Экскреция сульфатированных гликозаминогликанов с мочой у больных с диабетической нефропатией

Частота развития почечной недостаточности у больных сахарным диабетом (СД) остается чрез вычайно высокой и, по данным большинства ис следований, достигает 25-30% [И]. Известно, что изменения в почках у больных СД обнаруживаются задолго до появления клиники диабетической неф ропатии (ДН). Поэтому актуальны изучение пато генеза начальных стадий ДН и разработка методов ее доклинической диагностики. Морфологическими методами установлено, что наиболее ранние и патогномоничные для ДН из менения развиваются в базальных мембранах и ме зангии клубочков [12]. Важнейшими биохимиче скими компонентами этих структур являются про теогликаны - комплексные соединения гликозо- аминогликанов (ГАГ) и белков. Функциональная роль протеогликанов состоит в обеспечении нор мальной проницаемости почечного фильтра, соз дании отрицательного заряда эндотелия, регуляции роста гладкомышечных клеток сосудов [7]. Пока зано, что при СД наблюдаются нарушения синтеза ГАГ в клубочках почек [5, 20], изменяется нор мальный состав ГАГ и соответствующих им проте огликанов в базальных мембранах [9, 18]. Степень этих изменений зависит от выраженности ДН. Известно, что нарушения метаболизма почеч ных протеогликанов сопровождаются изменения ми количества и состава ГАГ, экскретируемых с мочой [2, 20]. В связи с этим исследование глико- заминогликанурии предложено в качестве теста для диагностики и мониторинга заболеваний почек [13, 14]. В литературе имеются весьма противоречивые данные об изменениях экскреции ГАГ у больных СД: одни авторы выявили увеличение данного па раметра [8, 10], другие, напротив, зафиксировали его снижение [15]. Недостаточно изучена взаимо связь изменений обмена ГАГ с развитием ДН. С учетом этого целью нашей работы явилось изучение количества и фракционного состава экс кретируемых с мочой сульфатированных ГАГ у больных СД типов 1 и 2 на разных стадиях развития нефропатии. Материалы и методы Обследовано 55 больных СД (30 мужчин и 25 женщин) в возрасте от 16 до 63 лет (средний воз раст 34,3 ± 1,8 года). 46 обследованных страдали СД типа 1,9 - СД типа 2. Все пациенты получали инсулинотерапию. Длительность заболевания варьировала от 3 мес до 36 лет, составляя в среднем 9,8 ± 1,1 года. Большинство больных (46 человек) находились в состоянии декомпенсации углевод ного обмена. В исследование не включали боль ных, получавших в течение последнего года ГАГ- содержащие препараты (гепарины, сулодексид), а также пациентов с обострением сопутствующих заболеваний. В зависимости от наличия и выраженности ДН больные были распределены на 3 группы: в 1-ю во шли больные с нормальной экскрецией белка с мо чой, во 2-ю - пациенты с микроальбуминурией или протеинурией до 0,3 г/сут, в 3-ю - больные с Клинико-лабораторная характеристика больных СД Показатель Группа больных 1-я (л = 12) 2-я (л = 31) 3-Я (/7 = 12) Пол, мужчины/женщины 8/4 14/17 8/4 Возраст, годы 31,4 ± 4,1 36,4 ± 2,4 30,7 ± 3,2 Длительность СД, годы 7,0 ± 2,8 8,8 ± 1,2 15,1 ± 2 2** НЬ А1с, % 11,2 ± 1,3 12.1 ± 0,7 11,7 ± 1,2 АД систолическое, мм рт. ст. 128,3 ± 6,0 133,5 ± 4.9 137,9 + 4.5 АД диастолическое, мм рт. ст. 78,8 + 3.4 83.5 + 2,5 84,2 ± 2,3 Примечание. Звездочки - достоверность (р < 0,05) различий: одна - с l-й группой больных, две - со 2-й. клинически выраженной ДН. Клинико-лаборатор ная характеристика обследованных представлена в таблице. Выделенные группы были сопоставимы по половому, возрастному составу и степени ком пенсации СД. Пациенты с выраженной нефропа тией отличались большей длительностью заболева ния и тенденцией к повышению систолического и диастолического АД. Контрольную группу составили 25 человек (13 мужчин и 12 женщин), не имеющих хронических за болеваний и наследственной отягощенности по СД. Комплекс обследования включал в себя опреде ление гликемии глюкозооксидазным методом, уровня гликированного гемоглобина А] (НЬ А1с) хроматографическим методом с помощью наборов "Диабет-Тест" АО "Фосфосорб" (Россия)1, клубоч ковой фильтрации и канальцевой реабсорбции по клиренсу эндогенного креатинина, протеинурии стандартным методом с сульфосалициловой кисло той (троекратно). У больных без явной протеину рии исследовали альбуминурию иммунохимиче- ским полуколичественным методом