Метаболизм L-аргинина у больных сахарным диабетом с диабетической полинейропатией и язвенными дефектами стоп

Синдром диабетической стопы (СДС) является тяжелым осложнением сахарного диабета (СД) и представляет собой серьезную медико-социальную проблему, так как приводит к образованию длительно незаживающих и рецидивирующих язв на стопе и высокой частоте ампутаций нижних конечностей. Вопросы, связанные с изучением патофизиологических механизмов, влияющих на процесс

HNO-синтаза — индуцибельная синтаза NO; aNO-CMHTaea — эндотелиальная синтаза NO; ОДК — орнитиндекарбоксилаза; ОАТ — орнитинаминотрансфераза; ОФНа — фактор некроза опухоли а; ИЛ-1 —интерлейкин-1; ИФН-у — интерферон а; ТФР-р₍ — трансформирующий фактор роста р,; ТцФР — тромбоцитарный фактор роста; ИПФР — инсулиноподобный фактор роста.

формирования и скорость репаративных процессов в области раневого дефекта, являются наименее изученными. К настоящему времени определена важная роль метаболизма L-аргинина в процессе нормального заживления

гиназой и образование L-пролина, являющегося субстратом для синтеза коллагена в тканях, и полиаминов, таких как путресцин, спермидин и спермин, играющих важную роль в регуляции роста и дифференцировки клеток, синтеза ДНК и РНК, что необходимо для регенерации тканей [2, 10].

Физиологическая обусловленность различных путей метаболизма L-аргинина была изучена в экспериментальных моделях заживления раны [3, 4, 14, 22]. Активация NO-синтазы и аргиназы происходит на разных этапах заживления раны (рис. 2). Повышенное образование реактивных азотистых оснований, в том числе и NO, полиморфноядерными лейкоцитами может опосредовать некоторые характерные для начального периода воспаления реакции, такие как микробный стаз, вазодилатация и подавление агрегации тромбоцитов. Стимуляция провоспалительными цитокинами и бактериальными липополисахаридами макрофагов также приводит к активации nNO-cHHTa3w и гиперпродукции NO, играющего бактерицидную роль в ране. В дальнейшем, при отсутствии активации hNO-синтазы (например, персистенция инфекции) происходит снижение выработки NO лейкоцитами и макрофагами. Механизмы ограничения синтеза NO в ране и переключения метаболизма L-аргинина точно не установлены. Полагают, что факторы, угнетающие активность иNO-cинтaзы, включают в себя истощение запасов L-аргинина в ране; ингибирующее влияние ТФР-р_1; ИЛ-4, ИЛ-10, глюкокортикоидов и фактора деактивации опухолевых макрофагов на nNO-синтазу [17]; снижение влияния факторов, усиливающих индукцию NO-синтазы. Однако наибольшее значение в ограничении активности NO J. Shearer и соавт. [22] приписывают ТФР-Рр Кроме того, V. Boutard и соавт. [5] показали, что ТФР-р] является важным индуктором аргиназы в ране, а также снижает цитотоксичность макрофагов.

Цель данной работы заключалась в изучении влияния метаболизма аминокислоты L-аргинина на развитие и заживление язвенных дефектов стоп у больных СД с нейропатической формой СДС.

Материалы и методы

Для решения поставленных задач было обследовано 70 пациентов (табл. 1): 27 больных СД типа 1, 23 — СД типа 2, из которых 8 получали пероральные сахароснижающие препараты (ПССП), 10 находились на комбинированном лечении инсулином и таблетированными препаратами, 32 человека получали инсулинотерапию; 20 лиц без нарушения углеводного обмена. Возраст обследуемых составлял от 27 лет до 61 года (52 (45,5; 58) года — Me (25-й процентиль; 75-й процентиль), среди них было 35 мужчин и 35 женщин. Длительность заболевания колебалась от 5 лет до 31 года (11,5 (8; 20) лет). Больные СД были разделены на 2 основные группы: больные СД с клиническими признаками диабетической полинейропатии (л = 25) и больные СД с нейропатическими язвенными дефектами стоп (л = 25). У 13 пациентов отмечено рецидиви- рование трофических язв, которые у 6 больных развивались на фоне диабетической остеоартропатии

Таблица 1 Основные клинические показатели обследуемых пациентов

При ме ча ние. Здесь и в табл. 2 данные представлены как Ме (25-й процентиль; 75-й процентиль), где Ме — медиана. М ± а, где ц — среднее по совокупности, а — стандартное отклонение.

