротрофических и ангиогенных факторов и участвуют в процессах восстановления нейронов после травмы или инсульта. Повреждение сосудистых сплетений наблюдаются при различных патологических состояниях — менингите, ишемическом инсульте, гипоксии и при первичных нейродегенеративных расстройствах [9]. Роль сосудистых сплетений в развитии нарушений функций мозга при гипогликемии недостаточно изучена.

ЦЕЛЬ

Цель настоящей работы — определение структуры сосудистых сплетений боковых желудочков головного мозга крыс при возобновляющейся гипогликемии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования были 15 белых крыс линии Вистар массой 200–220 г, разделенных на 2 группы: 1-я группа — контроль (интактные животные) — 5 крыс, 2-я группа — животные, перенесшие серию гипогликемических состояний (ВГ) — 15 крыс.

Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Все эксперименты проведены в соответствии с отечественными нормативами и современными международными биоэтическими стандартами по работе с лабораторными животными; на эксперименты получено заключение локального этического комитета ЯГМУ, протокол №4 от 18.10.2016.

Перед опытом крысы были лишены пищи в течение 14–16 часов. Во все время эксперимента животные находились в состоянии свободного доступа к воде. Гипогликемические состояния вызывали внутримышечным введением инсулина (Actrapid MC, 40 ЕД/кг массы тела). Через 2–3 часа после инъекции инсулина у крыс наблюдалась связанная с гипогликемией неврологическая симптоматика: потеря постуральных рефлексов — достижение бокового положения без попыток поднять голову. При этом на протяжении эксперимента в каждый день опыта у пяти отдельных животных в состоянии гипогликемии определяли уровень глюкозы в крови из хвостовой вены, полученной после удаления небольшого участка хвоста, глюкозоксидазным методом (глюкоза-АГАТ). В условиях эксперимента уровень глюкозы в крови у крыс с гипогликемией составлял 1,4–1,8 ммоль/л.

Сразу после утраты постуральных рефлексов гипогликемическое состояние купировали введением 5 мл 40% раствора глюкозы в желудок через зонд. Эксперимент повторяли каждые 3 суток. Всего животные перенесли 9 гипогликемических состояний.

Крысы выводились из эксперимента во время последней гипогликемии путем декапитации. Головной мозг извлекали и переносили в фиксатор — 10% нейтральный формалин и заливали в гистомикс. Горизонтальные серийные срезы изготавливали на роторном микротоме (pfm Rotary 3003 — Rotation Microtome) толщиной 4–5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином с последующим заключением в бальзам. Для анализа использовали не менее 50 срезов, в которых находились боковые желудочки (БЖ) головного мозга от каждого животного. Микрофотографии получали при помощи цифрового микроскопа со встроенной фотокамерой Motic DM-1802-A. Для оценки объема БЖ выбирали срезы (×4), где площадь сечения желудочков была максимальной. Показатель определяли путем обведения границ БЖ и последующих расчетов в морфометрической компьютерной программе ImageJ. Определение объемных фракций сосудистых сплетений в БЖ: относительного объема и общей фракции сосудов, фракции клеток и соединительной ткани проводили стереологически на 50 серийных срезах с помощью окулярной сетки с 60 равноудаленными узлами пересечения на микроскопе Микромед при увеличении в 400 раз.

При статистической обработке для проверки однородности дисперсий полученных данных использовали критерий Фишера. В сравниваемых выборках условие гомоскедастичности выполнено. Распределение значения переменных в вариационных рядах первичных данных оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Распределение переменных было нормальным, поэтому проверку статистических гипотез проводили с помощью параметрических методов t-критерия Стьюдента. Данные представлены как среднеарифметическое значение и стандартная ошибка средней (М±m). Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У животных, перенесших серию гипогликемий, максимальная площадь сечения БЖ увеличивается на 23%, относительный объем сосудистых сплетений БЖ и объемная фракция сосудов в сплетениях увеличиваются соответственно на 14% и 18%, а объемная фракция клеток в сплетениях уменьшается на 15% (во всех случаях p<0,05) (табл. 1).

Таким образом, в БЖ мозга крыс при возобновляющейся гипогликемии зарегистрированы серьезные морфофункциональные преобразования: происходит увеличение объема желудочков, в желудочках наблюдается увеличение относительного объема сосудистых сплетений, в которых повышается объемная фракция сосудов и снижается объемная фракция клеток (табл. 1).

