Генно-средовые взаимодействия полиморфных локусов ММР и ожирения при формировании артериальной гипертонии у женщин.

Обоснование

Артериальная гипертония (АГ) – гетерогенное многофакторное расстройство, распространенность которого увеличивается с каждым годом как в нашей стране, так и во всем мире [1]. В России повышенные значения артериального давления (АД) регистрируются у 43,5% взрослого населения, большую часть которого составляют женщины [2]. АГ характеризуется такими грозными осложнениями, как инсульт и инфаркт, а также является важной составляющей метаболического синдрома наряду с ожирением и дислипидемией [3, 4]. Ожирение, в свою очередь, выступает самостоятельным фактором риска развития АГ. Избыточная масса тела тесно коррелирует с инсулинорезистентностью, повышением тонуса симпатоадреналовой системы и активацией ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, что ведет к повышению АД и развитию гипертонии [5]. Известно, что ожирение, как фактор риска у женщин с АГ, особенно старшего возраста, встречается чаще, чем у мужчин. Среди генетических факторов риска возникновения АГ важную роль играют гены матриксных металлопротеиназ (ММР) – семейства эндопептидаз, широко распространенных в тканях человека и отвечающих за расщепление всех белков внеклеточного матрикса и поддержание тканевого гомеостаза [6, 7]. ММР участвуют в клеточной пролиферации, миграции, процессах заживления и регенерации, вовлечены в развитие сердечно-сосудистых заболеваний и метаболических нарушений [8, 9]. В ряде исследований показана связь полиморфных локусов ММР с развитием артериальной гипертензии [10–13]. При этом важное значение в реализации фенотипических эффектов полиморфизма ММР при развитии АГ имеют их взаимодействия со средовыми факторами риска заболевания.

Цель

Изучить генно-средовые взаимодействия полиморфных локусов ММР и ожирения, ассоциированные с развитием артериальной гипертонии у женщин.

Методы

Дизайн исследования

Для осуществления поставленной цели нами было проведено обсервационное, одноцентровое, одномоментное, выборочное исследование в формате «случай–контроль».

Критерии соответствия

В исследование включали женщин в возрасте 18 лет и старше, русской национальности, добровольно подписавших форму информированного согласия на участие в исследовании. Критериями исключения были мужской пол, наличие онкологических, аутоиммунных и острых инфекционных заболеваний на момент обследования, отказ от участия в исследовании.

Условия проведения и продолжительность исследования

Выборка женщин для исследования была сформирована на базе кардиологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа в 2013–2016 гг.

Описание медицинского вмешательства

Для всех женщин, включенных в исследование, рассчитывался индекс массы тела (ИМT, кг/м²). Образцы крови для биохимического анализа отбирались после 8-часового голодания, анализ проводился в БОКБ Святителя Иоасафа.

Забор крови для генетического исследования производили из локтевой вены пробанда в объеме 5 мл. ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Образцы ДНК женщин с АГ и контрольной группы генотипировали по восьми полиморфным локусам матриксных металлопротеиназ.

Исходы исследования

В рамках настоящего исследования оценивались генно-средовые взаимодействия полиморфных локусов ММР и ожирения, ассоциированные с развитием АГ у женщин. Для всех женщин, включенных в исследование, определяли концентрацию общего холестерина (ОXС), холестерина липопротеидов высокой плотности (XС-ЛВП) и триглицеридов (ТГ). Образцы ДНК женщин с АГ и контрольной группы генотипировали по восьми полиморфным локусам матриксных металлопротеиназ, отобранным для исследования согласно критериям, описанным ранее [10, 12].

Анализ в подгруппах

Були сформированы две основные группы.

– Критерием соответствия группе больных АГ был уровень артериального давления: систолического ≥140 мм рт.ст. и/или диастолического ≥90 мм рт.ст. Женщин включали в группу больных с АГ только после подтверждения диагноза с использованием лабораторно-инструментальных и клинических методов обследования в соответствии с диагностическими рекомендациями Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК). Критериями несоответствия анализируемой группе считали наличие в анамнезе симптоматической и/или вторичной гипертензии, печеночной и/или почечной недостаточности.

– Критерием соответствия группе контроля был уровень АД: систолического <140 мм рт.ст. и диастолического <90 мм рт.ст. Критериями несоответствия контрольной группе считали наличие у женщины метаболического синдрома, онкологических и аутоиммунных заболеваний.

Группы больных с АГ и контроля подразделяли на две подгруппы в зависимости от наличия ожирения.

