Влияние обзидана (пропранолола) и пирогенала на проявления аллоксанового диабета у крыс

Разработка новых подходов к фармакотерапии сахарного диабета является важной задачей современной эндокринологии [2, 20], при этом большое внимание уделяется проблеме коррекции ин- сулинрезистентности [20]. Средства лечения этого синдрома применяются в основном для терапии сахарного диабета II типа [20]. Вместе с тем снижение вторичной инсулинрезистентности при диабете I типа оптимизирует метаболические эффекты резидуального инсулина и увеличивает чувствительность p-эндокриноцитов к глюкозе [2]. Это позволяет добиться компенсации сахарного диабета на фоне снижения потребности в экзогенном инсулине.

Проблема коррекции инсулинрезистентности актуальна не только в эндокринологии, но и в психиатрии. Массивное применение нейролептиков для лечения шизофрении обусловливает выраженную инсулинрезистентность душевнобольных и снижает эффективность инсулинкоматозной терапии эндогенных психозов [11]. В психиатрической клинике эффективное преодоление резистентности к экзогенному инсулину достигается применением пирогенала [10] и обзидана [11]. В представленной работе изучена возможность применения этих медикаментов для лечения инсулинзависимого сахарного диабета в эксперименте.

Материалы и методы

В работе использованы половозрелые крысы- самцы Вистар массой тела 200—250 г. После предварительной 24-часовой депривации пищи (при сохраненном доступе к воде) у крыс моделировали инсулинзависимый сахарный диабет путем внутрибрюшинного введения аллоксана тригидрата ("Lachema", Чехия) в дозе 200 мг/кг [9]. Контрольные животные получали эквиобъемную инъекцию 0,9% NaCl.

Через 72 ч после введения аллоксана проводили 3-дневный курс инъекций обзидана или пирогенала (контрольным крысам вместо фармпрепаратов вводили 0,9% NaCl). Обзидан (пропранолола гидрохлорид; "Arzneimittelwerk Dresden GmbH", Германия) вводили подкожно в разовой дозе 1 мг/кг. Пирогенал (липополисахарид из бактерий Salmonella typhi производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи) вводили в мышцы бедра в разовой дозе 6,75 мкг/кг. В отдельной серии экспериментов оценивали диабет- модулирующие эффекты сочетанного введения обзидана и пирогенала.

Через 4 дня после окончания курса инъекций обзидана и (или) пирогенала (на 11-й день после введения аллоксана) животных забивали. В полученной крови изучали содержание глюкозы, молочной кислоты, свободных жирных кислот (СЖК), холестерина, триглицеридов, креатинина, а также активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), у-глутамилтранспептидазы (ГТП) и креатинфосфокиназы (КФК).

Концентрации лактата и СЖК определяли колориметрическими методами в цельной крови [19] и ЭДТА-стабилизированной плазме [14] соответственно. Уровни холестерина, триглицеридов и креатинина так же, как активность АЛТ, ГТП и КФК, определяли в сыворотке крови на биохимическом анализаторе фирмы KONE (Финляндия). Показатели гликемии регистрировали анзимати- чески при помощи стандартных наборов реактивов ("Lachema", Чехия).

В почках животных изучали содержание молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) экстракционно-спектрофотометрическим методом [3]. В ткани скелетной мускулатуры (квадрицепс бедра) определяли общее содержание белка и гликогена с помощью микробиуретового [5] и нефелометрического [17] методов соответственно.

В отдельной серии экспериментов исследовали инсулинчувствительностъ (ИЧ) у животных с аллоксановым диабетом без фармакологической коррекции, а также на фоне введения обзидана или пирогенала. Изучение ИЧ проводили через 72 ч (на 4-й день) после инъекции аллоксана на фоне предварительного голодания в течение суток. ИЧ оценивали по латентности развития комы после внутривенного введения экзогенного инсулина (хумулин Р; "Lilly", Франция) в дозе 40 ЕД/кг [4]. В данной серии экспериментов обзидан вводили однократно в дозе 1 мг/кг непосредственно перед инъекцией инсулина, а пирогенал — в дозе 6,75 мкг/кг за 12 ч до изучения ИЧ.

Результаты обработаны статистически. О достоверности различий судили по критерию Стью- дента (/), а также по 2 критериям непараметрической статистики: Вилкоксона—Манна—Уитни (£7) и точному методу Фишера. Различия считали достоверными при р < 0,05. В качестве показателей связи между изучаемыми параметрами рассчитывали коэффициенты ранговой корреляции по Спирмену (г₅) и Кендэлу (г^).

Результаты и их обсуждение

Через 10 сут после инъекции аллоксана концентрация глюкозы в крови крыс превышала значения интактного контроля на 42 % (табл. 1), что значительно меньше прироста гликемии через 3

Таблица 1

Влияние обзидана, пирогенала и их комбинации на проявления аллоксанового диабета (М ± т)

Примечание. Звездочки — достоверность различий: одна — между группами “интактный контроль” и “аллоксановый диабет”, две — между группами “аллоксановый диабет” и “аллоксановый диабет на фоне применения фармпрепаратов”. Достоверность различий оценивали при помощи t- и ^/-критериев, а также точного метода Фишера. Содержание гептанэкстрагируемых продуктов ПОЛ выражено в условных единицах индекса окисления, который рассчитывали как отношение оптических плотностей Е232/Е220 для первичных молекулярных продуктов липопероксидации (диеновых коньюгатов) и как Е278/Е220 для вторичных молекулярных продуктов ПОЛ (кетодиенов и сопряженных триенов).

дня после индукции диабета [5]. У крыс, получавших аллоксан за 10 дней до забоя, уровень циркулирующих триглицеридов не отличался от контроля (см. табл. 1), в то время как через 72 ч после введения аллоксана их уровень возрастал более чем в 5 раз по сравнению с таковым у интактных крыс [5]. Показатели ферментемии также оставались неизменными к изучаемому сроку, хотя на 4-й день аллоксанового диабета сывороточная активность АЛТ и ГТП возрастала более чем вдвое [5]. Таким образом, правомерно констатировать компенсацию острых метаболических расстройств и энзимологических признаков повреждения печени к 11-м суткам с момента индукции диабета. О компенсации метаболических сдвигов в поздние сроки экспериментального диабета свидетельствует также увеличение содержания гликогена в мышцах с 322,41 ± 47,78 мг/100 г в контроле (и = 9) до 364,20 ± 34,77 мг/100 г через 10 дней после введения аллоксана (п = 9; р < 0,05). Стоит добавить, что в другой серии экспериментов через 3 сут с момента инъекции аллоксана уровень гликогена в скелетной мускулатуре оказался сниженным со 188,0 ± 15,11 мг/100 г в контроле (п = 9) до 134,60 ± 25,62 мг/100 г (п = 9; р < 0,05). Ни одно из исследованных фармакологических воздействий не оказывало влияния на содержание гликогена в мышцах крыс больных диабетом (данные не представлены).

В основе описанной компенсации, по-видимо- му, лежит характерная для аллоксанового диабета регенерация панкреатических р-клеток,протекающая с образованием de novo островков, содержащих исключительно р-эндокриноциты [12]. Не исключено также, что относительная нормализация изученных показателей связана с гибелью наиболее чувствительных к аллоксану животных (в период с 4-х по 11-е сутки погибли 4 (30,77%) из 13 крыс с экспериментальным диабетом). Вследствие этого среди выживших к изучаемому сроку крыс могут преобладать особи, резистентные к диабетогенному действию аллоксана. Ни одно из исследованных фармакологических воздействий не оказывало значимого влияния на летальность больных диабетом крыс (данные не представлены).

Несмотря на вышеописанное смягчение проявлений диабета, к 11-м суткам с момента введения аллоксана у крыс развивалась отчетливая гиперхолестеринемия (см. табл. 1). Важно заметить,что через 3 дня после введения аллоксана в связи с повреждением печени и нарушением ее холесте- ринсинтезирующей функции концентрация циркулирующего холестерина уменьшалась на 44 % [5]. По-видимому, уже обсуждавшаяся компенсация аллоксаниндуцированного повреждения печени может иметь отношение к феномену поздней гиперхолестеринемии у крыс с экспериментальным диабетом.

Как известно, гиперхолестеринемия и сопутствующая гипергликемия являются факторами, способствующими развитию ангиопатий при диабете [2]. Вероятно, диабетическая микроангиопатия и обусловленное ею нарушение микроциркуляции являются причиной 8-кратного прироста содержания переокисленных липидов в почках крыс, получавших аллоксан (см. табл. 1). Значимость данного феномена иллюстрируется параллельным приростом циркулирующего креатинина почти на 1/3 от контрольного уровня (см. табл. 1). При этом была выявлена прямая корреляция между содержанием гептанрастворимых диеновых конъюгатов в ткани почек и концентрацией креатинина в крови (г₅ = 0,893; л = 7; р < 0,05). Эти факты позволяют констатировать развитие диабетической нефропатии и нарушение фильтрационной функции почек на 11-е сутки после введения аллоксана. Причастность гиперхолестеринемии к нарушению функции почек при экспериментальном диабете иллюстрируется прямой корреляцией между содержанием в крови холестерина и креатинина (г₅ = 0,898; п = 8; р < 0,02).

Таблица 2

Влияние обзидана и пирогенала на инсулинчувствительность крыс через 72 ч после введения аллоксана

Примечание. Достоверность различий оценивали при помощи точного метода Фишера. * — достоверные различия с группой “аллоксановый диабет”.

Троекратное введение обзидана привело к статистически достоверному снижению содержания глюкозы и креатинина в крови животных с аллоксановым диабетом (см. табл. 1). Уровень продуктов ПОЛ в ткани почек также проявлял видимую тенденцию к снижению, которая, однако, не достигла статистической значимости из-за выраженного варьирования соответствующих показателей при диабете без медикаментозной коррекции. Основной причиной наблюдаемого смягчения диабетической нефропатии, по-видимому, следует считать уменьшение гипергликемии у крыс, получавших обзидан. О правомерности этого предположения свидетельствует прямая корреляция между уровнем гликемии и концентрацией циркулирующего креатинина (г₅ = 0,861; п = 10; р < 0,01).

В основе диабеткорригирующего эффекта обзидана может лежать его инсулинсенсибилизи- рующее действие в отношении резидуальных количеств эндогенного гормона. Правомерность данного предположения иллюстрируется не только уменьшением гипергликемии, но и снижением концентрации циркулирующих СЖК (см. табл. 1), что можно расценить как проявление антили- политической активности инсулина [2].

С целью проверки справедливости приведенных рассуждений мы оценили латентность инсулиновой комы при аллоксановом диабете без медикаментозной коррекции и на фоне инъекции обзидана. Установлено, что через 72 ч после индукции диабета, на фоне максимально выраженной гипергликемии [5], латентность инсулиновой комы возрастает с 156,4 ± 10,3 мин в контроле (п = 9) до 244,7 ± 9,4 мин (/г = 3; р < 0,001). У остальных 7 крыс, получавших аллоксан, не удалось добиться развития инсулиновой комы. Столь очевидное снижение ИЧ при аллоксановом диабете позволило нам в дальнейшем считать инсулинрезистентными тех животных, у которых инсулиновая кома не развивалась в течение 240 мин после введения экзогенного гормона (табл. 2). Как видно, однократная инъекция обзидана купировала вторичную инсулинрезистент- ность, причем средняя латентность комы в данной экспериментальной группе даже проявляла тенденцию к снижению относительно показателей интактного контроля (109,8 ± 24,6 мин против 151,6 ± 11,4 мин в обоих случаях; п = 5; р> 0,05).

Наряду с несомненно позитивными эффектами обзидана при диабете нами были отмечены некоторые негативные последствия его действия. Так, в крови крыс, получивших курс инъекций обзидана, достоверно возрастала концентрация молочной кислоты (см. табл. 1). Это может быть связано с "отменой” p-адренозависимой стимуляции ферментов тканевого дыхания [8], что увеличивает риск возникновения лактацидемической комы на фоне приема p-адреноблокаторов при диабете [2]. Кроме того, курсовое введение обзидана при экспериментальном диабете сопровождалось увеличением активности КФК в сыворотке крови (см. табл. 1). Стоит добавить, что в соответствующей группе животных наблюдалась отрицательная корреляция между содержанием белка в скелетной мускулатуре и активностью КФК сыворотки крови (г_к — —1,0; и = 6; р < 0,01). Отмеченные факты свидетельствуют о повреждении скелетной мускулатуры, причиной которого может являться нарушение баланса между вазодилататорными (Р₂-адренозависимыми) и вазоконстрикторными (oq-адренозависимыми) эффектами эндогенных катехоламинов [1], что ведет к уменьшению гемоперфузии в мышечной ткани и гипотрофии мышц при стрессе, сочетающемся с введением р-адре- ноблокаторов [13, 16]. Интересно заметить, что сочетание троекратного иммобилизационного стресса с инъекциями значительно меньшей дозы обзидана (0,45 мг/кг) не только оптимизировало диабетпрофилактическое действие троекратного иммобилизационного стресса [5], но и вызывало статистически значимое снижение содержания мышечного белка через 3 дня после индукции аллоксанового диабета. Так, в группе интактного контроля содержание мышечного белка составило 224,42 ± 10,84 мг/г (п = 5), у крыс получавших аллоксан (200 мг/кг) без предварительного стресса и на фоне предшествующей троекратной иммобилизации, уровень белка остался неизменным (245,08 ± 9,77 и 233,81 ± 6,09 мг/г; п = 7 и /7 = 8 соответственно; р > 0,05), а у животных, получавших обзидан на фоне стресса с последующей инъекцией аллоксана, количество мышечного белка оказалось достоверно сниженным по сравнению с крысами, которым вводили только аллоксан (194,5 ± 8,99 мг/г; п = 8; р < 0,01). Ни одно из испытанных фармакологических воздействий, так же как инъекция аллоксана, не влияло на содержание белка к 11-м суткам после индукции диабета (данные не представлены).

Ежедневное внутримышечное введение пирогенала в период с 4-х по 6-е сутки аллоксанового диабета не сопровождалось нормализацией изученных параметров (см. табл. 1). Более того, уровень гликемии проявлял тенденцию к дальнейшему нарастанию, а концентрация молочной кислоты достоверно увеличивалась в сравнении с таковой у животных, не получавших пирогенала. Отмеченные неблагоприятные эффекты пирогенала нивелировались при его совместном введении с обзиданом. Необходимо добавить, что однократная инъекция пирогенала в отличие от обзидана не устраняла инсулинрезистентность на 4-е сутки после индукции диабета (см. табл. 2).

Вполне возможно, что диабетотягощающие эффекты пирогенала при диабете связаны со способностью этого липополисахаридного препарата стимулировать систему мононуклеарных фагоцитов, активация которой сопряжена с секрецией интерлейкина-1 (ИЛ-1) и фактора некроза опухолей [18]. Как известно, высокие концентрации данных цитокинов оказывают повреждающее действие на панкреатические р-клетки [2, 18], что может усилить диабетогенные эффекты аллоксана. По-видимому, в данном конкретном случае аллоксанпотенцирующее действие упомянутых цитокинов превалирует над известной из литературы способностью низких концентраций ИЛ-1 усиливать секрецию инсулина [2, 18] и гипогли- кемизирующим эффектом ИЛ-1 при аллоксановом диабете [7]. С другой стороны, фактор некроза опухолей, будучи известным медиатором шока [6], может приводить к соответствующим нарушениям гемодинамики, что в свою очередь ведет к развитию лактатацидоза А-типа [2]. Вполне вероятно, что подобный механизм ведет к приросту концентрации молочной кислоты в крови животных, получавших пирогенал на фоне аллоксанового диабета.

Изученные фармакологические препараты и их комбинация не оказали статистически значимого влияния на выраженность гиперхолестеринемии, содержание циркулирующих триглицеридов и активность маркерных ферментов повреждения печени к 11-м суткам после введения аллоксана (см. табл. 1).

Выводы

1. Троекратное введение обзидана в дозе 1 мг/кг в период с 4-х по 6-е сутки после индукции аллоксанового диабета способствует уменьшению гипергликемии и гиперкреатининемии.Однократное введение обзидана в той же дозе через 72 ч после инъекции аллоксана купирует вторичную инсулинрезистентность.
2. Повторная инъекция обзидана на фоне аллоксанового диабета вызывает повреждение скелетной мускулатуры, проявляющееся увеличением сывороточной активности КФК, которая отрицательно коррелирует с общим содержанием мышечного белка. Инъекции обзидана на фоне стресса, предшествующего введению аллоксана, вызывают снижение общего содержания белка в скелетных мышцах крыс.
3. Повторное введение обзидана при экспериментальном сахарном диабете вызывает увеличение содержания молочной кислоты в крови.
4. Троекратное введение пирогенала в дозе 6,75 мкг/кг в период с 4-х по 6-е сутки после индукции аллоксанового диабета увеличивает концентрацию молочной кислоты в крови. Однократное введение пирогенала к той же дозе через 3 сут после инъекции аллоксана не влияет на выраженность вторичной инсулинрезистентности.