Нейроэндокринный контроль гонадотропной функции гипофиза при экспериментальном диабете

Стабильность функционирования репродуктивной системы зависит от множества факторов внутренней и внешней среды. Серьезные нарушения ее работы связаны с изменением углеводного гомеостаза, лежащего в основе такого заболевания, как сахарный диабет. Известно, что нарушения функциональной активности репродуктивной системы организма у лабораторных животных при диабете связаны не только с деструктивными изменениями гонад, но и с дисфункцией гипоталамо-гипофизарного комплекса [9, И]. Данные литературы свидетельствуют о том, что у особей мужского и женского пола эти нарушения проявляются в разной степени [7, 8]. До сих пор остается спорным вопрос о том, насколько нарушения, вызванные диабетогенным состоянием, зависимы от уровня половых стероидов и инсулина в организме. В отличие от самцов для самок характерны циклические изменения в активности репродуктивной системы. Следовательно, не исключено, что наблюдаемые в норме различия в регуляции гонадотропной функции у самцов и самок крыс могут объяснять их различную восприимчивость к диабету.

В связи с вышесказанным мы провели комплексное исследование функциональной активности гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы у самцов и самок крыс с экспериментальным диабетом, вызванным введением стрептозотоцина (СТЗ).

Материалы и методы

Опыты проведены на беспородных половозрелых самцах и самках крыс массой тела 160— 200 г, которых содержали в условиях контролируемого температурного режима (22—25°С) и освещенности (свет с 5 до 19 ч). Все животные имели свободный доступ к пище и воде. Интактным циклирующим и овариэктомированным (через 7 дней после операции) самкам и интактным самцам внутрибрюшинно вводили СТЗ в дозе 60 мг на 1 кг массы тела в 0,2 мл цитратного буфера pH 4,5. В группу экспериментальных животных отбирали только тех крыс, у которых концентрация глюкозы в крови составляла не менее 12 ммоль/л (при уровне у контрольных крыс 2,7—3,5 ммоль/л). Самцов контрольной и экспериментальной групп декапитировали на 14-й день эксперимента. В опытах с заместительной терапией группе самцов, начиная с 14-го дня после введения СТЗ, внутримышечно вводили пролонгированный препарат инсулина (суспензию цинк-инсулина) 1 раз в сутки в течение 14 дней. Дозу инсулина подбирали индивидуально до нормализации содержания глюкозы в крови, концентрацию которой определяли ежедневно глюкозооксидазным методом на глюкозиметре "Эксан".

Через 14 дней после индукции диабета у интактных самок ежедневно брали влагалищные мазки для проверки эстральной цикличности. У 65—80 % животных, больных диабетом, отмечали постоянный диэструс (Д). Материал брали в 10 ч стадии Д| и в 17 ч стадии проэструса (П) у контрольных самок или в предполагаемую стадию П у подопытных крыс, в вагинальных мазках которых наряду с эпителиальными клетками наблюдали много лейкоцитов.

Овариэктомированным самкам (контрольным и получавшим СТЗ) через 21 день вводили половые стероиды: эстрадиол — Э2 (5 мкг в 0,2 мл масла) и через 72 ч прогестерон (20 мг в 0,2 мл масла). Материал брали в 10 и 17 ч в день введения прогестерона.

После декапитации интактных самцов и самок крыс гипоталамические фрагменты (преоптико- переднегипоталамическая область — ПО и область медиобазального гипоталамуса — МБГ) и аденогипофизы от 40 крыс обрабатывали, как описано ранее [2, 5], для получения ядерной фракции. В качестве меченых гормонов использовали 1, 2, 6, 7-³Н-тестостерон и 2, 4, 6, 7-’Н-эст- радиол (удельная активность 85—104 Ки/мМ). Условия инкубации меченых стероидов и расчет числа специфических связывающих мест были такими же, как в ранее опубликованной работе [6]. Количество связывающих мест в ядрах рассчитывали в фемтомолях на 1 мг ДНК.

Овариэктомированных самок декапитировали в 10 и 17 ч (через 72 и 79 ч после введения Э₂) и из ткани гипоталамуса методом микропункции выделяли следующие фрагменты: медиальную часть преоптической области, аркуатное ядро (АРК) и срединное возвышение (СВ), в которых определяли концентрацию люлиберина (ЛГ-РГ) радиоиммунологическим методом [1]. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой и получения антигена использовали синтетический ЛГ-РГ ("Hoechst", ФРГ). Концентрацию ЛГ- РГ выражали в нанограммах на 1 мг белка.