– В подгруппу пациенток с ожирением включались женщины с индексом массы тела ≥30 кг/м².

– Пациенток, у которых ИМТ составлял ≤29 кг/м², включали в подгруппу без ожирения.

Методы регистрации исходов

Концентрацию ОХС, XС-ЛВП, ТГ определяли стандартными методами, содержание холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛНП) вычисляли по формуле Фридвальда. Анализ полиморфных локусов ММР проводили методом полимеразной цепной реакции (real-time PCR) синтеза ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов [14–16], произведенных ООО «Синтол» (Россия).

Этическая экспертиза

Протокол настоящего исследования был рассмотрен и одобрен этическим комитетом медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета (Протокол № 8 от 10.04.13). От всех женщин было получено письменное информированное согласие на проведение исследования.

Статистический анализ

Соответствие ожидаемого и наблюдаемого распределения генотипов согласно равновесию Харди–Вайнберга оценивали при помощи c²-критерия. Частоты аллелей и генотипов в соответствующих группах женщин анализировали в таблицах сопряженности 2×2 с использованием критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность. Расчеты проводились в программе Statistica for Windows 10.0. Изучение генно-средовых взаимодействий исследуемых SNP с ожирением при формировании АГ в 3- и 4- и 5-локусных моделях проводили методом GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с помощью программного обеспечения GMDR (v 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr) в общей выборке женщин (пациентки с АГ n=375, женщины группы контроля n=209). При этом выбирались наилучшие модели с высокой точностью предсказания (TBA), воспроизводимостью (СVС) 9/10 и выше, уровнем значимости р≤0,0107. Для валидации полученных моделей проводился пермутационный тест – выполнялось 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что соответствует р_рerm<0,001. Для оценки характера и силы (доля вклада в энтропию) генно-средовых взаимодействий и их визуализации в виде графа использовали метод MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и сервис MDR (v.3.0.2, http://sourceforge.net/projects/mdr).

Характер ассоциаций SNP с развитием гипертонии в подгруппах с ожирением и без ожирения оценивали при помощи показателя отношения шансов (ОR) и его 95% доверительного интервала (95% СI). Определение несинонимичных полиморфных локусов (nsSNP) и оценку их предикторного значения проводили с исполизованием программного обеспечения SIFT (Sоrting Tolеrant Frоm Intоlerant) (http://sift.jcvi.оrg/). Регуляторный потенциал SNP оценивали с использованием программы HaploReg (v4.1) (http://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) [17]. Влияние полиморфного маркера на уровень экспрессии генов (cis-еQТL) изучали с использованием баз банных проекта Gеnоtypе-Tissuе Exprеssiоn (GTEx) [18]. В работе использовались данные с p≤8×10^–5, р_FDR≤0,05. Характер ассоциаций аллельных вариантов SNP с уровнем транскрипции гена оценивали по коэффициенту линейной регрессии (β), показывающему изменение нормализованного показателя генной экспрессии на полиморфный генетический вариант (http://www.gtexpоrtal.оrg/).

Результаты

Объекты (участники) исследования

Выборка включала 584 обследуемых: 375 пациенток с АГ и 209 женщин контрольной группы. Характеристика обследованных групп представлена в табл. 1. Группы женщин с АГ и пациентки без гипертензии не отличались по возрасту (р>0,05), но значимо отличались по показателям артериального давления (САД и ДАД), ИМТ, общего холестерина, триглицеридов, XС-ЛВП, XС-ЛНП (р<0,001). Данные показатели использовались в качестве ковариат при анализе ассоциаций взаимодействий SNP матриксных металлопротеиназ и ожирения с развитием АГ. Также в группе больных с АГ достоверно выше число лиц с ожирением (52,8%) по сравнению с контрольной группой (16,7%, OR=5,56, ДИ 95% 3,60–8,62, р=0,001).

Таблица 1. Клинические характеристики женщин с АГ и контрольной группы

Примечание. Данные представлены как абсолютное число пациенток или среднее значение ± стандартное отклонение.

Основные результаты исследования

Проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов SNP металлопротеиназ у пациенток с АГ и в группе контроля в зависимости от наличия ожирения (табл. 2). Ассоциации с развитием АГ установлены только в группе пациенток без ожирения. Показано, что в формирование заболевания вовлечен полиморфный локус rs11568818 MMР7: аллель A и генотип AA ассоциированы с низким риском развития АГ (OR=0,65 и 0,53 соответственно), а аллель G и генотип GG, напротив, повышают риск возникновения гипертензии у их носителей (OR=1,53 и 1,68 соответственно, при р<0,05). Также установлены ассоциации с развитием АГ полиморфного локуса rs11225395 MMР8, генотип ТТ которого оказывает протективный эффект на формирование гипертензии (OR=0,56, р=0,04). Примечательно, что в группе пациенток с ожирением не выявлено ассоциаций локусов ММР с развитием АГ.