(стопы Шарко). Язвенные дефекты I степени тяжести (по классификации F. Wagner, 1979) наблюдались у 18 больных, II степени — у 7. Магистральный кровоток по данным ультразвуковой допплерографии (аппарат "Smartdop 30" фирма "Hideco") был сохранен у всех пациентов. Всем пациентам проводили оценку степени компенсации углеводного обмена (НЬ А|_С), уровня общего холестерина (ОХС) и триглицеридов (ТГ) плазмы крови. Определение содержания НЬ А_1с проводили иммунофер- ментным методом на анализаторе АМХ (фирма "Abbott", Швеция). Уровень липидов сыворотки крови определяли ферментативным методом с помощью наборов "Boehringer-Mannhaim". Вибрационную чувствительность оценивали с помощью градуированного камертона "Riedel-Siefert" (фирма "Kircher + Wilhelm", Германия). Степень тяжести периферической нейропатии оценивали в соответствии со шкалой неврологических нарушений (Neuropathy Disability Score, NDS), разработанной R. Yang в 1986 г. и рекомендованной исследовательской группой Neurodiab при Европейской ассоциации по изучению диабета (EASD). Степень нарушения порога вибрационной чувствительности сопоставляли с наличием других форм сенсорной чувствительности (болевой, тактильной, температурной). Исследование коленных и ахилловых рефлексов проводили стандартным методом. Исследование всех видов чувствительности проводили в положении лежа на спине с закрытыми глазами.

Критериями исключения больных из исследования являлись ишемическая форма СДС (ЛПИ < 0,9); тяжелые сочетанные заболевания других органов и систем; прием лекарственных препаратов, оказывающих влияние на репарацию тканей; отсутствие комплаентности.

Определение уровня нитритов и нитратов плазмы крови проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (прибор фирмы "Shi- madzu", Япония). Из локтевой вены обследуемых брали по 10 мл крови в утренние часы (8—9 ч), что, по данным литературы, соответствует "базальному" уровню NO [24]. Полученную после центрифугирования плазму крови хранили в парах жидкого азота до момента проведения анализов. Перед исследованием образцы плазмы размораживали при комнатной температуре, разводили эквивалентным количеством элюирующего буфера и подвергали депротеинизации с помощью ультрафильтрации через фильтры Ultrafree-MC, 10000 NMWL Filter Units ("Sigma", США) центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Затем 20 мл пробы ультрафильтрата вносили на анионообменную колонку Multospher SAX-5 мкм и элюировали буфером 5 мМ К₂НРО₄, 25 мМ КН₂РО₄ pH 3,5. Количественный анализ проводили сравнением с внешним стандартом (KNO₂, KNO₃) при длине волны 214 нм.

Пациентам контрольной группы и больным СД без язвенных дефектов стоп выполняли биопсию кожи с тыльной поверхности стопы, больным с трофическими язвами — участка кожи с края язвенного дефекта и грануляционной ткани соответственно. Площадь среза составляла примерно 7—10 мм². Образцы ткани помещали в пробирки и замораживали в растворе жидкого азота, где хранили до момента исследования.

Активность NO-синтаз (индуцибельной и эндотелиальной) расценивали как способность тканевых ферментов превращать ЗН-Ь-аргинин в 3H-L- цитруллин. Активность аргиназы в биоптатах определяли по ее способности превращать L-аргинин в мочевину. Концентрацию ТФР-Р! определяли с помощью набора BIOTRAK фирмы "Amersham" (Великобритания) после предварительной специальной обработки образцов.