В опытах in vitro по изучению чувствительности гипофиза к ЛГ-РГ у интактных самцов инкубировали по 2 половины от разных гипофизов, как описано ранее [4|, и добавляли в среду ЛГ- РГ в дозе 50 нг/мл.

Концентрации лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов в среде и сыворотке крови определяли радиоиммунологическим методом с использованием наборов NIDDK (США). Концентрацию гормонов выражали в нанограммах NIDDK-rLH-RP-З и NIDDK-rFSH-RP-2 соответственно на 1 мг ткани гипофиза или 1 мл сыворотки крови. Содержание Э₂ и тестостерона (Т) в крови определяли наборами для радиоиммунологического анализа ESTR-Direct ("Sorin", Франция) и TESTO-CT (Франция), концентрацию гормонов выражали в пико- и нанограммах на 1 мл сыворотки соответственно. Уровень инсулина в крови определяли с помощью набора рио-ИНС-ПГ-²⁵1 и выражали в микроединицах на 1 мл сыворотки.

Рис. I. Концентрация рецепторов Т (?) и Э₂ (2) в гипофизе (о), ПО и МБГ (6) контрольных самцов крыс (светлые столбики), самцов, получавших СТЗ (заштрихованные столбики) или СТЗ + инсулин (темные столбики).

По осям ординат — связанный ■’H-гормон в ядсрной фракции (в фмоль на 1 мг ДНК). ♦ — р < 0,001 при сравнении с контрольной группой.

Результаты обрабатывали статистически с помощью /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

В I серии экспериментов, выполненных на самцах крыс с экспериментальным диабетом, в аденогипофизе, МБГ и ПО определяли концентрацию ядерных рецепторов половых гормонов, участвующих в регуляции секреции гонадотропинов по механизму отрицательной обратной связи и полового поведения, и изучали чувствительность гипофиза к ЛГ-РГ.

Введение СТЗ вызывало достоверное снижение концентрации ядерных рецепторов Т в гипофизе самцов крыс (рис. 1, а), при этом не отмечено различий в числе ядерных Э₂-связывающих мест в гипофизе контрольных и получавших СТЗ животных. В опытной группе самцов, получавших инсулин, концентрация ядерных рецепторов андрогенов в гипофизе приближалась к таковой у контрольных животных. Концентрация ядерных рецепторов Т в ПО и МБГ была одинаковой у контрольных и подопытных крыс, однако наблюдалось увеличение числа ядерных рецепторов Э₂ в ПО у крыс с диабетом, которое после инсулинотерапии достигало уровня контрольных самцов (рис. 1, б).

Уровень ЛГ и ФСГ в крови крыс с диабетом, вызванным введением СТЗ (1,00 ± 0,14 и 9,45 ± 1,27 нг/мл соответственно), не отличался от такового у интактных животных (0,66 ± 0,09 и 9,53 ± 1,30 нг/мл соответственно). В экспериментальной группе концентрация Т была снижена с 2,80 ± 0,31 до 1,52 ± 0,32 нг/мл (р < 0,01), а содержание Э₂ повышено с 6,66 ± 1,00 до 26,83 ± 3,68 пг/мл (р < 0,001). При компенсаторной терапии инсулином уровень половых гормонов в крови приближался к норме.

В опытах in vitro по определению чувствительности гонадотрофов гипофиза к ЛГ-РГ показано, что развитие диабета у крыс не влияет на уровень базальной секреции Л Г в течение всего периода инкубации (рис. 2). Однако ответная реакция на ЛГ-РГ в группе экспериментальных животных наступала в более ранние сроки: увеличение концентрации ЛГ после добавления ЛГ-РГ наблюдали через 1 ч инкубации, хотя по абсолютным значениям это увеличение незначительно отличалось от такового в контрольной группе. Максимальный ответ на ЛГ-РГ был зарегистрирован у контрольных крыс через 3 ч инкубации, в то время как скорость секреции ЛГ у животных с экспериментальным диабетом не отличалась от базальной.