с помощью тест-полосок "Микраль-Тест-П" фирмы "Boehring er Mannheim" (Австрия). Экскрецию суммарных сульфатированных ГАГ определяли в утренней порции мочи с помощью раствора алцианового синего 8 GX по методу Е. Gold (1981) в разработанной нами модификации [1]. Результат приводили к величине экскретируе мого креатинина и выражали в миллиграммах ГАГ на 1 ммоль креатинина. Фракционный состав ГАГ исследовали методом электрофоретического разде ления на ацетат-целлюлозных мембранах в 0,1 М барий-ацетатном буфере (pH = 4,8) по С. Pennock (1976). Для этого предварительно выделяли ГАГ из мочи осаждением цетилпиридиниум хлоридом с последующей очисткой переосаждением этанолом в присутствии солей калия. У 12 человек исследо вание уровня ГАГ проводили в динамике заболева ния (дважды). Статистическую обработку проводили с исполь зованием стандартных методов вариационной ста тистики с помощью программы Biostat. Достовер ность различий оценивали по критерию Стьюдента 'Диапазон нормальных показателей при определении дан ным методом составляет 4,4-8%. (с поправкой Бонферрони для множественных сравнений). Данные представлены как средние и ошибки их репрезентативности (М ± т). Результаты и их обсуждение Проведенное исследование показало значи тельное (в 2,5 раза) увеличение суммарной экс креции с мочой сульфатированных ГАГ у больных СД по сравнению с контролем (5,90 ± 0,38 и 2,32 ± 0,19 мг/ммоль креатинина соответственно; р < 0,001). Повышенная концентрация ГАГ в мо че обнаружена у большинства пациентов: в 87,3% случаев показатель превышал верхнюю границу доверительного интервала в контроле (1,39- 3,25 мг/ммоль). Как видно на рисунке, гипергли- козаминогликанурия наблюдалась у больных без признаков ДН. У больных с начинающейся и вы раженной нефропатией гиперэкскреция ГАГ была еще более выражена. Эти данные подтверждают ре зультаты работ, зафиксировавших повышение уровня ГАГ в моче у больных СД типов 1 [8] и 2 [10] с нефропатией. Обнаружена зависимость экскреции ГАГ от сте пени компенсации СД. Наиболее высокие показа тели наблюдали у больных с уровнем НЬА1с более 13%: 6,91 ± 0,80 мг/ммоль креатинина (при более низких значениях НЬА1с - 4,63 ± 0,29 мг/ммоль; р < 0,05). Проведенный корреляционный анализ выявил слабую положительную связь между экс крецией ГАГ и уровнем НЬА,С (г = 0,35; р < 0,05), а также среднесуточной гликемией (г =0,31; р < 0,05). Исследование содержания ГАГ в дина мике, проведенное с интервалом в 3 нед, показало, что краткосрочное улучшение компенсации угле водного обмена сопровождалось некоторым сни жением гликозаминогликанурии, однако различия показателей при 1-м и 2-м обследовании не дости гали степени статистической значимости (д > 0,05). Не отмечено зависимости концентрации ГАГ в моче от типа СД, наличия ретинопатии и артери альной гипертензии. 36 Для ответа на вопрос, какой вид ГАГ вносит наибольший вклад в увеличение суммарной экс креции данных веществ с мочой при СД, нами изу чен фракционный состав ГАГ у обследованных больных и у лиц контрольной группы. У здоровых людей основным компонентом ГАГ мочи являлся хондроитинсульфат. У 6 (24%) из 25 человек кон трольной группы наряду с хондроитинсульфатом присутствовал также гепарансульфат в качестве минорной фракции. Дерматансульфат и кератан- сульфат не выявлены ни в одном случае, что, оче видно, объясняется их крайне низкой (субпорого вой) концентрацией в моче здоровых людей. У большинства пациентов с нормальной экскре цией белка с мочой состав и соотношение фракций ГАГ существенно не менялись. Во всех случаях ос новным компонентом являлся хондроитинсульфат. Гепарансульфат присутствовал у 4 (25%) человек, причем у 2 в концентрации, близкой к концен трации хондроитинсульфата. Больные с начинаю щейся нефропатией характеризовались значитель ным увеличением экскреции с мочой гепарансуль фата. Его наличие обнаружено у 28 (90,3%) больных 2-й группы, причем в 17 (54,8%) случаях гепаран сульфат становился основной фракцией: его экскре ция приближалась к таковой хондроитинсульфата или даже превышала ее. У 7 (23,3%) пациентов дан ной группы в моче обнаружен дерматансульфат. При выраженной ДН (3-я группа) гепарансульфат был выявлен у 11 (91,7%) из 12 больных, при этом у 7 (58,3%) больных в качестве мажорной фракции. В 4 (25%) случаях в заметных количествах экскрети