Иммунологические подходы к предикции инсулинзависимого сахарного диабета

Известно, что в основе патогенеза инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД) лежит аутоиммунная деструкция бета-клеток поджелудочной железы [1]. Дальнейшее изучение ИЗСД показало, что продромальной стадии данного заболевания соответствует период постепенно развивающегося аутоиммунного воспаления островков (инсулина) и деструкции инсулинпродуцирующих бета-клеток, не сопровождающийся в течение длительного времени клиническими признаками ИЗСД [2].

В 1975 г. G. Botazzo и соавт. впервые выявили у больных ИЗСД циркулирующие аутоантитела к цитоплазматическим антигенам островковых клеток (1СА) [9|, а N. Maclaren и S. Huang — аутоантитела к поверхностным антигенам островковых клеток |5|. Palmer в 1983 г. обнаружил в сыворотке больных с впервые выявленным ИЗСД аутоантитела к инсулину (IAA). Описаны случаи выявления ICA и IAA за 8 лет и более до появления клинических признаков ИЗСД [10]. Таким образом, по определению циркулирующих специфических аутоантител у пациентов появилась возможность реально предсказывать развитие клинических признаков ИЗСД. В большинстве случаев у лиц с ИЗСД выявляются аутоантитела к бета-клеткам островков Лангерганса поджелудочной железы (ICA) и аутоантитела к инсулину (IAA) [6]. У больных с впервые выявленным ИЗСД ICA встречаются в 70% случаев [6], IAA — в 20—50% [12]. У пациентов с наличием ICA наблюдается прогрессивное снижение функциональной активности бета-клеток, что проявляется в нарушении ранней фазы секреции инсулина [4]. При деструкции 80% инсулинпродуцирующих клеток появляются клинические признаки ИЗСД.

Для определения аутоантител наиболее часто используют метод иммунофлюоресценции и иммуноферментный анализ. Разработаны методы обнаружения в сыворотке больных циркулирующих аутоантител к антигенам островковых клеток с использованием срезов поджелудочной железы или культуры островковых клеток человека или грызунов [9, 11]. Референс-методом определения 1САдо сих пор остается метод иммунофлюоресцентного окрашивания криосрезов поджелудочной железы человека 1(0) группы крови, однако данный метод трудоемок и плохо поддается стандартизации [7]. В последние годы были идентифицированы конкретные молекулы бета-клеток, в отношении которых развивается аутоиммунный ответ и появляются аутоантитела при ИЗСД. Это прежде всего глутаматдекарбоксилаза [6] или антиген с мол. массой 64 кД — р64, а также тирозинфосфатаза — IA-2 (ICA-512) и инсулин [8]. Иммуноферментный метод определения аутоантител к этим структурам бета-клеток поджелудочной железы имеет ряд преимуществ перед иммунофлюоресцентным методом на криосрезах, так как менее трудоемок, более чувствителен и легко стандартизуем. В настоящее время появились коммерческие наборы ряда фирм (’’Biomerica”, "1MMC0 Diagnostics” и др.) для определения циркулирующих аутоантител к островковым клеткам.

Выявление доклинической стадии ИЗСД позволит остановить или отсрочить развитие явного ИЗСД с нарушением показателей углеводного обмена [3]. Проблема изучения ранних стадий заболевания представляется актуальной в связи с возможностью активного воздействия на механизмы, способствующие развитию сахарного диабета.

Цель нашего исследования заключалась в изучении эффективности ряда подходов к определению аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы в клинической практике у больных с различными нарушениями углеводного обмена: ИЗСД, инсулиннезависимым сахарным диабетом (ИНСД), нарушением толерантности к легкоусвояемым углеводам, а также в группе риска различными методами.

Материалы и методы

Обследовано 150 больных в возрасте от 10 до 60 лет с длительностью заболевания от 1 мес до 15 лет. ИЗСД отмечен у 58 больных (в том числе у 24 впервые выявлен), ИНСД — у И, группа риска состояла из 67 сибсов, нарушение толерантности к легкоусвояемым углеводам наблюдалось у 14 пациентов. Контрольную группу составили 50 здоровых доноров.