При статистической обработке материала в вариационных рядах с нормальным или близким к нормальному распределением для выявления достоверности полученных различий вычисляли t- критерий Стьюдента. Для сравнения совокупностей, не подчиняющихся нормальному распределению, были использованы непараметрические критерии: критерий Манна—Уитни с поправкой Йейтса для сравнения двух выборок, критерий Крускала—Уоллиса и критерий Данна для сравнения нескольких групп. В случае сравнения качественных признаков использовали метод х²-

Для вычисления наличия и силы связи между факторами вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs). При всех методах обсчета различия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты

При изучении продукции NO у больных СД с диабетической нейропатией без язвенных поражений получено снижение уровня NO_X (NO₃ + NO₂) плазмы по сравнению с лицами контрольной группы (рис. 3).

Достоверных различий синтеза NO в зависимости от типа СД и показателей углеводного обмена в данной когорте обследуемых не найдено. Выявлена зависимость изучаемого показателя от длительности диабета и степени выраженности диабетической полинейропатии. Так, у пациентов без язвенных дефектов выявлена обратная корреляционная связь между уровнем NO_X плазмы и длительностью СД (rs = -0,721; р < 0,001). У 12 больных со стажем СД более 16 лет значение NO_X плазмы было достоверно ниже, чем у больных с меньшей длительностью заболевания: 13,27 (12,67; 15,45) мкмоль/л против 29,79 (25,74; 31,53) мкмоль/л соответственно (р < 0,001). Отмечена зависимость уровня NO_X плазмы от степени выраженности неврологических расстройств (rs = -0,63; р < 0,001). У 10 пациентов без трофических язв с выраженной и тяжелой нейропатией (сумма баллов > 7) содержание NO_X плазмы было значительно ниже, чем у больных с умеренной нейропатией: 12,96 (12,52; 14,03) мкмоль/л против 28,54 (22,91; 31,25) мкмоль/л (р < 0,001).

Кроме того, в группе больных без язвенных поражений стоп выявлена обратная зависимость между уровнем NO_X и показателями липидов крови (ОХС и ТГ): rs = -0,559 и rs = -0,541 соответственно (р < 0,05).

В группе больных СД с язвенными дефектами стоп корреляционная связь между указанными выше показателями отсутствовала.

У больных СД с язвенными дефектами стоп уровень NO_X плазмы был более чем в 2 раза выше, чем в группе сравнения, и почти в 4 раза превышал значения данного показателя у больных СД без язвенных поражений (см. рис. 3). Продукция NO у больных с диабетической остеоартропатией достоверно не отличалась от таковой у пациентов с рецидивирующими язвами без стопы Шарко (р > 0,05). Вы-

/ — контрольная группа; 2 — больные СД с диабетической нейропатией без язвенных дефектов стоп (ДНЯ-); 3 — больные СД с нейропатическими язвенными дефектами стоп (ДНЯ+). • — р < 0,05; •• — р < 0,0! относительно контрольной группы; значения ДНЯ+ и ДНЯ- достоверно различаются при р < 0,01 (критерии Крускала-Уоллиса и Данна).

Примечание, р, — сравнение с контрольной группой; р₂ — сравнение между группами; н.д. — различия недостоверны.

явлена зависимость рецидивирования язвенных дефектов стоп от концентрации NO_X плазмы: более высокие значения метаболитов NO у пациентов с хроническим рецидивирующим течением язвенных дефектов в отличие от больных с нерецидивирующими язвами в анамнезе (95,08 (86,16; 98,75) мкмоль/л против 54,83 (47,9; 59,87) мкмоль/л; р < 0,001).