Таблица 2. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных локусов ММР у женщин в зависимости от наличия ожирения

Примечание. OR (odds ratio) – показатель отношения шансов, 95% CI (confidence interval) – его 95% доверительный интервал, жирным выделены значимые различия.

На следующем этапе нами оценивались генно-средовые взаимодействия локусов ММР с ожирением, ассоциированные с АГ, результаты представлены в табл. 3. С помощью метода GMDR с учетом коррекции на ковариаты выявлено 15 наиболее значимых 3-, 4- и 5-факторных моделей генно-средовых взаимодействий, ассоциированных с развитием АГ. Для всех установленных моделей воспроизводимость составила 100%, балансовая точность варьировала от 60,9 до 70,1%. Следует отметить, что в состав наибольшего числа моделей генно-средовых взаимодействий входят полиморфные локусы rs1320632 MMP8 и rs11225395 MMP8 (9 и 7 моделей соответственно).

Таблица 3. Модели генно-средовых взаимодействий полиморфных локусов ММР и ожирения при формировании артериальной гипертонии

Примечание. Получено методом GMDR с коррекцией на ковариаты – ОХС, ХС-ЛВП, ХС-ЛНП, ТГ; CVC (cross-validation consistency) – воспроизводимость модели, OR – отношение шансов, 95% ДИ – его 95% доверительный интервал; Testing balanced accuracy (TBA) – точность предсказания модели. Проведен пермутационный тест – выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает р_perm<0,001.

На рис. 1 на цв. вклейке представлен граф, иллюстрирующий характер и силу генно-средовых взаимодействий между исследуемыми SNP и ожирением при формировании АГ. Выявлено, что характер взаимодействия между ожирением и локусами ММР – выраженно антагонистический, при этом наибольший вклад в развитие АГ имеют взаимодействия ожирения с rs652438 MMР12 (–10,95% энтропии), rs1320632 MMP8 (–10,71% энтропии) и rs17577 МMР9 (–9,17% энтропии).

Дополнительные результаты исследования

С использованием программного обеспечения HaploReg (v4.1) установлено, что изученные полиморфные локусы характеризуются выраженным регуляторным потенциалом. Все восемь SNP находятся в регионах ДНК, которые связываются с модифицированными гистонами, маркирующими активные энхансеры и промоторы в различных тканях, в том числе в периферической крови, эндотелиоцитах, гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клетках. Семь изученных локусов (кроме rs652438) расположены в регионах ДНК, гиперчувствительных к действию ДНКазы-1, в головном мозге, эндотелии, скелетной мускулатуре, сердце и других органах. Полиморфные варианты rs11568818 и rs17577 локализованы в эволюционно консервативных регионах, а rs1799750, rs17577 и rs11568818 – в регионах ДНК, которые связываются с регуляторными белками (GATA2, TBP, c-FOS, c-Jun, GABP, CTCF, HAE2F1 и ZNF263). Пять изученных SNP (rs1799750, rs243865, rs3025058, rs11568818, rs1320632) локализованы в сайтах связывания с транскрипционными факторами (более 30).

Два из восьми полиморфных локусов – rs17577 МMР9 и rs652438 MMР12 являются несинонимичными заменами (http://sift.jcvi.org/). Локус rs17577 определяет замену Arg668Gln (аргинин на глутамин) в экзоне 12 гена МMР9 (22q13.12). Данная аминокислотная замена имеет SIFT Score=0,02, что характеризует ее предикторное значение как «Deleteriоus» (SIFT Score≤0,05). Полиморфный вариант rs652438 MMР12 определяет замену Asn357Ser (аспарагин на серин) в экзоне 8 гена ММР12 (11q22.3). SIFT Score данной замены составляет 0,01, что характеризует ее значение как «Deleteriоus» (SIFT Score ≤0,05).