В сосудистых сплетениях наблюдаются дистрофические изменения эпителиоцитов: клетки увеличены в объеме, ядро смещенно на периферию, обнаруживается гомогенизация и инкрустрация цитоплазмы этих клеток. При этом в разных участках сосудистых сплетений видны спазмированные и переполненные капилляры, а также участки отслоения эпендимы от подлежащей ткани мозга и десквамация клеток эпителия сосудистого сплетения (рис. 1). Такие нарушения способны приводить к некрозу клеток, следствием чего может быть снижение объемной фракции клеток в сплетениях (табл. 1).

Зоны дистрофических изменений клеток и выраженные перицеллюлярные и периваскулярные отеки регистрируются и в ткани головного мозга, окружающей желудочки (рис. 1). При этом более повреждены клетки, находящиеся вблизи цереброспинальной жидкости. Также по периферии желудочков головного мозга визуально наблюдается увеличение числа глиальных клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ

У животных, перенесших серию гипогликемических состояний, наблюдается увеличение максимальной площади сечения БЖ и относительного объема сосудистых сплетений (табл. 1).

Увеличение сосудистых сплетений обнаруживается при множестве заболеваний, связанных с нарушением функций мозга, таких как менингит, депрессия, психоз, шизофрения, комплексный регионарный болевой синдром, эпилепсия, ишемический инсульт, гипоксия, ожирение, а также при первичных нейродегенеративных расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера, лобно-височная деменция, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и нормальное старение [9]. Таким образом, увеличение объема сосудистых сплетений не является специфичным для возобновляющейся гипогликемии, но служит свидетельством развития патологического процесса.

Поскольку объемная фракция клеток в сплетениях снижается, а объемная фракция соединительной ткани в сплетениях не изменяется (табл. 1.), то увеличение относительного объема сосудистых сплетений обусловлено, по-видимому, повышением объемной фракции сосудов.> Такие изменения могут иметь компенсаторный характер и быть направлены на увеличение продукции СМЖ [10]. Снижение способности к продукции ликвора у животных с возобновляющейся гипогликемией представляется вероятным, поскольку количество клеток сосудистого сплетения уменьшается, и эпителиальные клетки обнаруживают явные дистрофические изменения (табл. 1, рис. 1).

Основным механизмом повреждения нейронов при гипогликемии, гипоксии/ишемии и нейродегенеративных заболеваниях является эксайтотоксичность, связанная с значительным увеличением уровня глутамата в межклеточных пространствах и избыточной активацией нейрональных N-метил-D-аспартат (NMDA) рецепторов глутамата [5–7]. При гипогликемии в межклеточной среде, кроме увеличения уровня глутамата, значительно увеличивается количество аспартата [11], также лиганда NMDA рецепторов [12].

Гиперактивация NMDA-рецепторов, которые представляют собой Na⁺-Са²⁺ лиганд-зависимые ионные каналы, приводит к увеличению входа Са²⁺ в нейроны и в митохондрии. Увеличение концентрации Са²⁺ в митохондриях вызывает открытие пор митохондриальной проницаемости (mPTP) и падение тем самым трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий. Это сопровождается увеличением продукции активных форм кислорода (ROS) — супероксиданионрадикала (O₂^•), перекиси водорода (H₂O₂), которая легко проходит через клеточные мембраны, и гидроксильного радикала (•OH). Накопление ROS приводит к повреждению ядерной ДНК и активации поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1, стимулирует проапоптотические сигнальные пути и вызывает клеточное старение. Постоянное открытие mPTP сопровождается изменениями осмотического давления и набуханием митохондрий, что в итоге приводит к их лизису и гибели, регулируя некроз клеток [5–7][13].

Удаление потенциально опасных метаболитов из межклеточных пространств мозга осуществляется глимфатической системой, которая представляет собой организованный поток СМЖ через периваскулярные пространства на уровне паренхиматозных капилляров мозга и внутри паренхиматозного интерстиция мозга и регулируется каналами аквапорина 4 [9]. В результате глимфатического потока осуществляется значительная часть продукции и абсорбции спинномозговой жидкости [8][14]. Посредством глимфатической системы вещества из межклеточных пространств мозга попадают в желудочковую СМЖ. Таким образом аспартат, глутамат и перекись водорода, которые выделяются в межклеточные пространства при гипогликемии, поступают в СМЖ подобно тому, как это происходит при ишемии, когда уровень глутамата в ликворе увеличивается в 55 раз [15].