При изучении активности ферментов, регулирующих превращение L-аргинина, в биоптатах выявлена выраженная экспрессия HNO-синтазы у больных с трофическими язвами по сравнению с лицами контрольной группы и больными без язвенных дефектов (табл. 2). Отмечено снижение активности 3NO-CHHTa3bi в биопсийном материале у больных СД с периферической нейропатией по сравнению со здоровыми обследуемыми и больными с язвенными дефектами стоп. Содержание аргиназы в биоптатах кожи и грануляционной ткани, взятых с края язвенных дефектов, было значительно выше, чем в контрольной группе, а у больных без язв достоверно не отличалось от такового у здоровых. Выявлена достаточно низкая концентрация ТФР-Pj в тканях больных СД с трофическими язвами по сравнению с таковой у лиц контрольной группы. Содержание данного цитокина в группе больных без язв по сравнению со здоровыми достоверно не отличалось.

Полученные в ходе исследования данные указывают на сильную корреляцию между уровнем NO_X плазмы и активностью NO-синтаз как в группе больных СД с нейропатическими язвенными дефектами, так и в группе больных диабетом без язвенных поражений стоп (табл. 3). Так, снижение концентрации NO_X плазмы у больных без язв сопровождалось низкой активностью эндотелиальной и индуцибельной NO-синтаз.

У больных с трофическими язвами стоп выраженная гиперпродукция NO сопровождалась значительным повышением экспрессии iNOS в биоптатах, высокой активностью аргиназы, а также резко сниженным содержанием ТФР-Р].

Обсуждение

Выявленное снижение базального уровня NO у пациентов без язвенных поражений стоп по сравнению со здоровыми лицами предполагает определенные патологические изменения, характерные для СД. Так, длительная гипергликемия может приводить к снижению синтеза и(или) повышению утилизации NO посредством нескольких механизмов. Один из них связан с активацией полиолового пути обмена глюкозы, в ходе которого происходит истощение содержания в эндотелиальных клетках глутатиона и NADPH. Последний является облигатным кофактором как эндотелиальной NO-синтазы, так и глутатиона (мощный тканевый антиоксидант). Инактивация NO происходит при участии реактивных кислородных радикалов, образующихся в большом количестве в результате окислительного стресса, наблюдаемого при СД [19, 27]. Отдельные исследования свидетельствуют о заметном снижении активности ферментов антиоксидантной защиты при диабете, что может приводить к повышенной чувствительности эндотелия к повре- «дающему действию свободных радикалов и уменьшать выделение NO [16, 18, 25]. Увеличение активности диацилглицерина и протеинкиназы С, ингибируя эндотелиальную NO-синтазу, также препятствует синтезу NO [25]. Конечные продукты гликирования, снижая доступность или "гася" активность NO, являются дополнительным фактором снижения уровня NO и дисфункции эндотелия [6].

Таблица 3

Корреляционный анализ между уровнем нитрата плазмы и показателями активности ферментов HNO-синтазы, aNO-синтазы, аргиназы и ТФР-р, в биоптатах кожи у больных с язвенными дефектами стоп, больных СД и лиц контрольной группы

Примечание. Достоверность коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs) при: * — р < 0,001; ** — />< 0,01, н.д. — отсутствие статистической значимости коэффициента корреляции.

Обобщая имеющиеся в литературе данные и сопоставляя их с полученными результатами, можно сделать предварительный вывод о связи длительности заболевания со степенью повреждения эндотелиальной продукции NO.

При изучении продукции NO у пациентов с дислипидемией также отмечено снижение его содержания в плазме крови по сравнению с больными СД без нарушений показателей жирового обмена. Согласно современным представлениям, гипергликемия и повышение уровня ХС в крови, особенно его наиболее атерогенной фракции — ХС ЛПНП, являются важными факторами риска развития атеросклероза. Известно, что гиперхолестеринемия повышает образование супероксидных радикалов сосудистой стенкой, а окислительные ЛПНП вызывают снижение активности 3NO-cHHTa3M [7, 13] и уменьшают количество L-аргинина — субстрата для синтеза NO [8]. Нарушение эндотелийзависи- мой вазодилатации при гиперхолестеринемии, с одной стороны, обусловлено пониженным синтезом NO, с другой — инактивацией NO свободными радикалами кислорода, гиперпродукция которых также имеет место при СД.