Для определения аутоантител к цитоплазматическим структурам бета-клеток (ICA) в сыворотках крови пациентов и здоровых доноров использовали вариант реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием криосрезов поджелудочной железы донора с неотягощенным эндокринологическим анамнезом в возрасте 45 лет, группа крови I (0). Кусочки ткани замораживали в жидком азоте. С помощью криотома ’’LEITZ” на предметных стеклах готовили криосрезы толщиной 3 мкм с последующей фиксацией в ацетоне при 4°С (2 мин). Срезы служили в качестве антигена для тестирования исследуемых сывороток на присутствие специфических аутоантител. Исследуемые сыворотки больных разводили в соотношении 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40 в физиологическом растворе, забуференном фосфатами pH 7,2 (PBS), и инкубировали во влажной камере с соответствующими разведениями сывороток 1 ч при комнатной температуре. Срезы 5 раз промывали PBS и наносили FITC-меченную антисыворотку кролика против иммуноглобулинов G человека (RaH-FITC) ”Dako”. Инкубировали во влажной камере 30 мин при комнатной температуре, 5 раз промывали PBS, заключали в смесь глицерин: PBS (1 : 1) и накрывали покровными стеклами. Учет реакции иммунофлюоресценции проводили с помощью флюоресцентного микроскопа Axioskop ("Opton”). В качестве отрицательного контроля реакции использовали сыворотку крови здорового донора, не содержащую аутоантител, в качестве положительного контроля — сыворотку, содержащую 1СА у больного с впервые выявленным ИЗСД. Параллельно определяли ICA и IAA иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы "Biomerica” под торговой маркой ’’Isletest” в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследования уровня ICA в сыворотках пациентов с различными вариантами нарушений углеводного обмена, а также улиц группы риска представлены в табл. 1.

Как видно из данных, приведеных в табл. 1, определение ICA на криосрезах у 150 больных с помощью иммунофлюоресцентного метода показало высокую выявляемость в группах больных с ИЗСД с длительностью заболевания до 2 лет и более 2 лет: ICA выявлены в 67 и 62% случаев соответственно, а в группе лиц с нарушением толерантности к углеводам — в 35,7% случаев. В группе риска 1СА выявлены в 19,4% случаев, в группе доноров ICA не определялись. У больных с первичным диагнозом ИНСД ICA выявлены в 9% случаев. ’’Isletest” использовали при обследовании этих же больных. В результате обследования максимальная частота выявляемости ICA зафиксирована в группе лиц с ИЗСД длительностью до 2 лет (50) и более 2 лет (37%). Более низкий уровень выявляемости ICA отмечен у пациентов с нарушением толерантности к легкоусвояемым углеводам (28,6%), больных ИНСД (18%), сибсов (10%), здоровых доноров (4%) (см. табл. 1). При выявлении аутоантител к инсулину (IAA) максимальная частота выявления (46%) зарегистрирована в группе больных ИЗСД с длительностью заболевания до 2 лет; при длительности заболевания более 2 лет IAA выявлены в 35% случаев, при нарушении толерантности к легкоусвояемым углеводам — в 14%, при ИНСД — в 9%, в группе риска — в 22,5%, в группе здоровых доноров — в 2% случаев (см. табл. 1).

Полученные результаты подтверждают высокую специфичность ICA и IAA для больных ИЗСД (особенно при впервые выявленном заболевании). Кроме того, имеется общая тенденция к уменьшению частоты выявления ICA обоими методами с

Таблица 1

Выявляемость ICA и IAA у больных с различными нарушениями углеводного обмена

* Для больных ИЗСД длительностью более 2 лет выявляемость ICA первым методом (на криосрсзах) значимо выше (61,8%), чем вторым методом "Isletest" (37%) (р < 0,05).Выявляемость ICA и IAA у больных ИЗСД в завимости от длительности заболевания

* Для больных ИЗСД с длительностью заболевания менее 1 года выявляемость ICA на криосрезах составила 66,7%, более 5 лет — 35,7% (р < 0,05).