Тот факт, что уровень ЛГ и ФСГ в крови оставался неизменным на фоне сниженной концентрации рецепторов андрогенов в гипофизе самцов крыс, получавших СТЗ, свидетельствует о нарушении у них механизма отрицательной обратной связи между гонадами и гипофизом. Данные о снижении чувствительности гипофизарных клеток к ЛГ-РГ у крыс, больных диабетом, дают основание предположить, что дисфункция гипофиза может быть основной причиной, изменяющей

Рис. 2. Концентрация ЛГ в среде при инкубации аденогипофизов интактных (а) и получавших СТЗ (б) самцов крыс в норме (/а, 16) и при добавлении в среду ЛГ-РГ (2а, 26).

По оси ординат — содержание ЛГ в среде (в нг на 1 мг гипофиза); по оси абсцисс — время инкубации (в ч). * — р < 0,05 при сравнении групп 16 и 2d; ♦♦ — р < 0,001 при сравнении групп !а и 2а. Содержание ЛГ, ФСГ, Э₂, Т и инсулина (ИНС) в сыворотке крови контрольных (К) и получавших СТЗ самок крыс (М ± т)

 нейроэндокринную регуляцию репродуктивной функции у самцов- крыс с экспериментальным диабетом. На уровне гипоталамуса этот механизм обратной связи остается неповрежденным, так как концентрация ядерных андрогенных рецепторов не изменялась в МБГ.

Резкое увеличение связывания Э2 с ядерными рецепторами ПО, на уровне которой осуществляется регуляция полового поведения, на фоне высокого уровня Э₂ в крови при диабете, возможно, обусловлено усилением процесса ароматизации. Увеличение уровня ядерных рецепторов Э₂ в ПО в какой-то степени может свидетельствовать о феминизации самцов, больных диабетом.

Восстановление уровня рецепторов Э₂ и Т гормонального фона при введении инсулина самцам с диабетом, вызванным введением СТЗ, позволяет сделать заключение, что у самцов инсулин вовлекается в регуляцию гонадотропной функции гипофиза.

Аналогичные исследования были выполнены на самках крыс с экспериментальным диабетом, у которых определяли концентрацию ядерных рецепторов половых гормонов в аденогипофизе, ПО и МБГ. Кроме того, у овариэктомированных самок с компенсаторным введение Э₂ и прогестерона определяли чувствительность гипофиза к ЛГ- РГ с целью исключения возможного нарушения секреции стероидов на уровне яичников при диабете.

У экспериментальных животных содержание ЛГ и ФСГ в стадии Д[ и предполагаемого П было снижено по сравнению с их уровнем в соответствующие стадии у интактных циклирующих крыс (см. таблицу). Что касается уровня половых гормонов в сыворотке, то можно отметить резкое снижение концентрации Э₂ в обеих стадиях цикла у самок, получавших СТЗ. В отличие от интактных крыс, у которых уровень Т был выше в стадии П (17 ч), чем в дневные часы стадии Д_]; у экспериментальных самок уровень Т в крови был одинаковым в обеих стадиях и не отличался от такового у интактных самок в П. Таким образом, при развитии диабета у самок крыс циклические изменения Л Г, ФСГ и половых гормонов в крови отсутствуют.

В следующей серии опытов исследовали зависимость этих изменений от действия половых гормонов на гипоталамо-гипофизарный комплекс по механизму обратных связей. Одним из показателей этого действия стероидов является уровень их рецепторов в гормончувствительных тканях.

В норме отмечали увеличение концентрации ядерных рецепторов Э₂ в ПО в 17 ч стадии П по сравнению с их уровнем в 10 ч стадии Д| (рис. 3, о). У крыс, получавших СТЗ, не наблюдали повышения уровня эстрогенных рецепторов в ПО в стадии предполагаемого П. В отличие от этого в стадии Д| число ядерных Э₂-связывающих мест в ПО и МБГ не было одинаковым у контрольных и экспериментальных самок. Наблюдающееся в норме увеличение числа Э₂-связывающих мест в ядерной фракции гипофиза в 17 ч стадии П отсутствовало в стадии предполагаемого П у крыс, получавших СТЗ (рис. 3, б).

В отношении уровня рецепторов Т можно заметить, что у интактных самок концентрация рецепторов Т в гипофизе была выше в стадии П, чем в стадии Д[. У крыс с диабетом уровень ядерных андрогенных рецепторов был одинаковым в стадиях Д₁ и П (рис. 4, б). При этом не обнаружено различий в числе Т-связывающих мест в ПО и МБГ по стадиям у получавших СТЗ и контрольных самок крыс (рис. 4, а).