С помощью программы GTExpоrtal in siliсo проведен анализ ассоциаций изученных полиморфных локусов с экспрессией генов (http://www.gtexportal.org/). Установлено, что четыре из восьми SNP влияют на экспрессию генов – rs17577, rs11568818, rs1320632 и rs11225395. Так, аллель G rs17577 связан с изменением экспрессии гена SNX21 в скелетной мускулатуре (β=0,19, р=0,65×10^–7) и гена SLC12A5 аорте (β=0,66, р=0,33×10^–9), коронарных артериях (β=0,66, р=1,4×10^–5) и 10 других тканях (β=0,44–1,08, р=0,89×10^–23–0,31×10^–6). Для варианта G rs11568818 показан низкий уровень экспрессии гена ММР7 в легких (β= –0,35, р=0,81×10^–15), печени (β= –0,46, р=0,12×10^–5), поджелудочной железе (β= –0,31, р=0,51×10^–12) и др. Полиморфные варианты G rs1320632 и С rs11225395 связаны с низким уровнем экспрессии гена ММР27 в скелетной мускулатуре (β= –0,48, р=0,12×10^–9), периферической крови (β= –0,23, р=0,48×10^–10), нервной ткани (β= –0,54, р=0,36×10^–9) и др. Также аллель С rs11225395 ассоциирован с низким уровнем экспрессии гена RP11-817J15.3 в периферической крови (β= –0,19, р=0,38×10^–6).

Обсуждение

В настоящем исследовании установлены особенности ассоциаций генетических вариантов металлопротеиназ с развитием АГ у женщин в зависимости от наличия или отсутствия ожирения. В формирование АГ в группе женщин без ожирения вовлечены локусы rs11568818 MMР7 и rs11225395 MMР8, тогда как среди женщин с ожирением значимых ассоциаций ММР с АГ не выявлено. В основе этих различий в ассоциациях полиморфизмов ММР с АГ могут лежать взаимодействия этих полиморфных локусов ММР с ожирением при формировании АГ. Так, согласно полученным нами данным, ожирение является самостоятельным фактором риска развития гипертензии (OR=5,56, р=0,001; вклад в энтропию составляет 26,99%) и значимо взаимодействует с полиморфизмами ММР при формировании АГ – установлено 15 3-, 4- и 5-факторных моделей взаимодействия 8 локусов ММР с ожирением, ассоциированных с заболеванием.

Согласно литературным данным, ожирение влияет на экспрессию генов ММР [19–21]. В исследовании C. Chavey и соавт. в моделях на мышах установлено, что при ожирении значительно увеличивается содержание мРНК металлопротеиназ MMP2, MMP3, MMP12, MMP14, MMP19 и их тканевого ингибитора 1 типа (TIMP1). Напротив, содержание мРНК MMP7 и TIMP3 при ожирении заметно снижается [19]. Авторы подчеркивают, что при ожирении баланс ММР/TIMP смещается в сторону увеличения деградации внеклеточного матрикса. В работе V. Andrade и соавт. выявлены отличия концентрации в плазме ММР у женщин с ожирением и без ожирения: женщины с ожирением имели более высокую концентрацию MMP9 и ММР1 и более низкую концентрацию MMP8 по сравнению с худыми женщинами [20]. В исследовании B. Głowinska-Olszewska и соавт. также установлена более высокая концентрация ММР9 у пациентов с ожирением по сравнению с лицами без ожирения (р=0,02) и выявлена ассоциация концентрации ММР9 с ИМТ (р=0,005), систолическим артериальным давлением (р=0,002) и концентрацией инсулина натощак (р=0,006) [21].

Нами установлено, что в генно-средовых взаимодействиях ММР с ожирением участвуют все изученные полиморфные локусы, при этом в состав наибольшего числа моделей входят SNP rs1320632 ММР8 (9 моделей) rs11225395 ММР8 (7 моделей) и rs11568818 ММР7 (6 моделей).

Полиморфный локус rs11225395 ММР8 ассоциирован с развитием АГ у женщин как самостоятельно, так и в составе 7 моделей генно-средовых взаимодействий, а rs1320632 ММР8 хотя и не демонстрирует монолокусных эффектов, но входит в большинство моделей (9 из 15), ассоциированных с АГ. Данные SNP ассоциированы с изменением экспрессии генов (RP11-817J15.3 и ММР27) и характеризуются значимым регуляторным потенциалом – расположены в гиперчувствительным к действию ДНКазы-1 последовательностях ДНК, а также в регионах связывания гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры в различных тканях. Согласно базе GeneCards, ген ММР8 кодирует коллагеназу нейтрофилов, которая участвует в деградации интерстициальных коллагенов I, II, III типов и активации хемокинов и ростовых факторов. Металлопротеиназа 8 отвечает за клеточную пролиферацию, дифференцировку клеток, апоптоз, ангиогенез и онкогенез (http://www.genecards.org). Литературные данные свидетельствуют о вовлеченности полиморфных локусов rs11225395 и rs1320632 гена ММР8 в развитие сердечно-сосудистой патологии у пациентов с метаболическим синдромом в сербской популяции [22], что согласуется с результатами нашей работы.