Таблица 3

Выявляемость ICA и IAA у больных ИЗСД в различных возрас тных группах

* Наблюдается достоверно значимое различие в выявляемости ICA у больных ИЗСД для 2 возрастных групп — младше 16 лет (100%) и старше 40 лет (40%) (р < 0,05).

увеличением длительности заболевания. С увеличением возраста пациентов отмечена тенденция к увеличению выявляемости ICA в "Isletest” (хотя различие недостоверно из-за ограниченности выборки). Выявляемость же 1СА на криосрезах с помощью иммунофлюоресцентного метода при увеличении возраста пациентов достоверно уменьшается (табл. 2, 3).

Частота выявления IAA также снижается с увеличением длительности ИЗСД и возраста пациента (см. табл. 2, 3). Различий в выявляемости аутоантител у больных ИЗСД в зависимости от пола не обнаружено (рис. 1).

Метод определения ICA на криосрезах поджелудочной железы человека показал достаточно высокую специфичность у больных с ИЗСД длительностью до 2 лет (67%).

По данным литературы [9] и согласно инструкции, специфичность "Isletest" позволяет выявить до 75% лиц с дебютом ИЗСД. Однако при определении ICA этим методом в нашем исследовании только в 50% случаев получены положительные результаты у больных с впервые выявленным ИЗСД. Нами обнаружена неконкордантность групп больных, выявленных двумя методами определения ICA. Она была характерна для всех групп исследуемых пациентов. При ИЗСД длительностью до 2 лет выявляемость ICA при суммировании результатов обоих способов определения достигает 100%, более 2 лет — 79,4% (рис. 2). Таким образом, одновременное определение ICA двумя описанными методами позволяет увеличить чувствительность определения ранних стадий ИЗСД.

Вместе с тем клинический диагноз ИЗСД не может базироваться исключительно на результатах иммунодиагностики, а должен опираться также на совокупность клинических, анамнестических и генетических факторов. Дальнейшее применение методов определения ICA и IAA позволит разработать скрининговые программы для тестирования групп лиц с повышенным риском развития ИЗСД, прежде всего в семьях, где болен один из родителей или детей. Эффективная доклиническая диагностика ИЗСД имеет большое практическое значение и необходима для своевременного начала наблюдения за пациентами и принятия ряда терапевтических мер с целью превенции или отсрочки клинической манифестации ИЗСД при относительно сохранной функции бета-клеток.

Рис. 1. Зависимость уровня выявляемости (в %) ICA от пола больных ИЗСД.

/ — длительность ИЗСД до 2 лет; 2— длительность ИЗСД более 2 лет. а — лица мужского пола; б — лица женского пола.

Рис. 2. Зависимость уровня выявляемости (в %) ICA от метода исследования.

/ — ИЗСД (длительность до 2 лет); 2 — ИЗСД (длительность более 2 лет); 3 — нарушение толерантности к легкоусвояемым углеводам; 4 — ИНСД; 5 — группа риска (сибсы).

а — 1СА на криосрезах; б — 1CA в Isletest"; в — ICA на криосрезах и ICA в "Isletest" одновременно; г — ICA на криосрезах или ICA в "Isletest".Выводы

1. Группы больных ИЗСД, выявляемые двумя методами определения ICA, неконкордантны.
2. Совместное применение двух методов определения ICA, а также определение IAA позволяет с большой точностью и чувствительностью диагностировать ИЗСД.
3. С увеличением длительности ИЗСД имеется тенденция к снижению выявляемости ICA на криосрезах иммунофлюоресцентным и иммуноферментным методом ’’Isletest”. С увеличением длительности заболевания и возраста пациентов частота выявления IAA снижается.