Таким образом, очевидно, что развитие диабета у самок сопровождается отсутствием преовуля-  торной волны гонадотропинов. На основании полученных данных можно предположить, что в основе этого процесса лежит снижение уровня Э2 в крови и концентрации ядерных рецепторов Э2 в ПО и гипофизе, т. е. в тех областях ЦНС, которые участвуют в регуляции освобождения гонадотропинов по механизму положительной обратной связи в ключевую стадию эстрального цикла. Следует, однако, заметить, что механизм отрицательной обратной связи, опосредуемый через эстрогенные рецепторы МБГ, не нарушается у самок крыс с диабетом.

Ранее [3] мы показали, что андрогенные рецепторы гипофиза также играют важную роль в циклической секреции гонадотропинов. И в данной работе уровень Т в крови и ядерных рецепторов Т в гипофизе был выше в 17 ч стадии П, чем в стадии Д] у интактных циклирующих самок. При дефиците инсулина в организме отсутствовали циклические изменения в уровне Т в сыворотке, при этом не наблюдалось и повышения концентрации андрогенных рецепторов в гипофизе в предполагаемую стадию П. На основании полученных данных можно сделать заключение, что отсутствие овуляции у самок крыс при диабете, отмечаемое многими исследователями, по крайней мере частично обусловлено снижением концентрации эстрогенных и андрогенных рецепторов в гипофизе и эстрогенных рецепторов в ПО в стадии П.

Для того чтобы выяснить, является ли основной причиной этих нарушений деструкция гонад, приводящая к снижению продукции половых гормонов, или дефицит инсулина в организме вызывает нарушение гипоталамо-гипофизарного комплекса, была выполнена серия опытов на овари- эктомированных самцах, которым вводили половые гормоны по определенной схеме, вызывающей волну гонадотропинов, подобную той, которая наблюдается в стадии П.

Введение Э₂ снижало уровень Л Г и ФСГ в крови, причем у животных, получавших СТЗ, даже в большей степени, чем у контрольных крыс. На фоне введения прогестерона отмечалось развитие гонадотропинвызванной волны в 17 ч, однако в экспериментальной группе самок ее амплитуда была гораздо ниже, чем в контрольной (рис. 5, а).

Рис. 4. Концентрация ядерных рецепторов Т в ПО (светлые столбики), МБГ (заштрихованные столбики) (а) и гипофизе (б) контрольных (/) и получавших СТЗ (2) самок крыс.

По оси ординат — связанный ³Н-тестостерон в ядерной фракции (в фмоль на 1 мг ДНК); по оси абсцисс — стадия цикла. • — р < 0,05 при сравнении с концентрацией рецепторов в стадии Др

Рис. 5. Концентрация ЛГ (светлые столбики) и ФСГ (темные столбики) в сыворотке крови (а), а также содержание ЛГ-РГ в ПО (светлые столбики), АРК (вертикально заштрихованные столбики) и СВ (столбики с косой штриховкой) (б) у овариэк- томированных самок крыс, получавших половые гормоны (/) или половые гормоны + СТЗ (2).

По осям ординат: а — концентрация ЛГ (в нг на I мл), б — концентрация ЛГ = РГ (в пг на I мкг белка); по оси абсцисс — время дня (в ч).

» — а. 2: р < 0,01 при сравнении с концентрациями ЛГ и ФСГ в Ю ч; б, /: р < 0,01 при сравнении с концентрацией ЛГ Г РГ в соответствующей области в 10 ч; •• — р < 0,001 при сравнении с концентрациями ЛГ и ФСГ в 20 ч; Д — л, 2 р < 0,01 при сравнении с концентрациями ЛГ и ФСГ в контрольной группе (/) в те же временные интервалы; б. 2. р < 0,01 при сравнении с концентрацией ЛГ Г РГ в соответствующей области у контрольных групп (/) в 10 ч.

Таким образом, хотя нарушение цикличности при диабете и связано с дефицитом половых гормонов в циркулирующей крови, однако компенсация их уровня в организме не восстанавливала функциональную активность репродуктивной системы в полном объеме. По-видимому, это обусловлено нарушением и других регуляторных механизмов гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси.