ровался дерматансульфат. Таким образом, у больных СД наблюдаются зна чительные количественные и качественные изме нения экскреции с мочой сульфатированных ГАГ. По мере развития ДН возрастает как суммарная экскреция ГАГ,так и доля гепарансульфата в соста ве экскретируемых фракций. Это свидетельствует о глубоких изменениях метаболизма ГАГ-содержа- щих протеогликанов у больных СД, осложненным нефропатией. Найденные нарушения, очевидно, могут быть связаны как с изменениями биосинтеза ГАГ, так и с повышением катаболизма ГАГ-содержащих ком плексов. Обнаружено, что мезангиальные клетки при СД продуцируют намного больше ГАГ,особен но дерматансульфата, чем в норме. Выраженность этого нарушения усиливается с увеличением дли тельности диабета [5]. По мере развития ДН, как свидетельствуют эксперименты, в почках аккуму лируются хондроитинсульфат и дерматансульфат [2]. Эти изменения могут иметь непосредственное отношение к формированию диабетического гло мерулосклероза, так как известно, что накопление данных ГАГ - неотъемлемое звено патогенеза склеротических процессов. Как показали наши исследования, наибольшие изменения при ДН претерпевает экскреция гепа рансульфата. Повышенная концентрация этого ви да ГАГ в моче была обнаружена и при других по ражениях почек, протекающих с протеинурией [6, 13]. Гепарансульфатсодержащие протеогликаны, как известно, являются основным полианионным компонентом базальной мембраны клубочков, ко торый определяет ее отрицательный заряд и препят ствует прохождению через почечный фильтр ней трально и отрицательно заряженных молекул, в том числе молекул альбумина. Не удивительно поэтому, что снижение содержания гепарансульфата в составе базальных мембран приводит к повышению экскре ции с мочой альбуминов, а затем и других белков. Дефицит гепарансульфата в базальной мембра не клубочков при ДН обнаружен в ряде исследова ний [7, 16]. По-видимому, данная аномалия носит универсальный характер: количество гепарансуль фата снижается не только в клубочках почек, но и в капиллярах скелетных мышц [19] и кожи [17]. Причиной данного дефекта называют снижение активности N-деацетилазы - фермента, участвую щего в биосинтезе гепарансульфата [3]. Обнару женное нами высокое содержание гепарансульфата в моче больных с ДН позволяет выдвинуть и другое предположение: потеря гепарансульфата может быть следствием повышенного распада ГАГ-содер жащих комплексов базальных мембран. Какова бы ни была причина потери гепарансульфата, резуль татом становится патологическая проницаемость почечного фильтра. Это, в частности, подтвержда ется тем, что препараты, содержащие гепарансуль фат, а также близкий ему по структуре гепарин, да ют отчетливый антипротеинурический эффект у больных с ДН [7]. Полученные данные свидетельствуют о том, что повышение экскреции гепарансульфата происхо дит уже на ранних (доклинических) стадиях ДН и наблюдается у больных с микроальбуминурией и, по-видимому, у части больных с нормоальбумину- рией. В последнем случае гиперэкскреция гепаран сульфата может указывать на наличие скрытой дис функции гломерулярного аппарата. G. Gambaro и соавт. [4] удалось показать, что чрезмерное повыше ние экскреции альбумина с мочой у таких пациентов выявляется в условиях стимуляционной пробы с ли зином. Вероятно, данная группа больных является угрожаемой по развитию нефропатии в дальнейшем и заслуживает проспективного наблюдения. В заключение необходимо отметить, что у боль ных СД исследование экскреции сульфатирован ных ГАГ с мочой в силу своей чувствительности, доступности и неинвазивности может быть допол нительным методом при проведении скрининга и мониторинга функции почек. Необходимы даль нейшие исследования для определения подходов к терапевтической коррекции нарушений обмена ГАГ при СД. Выводы 1. У больных СД типов 1 и 2 имеются нарушения метаболизма сульфатированных ГАГ, что проявляет ся значительным (в среднем в 2,5 раза) увеличением суммарной экскреции данных веществ с мочой. 2. Фракционный состав ГАГ мочи при СД зави сит от стадии нефропатии. Развитие ДН характе ризуется увеличением доли гепарансульфата и (ре же) дерматансульфата в составе экскретируемых фракций. 3. Изменения фракционного состава сульфати рованных ГАГ появляются на ранних (доклиниче ских) стадиях ДН и могут использоваться в их ди агностике.