Согласно нашим данным, полиморфный локус rs11568818 MMР7 самостоятельно вовлечен в развитие АГ у женщин без ожирения, а также входит в состав 6 моделей генно-средовых взаимодействий, ассоциированных с гипертонией. Данный SNP располагается в участках ДНК, которые связываются с регуляторными белками, транскрипционными факторами и гистонами, маркирующими промоторы и энхансеры. Локус rs11568818 находится в гиперчувствительном к ДНКазе-1 регионе и оказывает влияние на экспрессию гена ММР7 в различных тканях. Согласно базе GeneCards, ген ММР7 относится к кластеру генов на 11 хромосоме и кодирует матрилизин, у которого отсутствует консервативный гемопексиновый домен на C-конце. Металлопротеиназа 7 отвечает за деградацию эластинов, желатинов, фибронектинов, протеогликанов, а также участвует в миграции, пролиферации, апоптозе клеток и процессах регенерации при повреждениях (http://www.genecards.org/). S. Jormsjö и соавт. получено, что rs11568818 ММР7 вовлечен в формирование сердечно-сосудистых заболеваний в шведской популяции (р<0,010) [23], что согласуется с нашими результатами.

Резюме основного результата исследования

Изучена вовлеченность генно-средовых взаимодействий полиморфных локусов ММР с ожирением в развитие артериальной гипертонии у женщин. Получено 15 3-, 4- и 5-факторных моделей генно-средовых взаимодействий локусов ММР с ожирением, ассоциированных с высоким риском развития АГ (р=0,001), в состав которых входят все 8 изученных SNP. Установлена вовлеченность rs11568818 MMР7 и rs11225395 MMР8 (р<0,050) в формирование АГ у женщин без ожирения.

Обсуждение основного результата исследования

В настоящей работе установлено, что ожирение оказывает важное модифицирующее влияние на экспрессию генов металлопротеиназ и может влиять на характер ассоциаций ММР с развитием АГ у женщин. Полученные нами данные согласуются с медико-биологическими эффектами исследуемых генов ММР (табл. 4), а также с результатами других ассоциативных исследований, проведенных ранее во Франции, Бразилии, Швеции и др. Изученные SNP располагаются в регионе связывания с гистонами, маркирующими промоторы и энхансеры, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1, в сайтах связывания регуляторных белков и транскрипционных факторов, а также влияют на экспрессию генов. Значимый регуляторный потенциал этих локусов может быть медико-биологической основой их вовлеченности в развитие артериальной гипертонии.

Таблица 4. Биологические функции полиморфных локусов ММР и их ассоциации с сердечно-сосудистой патологией

Ограничения исследования

Настоящее исследование имеет некоторые ограничения. Так, в работе рассматривались женщины, но не рассматривались мужчины; было проанализировано только 8 SNP 7 генов матриксных металлопротеиназ, а также не анализировались прочие факторы риска развития АГ, такие как курение и злоупотребление алкоголем. Вышесказанное свидетельствует о необходимости проведения дальнейших исследований роли ожирения в реализации генетической предрасположенности к развитию артериальной гипертонии.

Заключение

Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что в формировании АГ у женщин важную роль играют генно-средовые взаимодействия локусов ММР rs1799750, rs243865, rs3025058, rs11568818, rs1320632, rs11225395, rs17577, rs652438 и ожирения. Показано, что анализируемые SNP имеют значимые эпигенетические эффекты: располагаются в участках ДНК, которые является местом связывания гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1, в сайтах связывания регуляторных белков и транскрипционных факторов. Локусы ММР rs17577, rs11568818, rs1320632 и rs11225395 имеют cis-eQTL-значение, влияя на экспрессию генов ММР7, SNX21, SLC12A5 и RP11-817J15.3. Полученные данные расширяют представления о влиянии генно-средовых взаимодействий на реализацию предрасположенности к АГ у женщин.

Благодарности. Авторы выражают благодарность ФГБОУ ВО «Тверской ГМУ» Минздрава России (и.о. ректора — проф. А.Б. Давыдов) и ГБУЗ Тверской области «КДБ №2» (гл. врач — к.м.н. Э.П. Гнатенко) за помощь в организации и проведении исследования.