В следующей серии опытов исследовали изменения концентрации ЛГ-РГ в областях гипоталамуса, связанных с продукцией этого либерина и регуляцией секреции гонадотропинов. На рис. 5, б видно, что в утренние часы, когда секреция Л Г и ФСГ находилась на базальном уровне, содержание ЛГ-РГ было более низким во всех областях у самок экспериментальной группы, чем контрольной. В период вызванной волны гонадотропинов уровень ЛГ-РГ в контрольной группе снижался в СВ, ПО и АРК. В отличие от этого в экспериментальной группе содержание ЛГ-РГ было на том же уровне, что и в утренние часы.

Анализируя эти данные и учитывая уровень гонадотропинов в крови, можно предположить, что при диабете, по-видимому, в первую очередь нарушена продукция ЛГ-РГ. поскольку наблюдали снижение его концентрации в тех областях, которые связаны с его синтезом и транспортом. Одна-

ко снижение содержания ЛГ-РГ в СВ может быть вызвано истощением, связанным с повышенным высвобождением ЛГ-РГ из СВ, а сниженный уро­вень гонадотропинов в крови обусловлен сниже­нием чувствительности гипофиза к ЛГ-РГ у крыс с экспериментальным диабетом [10]. Отсутствие изменений уровня ЛГ-РГ к 17 ч, в период макси­мального содержания гонадотропинов в крови по­сле введения стероидов, также свидетельствует о том, что отсутствие циклической секреции гона­дотропинов при диабете связано с нарушением активности гипоталамических центров регуляции репродуктивной функции. Нельзя исключить, правда, опосредованного влияния измененного уровня инсулина при диабете на функцию ЛГ-РГ- продуцирующей системы через изменения актив­ности нейромедиаторных систем мозга. Напри­мер, установлено, что у линии мышей с генетиче­ски обусловленным диабетом в возрасте 2—5 мес снижен синтез катехоламинов в ПО, а в более позднем возрасте — также в области МБГ и СВ [И]. В этих же областях гипоталамуса у крыс, по­лучавших СТЗ, отмечено изменение активности нейропептида У [12] и серотонина [13].

Таким образом, можно констатировать, что из­менение механизма регуляции функции гипотала- мо-гипофизарно-гонадной системы у самцов крыс при экспериментальном диабете связано с нарушениями гипофизарного звена, включающи­ми снижение ЛГ-РГ-стимулированного освобож­дения гонадотропинов и уровня ядерных рецепто­ров Т, что приводит к ослаблению контроля ре­продуктивной функции по принципу отрицатель­ной обратной связи. Изменение же базальной и циклической секреции гонадотропинов у самок крыс с экспериментально вызванным диабетом связано с нарушением активности ЛГ-РГ-проду- цирующей системы и рецепторного связывания на уровне гипоталамо-гипофизарного комплекса.

Выводы

1. При развитии экспериментального диабета у самцов крыс отмечено снижение концентраций Т в крови и ядерных андрогенных рецепторов в аденогипофизе. Уровень ЛГ и ФСГ в крови не из­менялся.
2. Чувствительность гипофиза к ЛГ-РГ у сам­цов крыс, получавших СТЗ, резко снижалась при его инкубации более 1 ч.
3. Введение СТЗ самкам крыс приводило к на­рушению эстрального цикла и сопровождалось уменьшением циклической секреции гонадотро­пинов и половых гормонов.
4. Развитие диабета у циклирующих самок крыс приводило к снижению концентрации ядер­ных рецепторов Э₂ в ПО и гипофизе, при этом число Т-связывающих мест снижалось только в гипофизе.
5. Волна гонадотропинов, стимулированная половыми стероидами, у овариэктомированных самок крыс, больных диабетом, была значитель­но снижена, что обусловлено изменением актив­ности ЛГ-РГ-продуцирующей системы.

Рис. 3. Концентрация ядерных рецепторов Э2 в ПО (светлые столбики), МБГ (заштрихованные столбики) (а) и гипофизе (б) контрольных (/) и получавших СТЗ (2) самок крыс.

По оси ординат — связанный ³Н-эстрадиол в ядерной фракции (в фмоль на I мг ДНК); по оси абсцисс — стадия цикла.

[2] — л: р < 0.01 при сравнении с концентрацией рецепторов в ПО в стадии Д| у контрольной группы и в ПО в стадии П у опытной группы; о: р < 0,001 при сравнении с концентрацией рецепторов в стадии Д| у контрольной группы и в стадии II у опытной группы.