Эпителиоциты сосудистого сплетения и эпендимальные клетки желудочков экспрессируют NMDA рецепторы, которые сосредоточены в люменальной мембране [15].> Поэтому> неоднократно возникающие при возобновляющейся гипогликемии увеличения концентрации аспартата и глутамата в СМЖ, приводя к активации NMDA-рецепторов и массивному поступлению Ca²⁺ в эпителиальные клетки сосудистых сплетений, способны вызывать их эксайтотоксическое повреждение. С этим, по-видимому, связаны повреждения эпителия сосудистого сплетения и уменьшение количества клеток сплетения (табл. 1, рис.1), выявленные в настоящем исследовании у крыс с возобновляющейся гипогликемией.> Кроме того, при глутаматной эксайтотоксичности увеличение продукции активных форм кислорода повышает экспрессию и выделение клетками сосудистых сплетений матриксной металлопротеиназы 9 — внеклеточной цинк-зависимой эндопептидазы, способной разрушать все типы белков внеклеточного матрикса, включая белки плотных контактов и базальные ламинарные белки, что может приводить к нарушению гематоликворного барьера [13].

Функцией сосудистого сплетения является и активная защита головного и спинного мозга путем секреции множества нейротрофических и ангиогенных факторов из эпителиальных клеток в спинномозговую жидкость. К этим факторам относятся инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF2), трансформирующий фактор роста-b (TGF-b), транстиретин и многие другие, включая инсулин [9][16]. Таким образом, выявленные в настоящем исследовании дистрофические повреждения эпителия сосудистого сплетения могут иметь неблагоприятные последствия для мозга в целом.

Одной из причин, выраженных перицеллюлярных и периваскулярных отеков и дистрофических изменений клеток в ткани головного мозга, окружающей желудочки (рис. 1) может быть эксайтотоксичность. Эпендимоциты желудочков мозга экспрессируют высокоэффективные переносчики глутамата, которые, вероятно, отвечают за поддержание низких концентраций глутамата в ликворе. При этом глутамат поступает в перивентрикулярную паренхиму мозга, и уровень его в нервной ткани, окружающей желудочки, может значительно превышать концентрацию в СМЖ [15]. Переходу глутамата, аспартата и активных форм кислорода в перивентрикулярные пространства способствует отсутствие плотных соединений между эпендимальными клетками [17] и ток жидкости в глимфатической системе в пространствах между волокнистыми путями в белом веществе, прилежащем к субэпендимальной паренхиме [18].

Преимущественное поражение перивентрикулярных нейронов и нейронов поверхностных слоев коры больших полушарий головного мозга наблюдается при тяжелой продолжительной гипогликемии (уровень глюкозы в крови менее 1,0 ммоль/л в течение 10–30 мин), сопровождающейся развитием «изоэлектрической» ЭЭГ [19]. Однако степень гипогликемии, индуцированной в этих исследованиях, является экстремальной и редко наблюдается у людей с сахарным диабетом [5]. В нашем эксперименте уровень глюкозы в крови животных при гипогликемии находился в пределах 1,4–1,8 ммоль/л и гипогликемическое состояние немедленно купировалось введением глюкозы. Таким образом, повторяющиеся эпизоды относительно умеренной кратковременной гипогликемии и долгосрочная тяжелая (претерминальная) гипергликемия приводят к сходным нарушениям в мозге. Кроме того, повреждение нейронов при ВГ может быть потенцировано нарушением синтеза различных факторов роста в эпителиальных клетках сосудистого сплетения, повреждение которых выявлено в настоящем исследовании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом возобновляющаяся гипогликемия приводит к увеличению максимальной площади сечения БЖ и относительного объема сосудистых сплетений, а также дистрофическим изменениям эпителия сосудистых сплетений и нервной ткани перивентрикулярных пространств. Поскольку гипогликемия наблюдается в ходе лечения пациентов с сахарным диабетом неоднократно, выявленные изменения могут явиться одной из причин нарушения когнитивных функций и развития деменции у этих больных.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Плановая НИР ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных> и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием> настоящей статьи.

Участие авторов. Фоканова О.А., Кораблёва Т.В., Медведева Н.Б. — отработка методики исследований, сбор и статистическая обработка материала, анализ и интерпретация данных, написание и редактирование текста; Телушкин П.К. — концепция и дизайн исследования, анализ и интерпретация данных, написание и редактирование текста. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией.