Особенности функционирования гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы при старении у самок обезьян

В последние годы увеличивается интерес исследователей к использованию лабораторных приматов старого возраста в качестве экспериментальной модели для изучения этиопатогенеза дегенеративных заболеваний человека, таких как болезнь Альцгеймера, цереброваскулярные заболевания, возрастная патология репродуктивной системы, сахарный диабет II типа и др. Однако в литературе имеются лишь немногочисленные сведения, отражающие процесс физиологического старения обезьян, в том числе характер возрастных изменений функции эндокринных желез.

В настоящей работе представлены результаты изучения возрастных особенностей функционирования гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС), занимающей центральное положение в интеграции процессов неспецифической адаптации организма к стрессорным факторам, у самок макак резусов.

Материалы и методы

В опытах использовали 5 молодых фертильных самок макак резусов (Macaca mulatta) в возрасте 6—9 лет (средний возраст 7,9 ± 0,6 года) массой тела 5,9 ± ± 0,6 кг и 5 старых животных того же пола и вида в возрасте 20—26 лет (средний возраст 22,2 ± 0,6 года) массой тела 5,9 ± 0,3 кг, содержащихся в Адлерском приматологическом центре. Перед началом эксперимента в течение 2 нед животные адаптировались к условиям содержания в метаболических клетках и процедуре взятия крови.

Функциональное состояние ГГАС у обезьян оценивали в базальных условиях, на фоне стрессовых воздействий и функционального теста с дексаметазоном. Для оценки базальных уровней надпочечниковых гормонов у всех животных на протяжении эксперимента брали кровь из локтевой или бедренной вен в 9 ч 30 мин—10 ч 30 мин. Кроме того, дополнительно исследовали циркадные ритмы секреции кортикостероидов, для чего образцы крови брали в 9, 15 и 21 ч.

В качестве стрессовых воздействий использовали гипогликемию, индуцированную введением инсулина, и ограничение подвижности животных. Инсулин кратковременного действия (хумулин Р; фирма "Lilly”, Франция) вводили в дозе 0,2 ЕД/кг массы тела внутривенно в 9 ч 30 мин—10 ч 30 мин. Кровь при этом брали до введения препарата (0 мин), а также через 30, 60, 120 и 240 мин после введения.

Ограничение подвижности обезьян достигалось прижатием их к передней стенке метаболической клетки путем перемещения задней подвижной стенки и продолжалось в течение 2 ч. При этом животное обычно находилось в вертикальном положении, конечности и туловище не были жестко фиксированы. Кровь брали сразу после прижатия животных (О мин), а также через 30, 60, 120 и 240 мин после начала стрессирования.

Дексаметазон (фирма KRKA, Словения) вводили в утренние часы (9 ч 30 мин—10 ч 30 мин) внутримышечно в дозе 4 мг/сут в течение 2 сут. Кровь брали до введения препарата (0 мин), а также через 1, 2 и 3 сут после введения.

Все полученные образцы крови центрифугировали для получения плазмы, которую впоследствии хранили при —20°С до проведения гормонального и биохимического анализа. В плазме крови определяли содержание кортизола (F), дегидроэпиандростерона сульфата (ДЭАС) вместе с дегидроэпиандростероном (ДЭА) и глюкозы. Концентрацию F измеряли прямым радиоиммунологическим методом, разработанным на основе специфичной антисыворотки (фирма ’’Sigma”, США) и [1, 2, 6, 7-ЗН]-кортизола ("Изотоп”, Санкт-Петербург). Чувствительность метода составляет 15 нг/мл. Содержание ДЭАС определяли иммуноферментным твердофазным методом с помощью наборов фирмы "Bio-Rad Laboratories”, предварительно адаптированным к плазме крови самок макак резусов. Чувствительность метода определения ДЭАС составляет 11 нг/мл. Коэффициент вариации значений F и ДЭАС в пределах одной реакции не превышал 10%, разных реакций — 12%. Уровень глюкозы определяли глюкозооксидазным методом (фирма "Lachema", Чехия).

Статистическую обработку данных проводили по Стыоденту. Расчет площади ответа F и ДЭАС на острое стрессовое воздействие проводили по формуле трапеций [1].

Результаты и их обсуждение

Сравнительный анализ базальных уровней F в плазме периферической крови у старых и молодых самок обезьян позволил выявить отсутствие достоверных возрастных различий (765 ± 41 нмоль/л у молодых против 748 ± 36 нмоль/л у старых). Не выявлено существенных возрастных различий и в характере циркадного ритма F (рис. 1). Следует, одна-

Рис. 1. Суточный ритм содержания F (Л/ ± /и) в периферической крови у 6—9-летних (о: п = 5) и 20—26-летних (6; п = 5) самок макак резусов.

По оси ординат — изменение концентрации Г в плазме периферической крови в разное время суток по отношению к содержанию F в 9 ч (в %); по оси абсцисс — время суток (в ч).

1 а Ол и ца 1

Динамика концентрации F в плазме периферической крови у молодых (6—9 лет; п = 5) и старых (20—26 лет; /1 = 5) самок макак резусов в ответ на введение инсулина (хумулин Р; 0,2 ЕД на 1 кг массы тела внутривенно) (М ± т)

ко, подчеркнуть наблюдаемую тенденцию к повышению уровня F у старых животных в 15 ч.

Оценка реакции коры надпочечников на острое стрессовое воздействие в виде инсулининдуцированной гипогликемии также не обнаружила достоверных возрастных различий (табл. 1), что свидетельствует прежде всего о сохранении кортикотропных резервов гипофиза у старых животных.

Однако использование другого вида стрессового воздействия — ограничения подвижности — мощного психоэмоционального стрессора у обезьян — позволило выявить наличие у самок макак резусов возрастных различий в характере функционирования адреналовых желез (рис. 2). В ответ на ограничение подвижности уровень F в крови у молодых животных увеличивался более стремительно и на более значительную величину. Так, максимальных значений концентрация F в группе молодых животных достигала через 30 мин после начала стрессирования, в то время как у старых — только через 60 мин. Суммарное же повышение уровня F за исследуемый 4-часовой период (площадь ответа) у молодых обезьян достоверно превышало аналогичные показатели у старых животных (2110 ± 240 нмоль/л • ч и 155 ± 6% • ч у молодых самок против 1160 ± 120 нмоль/л • ч и 18 ± 3% • ч у старых соответственно; р < 0,001).

Следует отметить, что в обеих группах животных реакция на ограничение подвижности была более выраженной, чем на индуцированную введением инсулина гипогликемию. Так, в условиях ограничения подвижности увеличение уровня F у молодых обезьян за 4-часовой период в среднем почти в 6 раз превышало соответствующие значения в крови у тех же обезьян, индуцируемые введением инсулина (2110 ± 240 нмоль/л • ч против 355 ± 30 нмоль/л • ч, р < 0,001). У старых животных аналогичные показатели различались приблизительно в 3 раза (1160 ± 120 нмоль/л • ч против 400 ± 40 нмоль/л • ч; р < 0,001). По-видимому, ограничение подвижности является более мощным стрессорным фактором у макак по сравнению с инсулининдуцированной гипогликемией.

Наблюдаемые возрастные различия в реакции коры надпочечников на ограничение подвижности, возможно, обусловлены различиями в реактивности животных молодого и старого возраста на

Рис. 2. Динамика содержания F (/) и ДЭАС (2) в периферической крови (Л/ ± т) и процент его изменения (Л/ ± т) у 6— 9-летних (/; п = 5) и 20—26-летних (II; п = 5) самок макак резусов в ответ на острое стрессовое воздействие (ограничение подвижности).

По осям ординат: слева — концентрация F и ДЭАС (в нмоль/л • I0³), справа — изменение концентрации F и ДЭАС (в %); по осям абсцисс — время от начала стрессового воздействия (в мин).

* — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 по сравнению с соответствующими значениями в группе молодых животных.

данный вид стрессора. У 20—26-летних самок ограничение подвижности, по-видимому, является более слабым стрессорным фактором ("повидали многое в жизни"), чем у 6—9-летних. В пользу этого предположения могут свидетельствовать данные о сходном характере реакции ГГАС у старых и молодых обезьян в ответ на стрессовое воздействие одинаковой силы — гипогликемию, индуцированную введением инсулина. Как видно из табл. 2, динамика уровня глюкозы в ответ на введение стандартной дозы инсулина у молодых и старых животных носила сходный характер. Однако возрастные различия в реакции коры надпочечников обезьян на ограничение подвижности могут отражать и ослабление способности ГГАС старых обезьян к адекватной реакции на мощное стрессовое воздействие.

Базальные уровни ДЭАС — другого важнейшего кортикостероида, имеющего важное значение в интеграции процессов неспецифической адаптации организма к стрессовому воздействию, в отличие от F существенно снижались при старении. Так, если в группе 6—9-летних животных средний базальный уровень ДЭАС достигал 1330 ± 130 нмоль/л, то у старых животных он составлял лишь 550 ± 30 нмоль/л (р< 0,001).

Существенные возрастные различия наблюдались у обезьян и в отношении реакции ДЭАС на ограничение подвижности (см. рис. 2). Повышение уровня ДЭАС за 4-часовой период после начала иммобилизации у молодых животных составляло 1210 ± 130 нмоль/л • ч, а у старых обезьян — всего 425 ± 25 нмоль/л • ч.

Снижение концентрации ДЭАС у старых животных в базальных условиях и при стрессе приводило к резкому изменению соотношения F/ДЭАС в плазме периферической крови при старении. Так, если отношение концентрации F к концентрации ДЭАС в базальных условиях у молодых животных составляло в среднем 0,6 ± 0,05, то у старых обезьян оно возрастало до 1,6 ± 0,1 (р < 0,001). При стрессе это соотношение показателей площади ответа F за 4-часовой период после начала иммобилизации к значениям суммарного повышения уровня ДЭАС за тот же интервал времени составляло у старых обезьян 2,7 ± 0,3 нмоль/л • ч, а у молодых — 1,7 ± 0,1 нмоль/л * ч О < 0,001).

Таким образом, при старении в плазме периферической крови у самок макак резусов развивается выраженный дисбаланс в уровне основных кортикостероидных фракций (F и ДЭАС), выражающийся в увеличении удельного веса кортизола, т. е. формируется относительная гиперкортизолемия. Сходная закономерность отмечена у людей [4, 9], а также у павианов [2—4, И].

Заметные возрастные нарушения наблюдались и в характере функционирования гипоталамо-гипофизарного звена ГГАС. Об этом свидетельствуют результаты теста с дексаметазоном. Следует заметить, что в зависимости от реакции коры надпочечников на введение дексаметазона животных обеих возрастных групп можно было разделить на 2 подгруппы — более и менее чувствительные к препарату (по 3 и 2 животных в каждой подгруппе соответственно). Как видно на рис. 3, уровень F у 3 молодых животных через 1 и 2 сут снижался до значений, соответствующих чувствительности используемого метода, т. е. 41 нмоль/л (15 нг/мл), что составляло менее 5% от базального уровня. В то же время значения F в периферической крови у старых самок через 1 и 2 сут после введения дексаметазона были значительно выше (130 ± 30 и 110 ± ± 20 нмоль/л соответственно) и составляли 13 ± 4 и 11 ± 4% от исходных концентраций.

Сходные возрастные различия в чувствительности ГГАС к дексаметазону отмечены и у обезьян, вошедших в подгруппы менее чувствительных к дексаметазону животных. Так, снижение уровня F в ответ на введение стандартной дозы дексаметазона у старых самок было менее выраженным по сравнению с молодыми животными. Как видно на рис. 3, уровни F через 1 и 2 сут у 6—9-летних животных составляли соответственно 30 и 15% (1а; № 4001) и 19 и 5% (16; № 30410), в то время как у

Таблица 2

Динамика концентрации глюкозы в плазме периферической крови у молодых (6—9 лет; п = 5) и старых (20—26 лет; п = 5) самок макак резусов в ответ на введение инсулина (хумулин Р; 0,2 ЕД на 1 кг массы тела внутривенно) (М ± т)

Рис. 3. Содержание F в периферической крови (а) и процент его изменения (б) в процессе введения дексаметазона (по 4 мг в течение 2 сут) 6—9-летним (/; п = 3) и 20—26-летним (77; п = 3) самкам макак резусов.

По осям ординат: слева — концентрация F (в нмоль/л • 100), справа — % изменения концентрации F (в % • 10); по осям абсцисс — время от начала введения дексаметазона (в сут). /а, 16, На, Пб — процент изменения содержания F у молодых {1а, [б\ № 4001 и 30410) и старых {Па, Пб, № 14S59 и 15645) животных, составивших подгруппы менее чувствительных к дексаметазону животных. * — р < 0,001 по сравнению с исходным уровнем.

20—26-летних — 69 и 13% (Па; № 14859) и 48 и 44% (Пб; N 15645).

Представленные данные свидетельствуют о понижении у старых самок макак резусов чувствительности ГГАС к ингибирующему действию глюкокортикоидов по механизму отрицательной обратной связи. Сходные данные были получены для грызунов 110] и человека [7]. По мнению ряда авторов [10], в основе подобных нарушений у крыс лежит токсическое действие повышенных концентраций глюкокортикоидов, регистрируемых у старых грызунов, на глюкокортикоидчувствительные клетки гиппокампа, сопряженные с гипоталамическими центрами секреции кортиколиберина. Снижение возрастной чувствительности гипоталамуса у приматов, по-видимому, обусловлено снижением при старении концентраций ДЭА (ДЭАС), надпочечниковая секреция которых чрезвычайно мала для грызунов. Согласно современным данным, ДЭА (ДЭАС) в ряде случаев оказывает антагонистическое по отношению к F действие [5], и его введение препятствует развитию нейродегенеративных изменений [6, 8].

Выводы

1. Базальные уровни F в периферической крови у самок макак резусов не претерпевают существенных возрастных изменений, в то время как концентрация ДЭАС при старении резко снижается.
2. У старых обезьян регистрируется менее выраженная по сравнению с молодыми животными реакция коры надпочечников на острое стрессовое воздействие (ограничение подвижности), выражающаяся в задержке максимальных значений секреции F и снижении площади ответа со стороны F и ДЭАС.
3. При старении у самок макак резусов развивается относительная резистентность ГГАС к подавляющему действию глюкокортикоидов по механизму отрицательной обратной связи.