При анализе взаимосвязи величин секреции метаболитов NO плазмы крови и активности 3N0- синтазы у больных без язвенных поражений обнаружено, что наиболее низкие значения данных показателей имели пациенты с выраженным нарушением периферической чувствительности. Полученные нами данные согласуются с результатами зарубежных исследователей. Так, D. Pitei и S. Kilo и соавт., используя лазерную допплеровскую флоуро- метрию, оценивали вазодилатацию сосудов микро- циркуляторного русла тыла стопы у пациентов с диабетической нейропатией в ответ на нагревание и ионофорез ацетилхолина [11, 20]. Эти авторы получили снижение NO-опосредованного сосудорасширяющего эффекта. Интересные данные получены в исследовании A. Veves и соавт. по изучению эндотелиальной дисфункции у больных СД с диабетической нейропатией с использованием иммуногистохимического метода [26]. Отмечено уменьшение интенсивности окрашивания биоптатов кожи с тыла стопы антисывороткой к эИО-синтазе человека, что указывало на снижение синтеза NO эндотелием капилляров.

Снижение активности HNO-CHHTa3bi в биоптатах кожи у больных СД без язвенных дефектов относительно контрольной группы может вносить вклад в нарушение регуляции ангиогенеза и снижение синтетической функции фибробластов. Имеющиеся в литературе сведения подтверждают это предположение. Так, установлено, что NO обладает способностью стимулировать миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, способствуя образованию новых сосудов [15, 23], и играет важную роль в синтезе и отложении коллагена [3, 12]. М. Schaeffer и соавт. [21] в опыте над экспериментальными мышами продемонстрировали, что системное введение конкурентных ингибиторов HNO-синтазы, таких как метил изотиомочевина и аминогуанидин, приводило к уменьшению отложения коллагена и ухудшению стягивания кожной раны у экспериментальных животных.

Таким образом, принимая во внимание представленные здесь данные, с большой долей вероятности мы можем полагать, что снижение продукции NO в сочетании с другими факторами риска (сенсомоторные расстройства, гиперхолестеринемия, длительность СД) может предрасполагать к развитию язвенных дефектов у больных СД с периферической нейропатией.

Чрезмерная продукция NO у обследованных нами больных с нейропатическими язвенными дефектами стоп является одним из важных механизмов их образования и ответственно за снижение скорости репаративных процессов в области раневого дефекта. С одной стороны, индукция синтеза NO тесным образом связана с высоким уровнем неспецифической защиты организма человека в отношении как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов, с другой — длительная гиперпродукция NO приводит к нежелательным последствиям, связанным, в частности, с нарушением заживления ран, поскольку цитотоксичность данного соединения может проявляться в отношении собственных тканей [1]. Кроме того, в работах М. Schaeffer и соавт. [21] было показано, что резко повышенное содержание NO в тканях угнетает синтез белка и коллагеногенез. Высокая способность к образованию NO у больных с рецидивирующими язвами, вероятно, поддерживает нарушенное заживление тканей, способствует формированию незрелых коллагеновых волокон в силу повреждающего действия NO на кожу и грануляционную ткань, что требует дальнейшего подтверждения с использованием морфологического и электронно-микроскопического методов исследования.

Повышенная активность аргиназы, выявленная у больных с нейропатическими язвенными дефектами, возможно, объясняет интенсивное образование гиперкератоза, окружающего язвенный дефект, и препятствует заживлению ран.

Гипотеза о вероятной модулирующей роли ТФР-р, в метаболизме L-аргинина находит свое отражение в снижении его концентрации в биоптатах кожи и грануляционной ткани больных с трофическими язвами. Повреждения в системе регуляции активности HNO-синтазы могут приводить к изменению синтеза NO в ране с нарушением последовательных фаз заживления. Ослабление ингибиторного влияния ТФР-р, на экспрессию hNO-chh- тазы способствует неконтролируемой гиперпродукции NO макрофагами и фибробластами области раневого дефекта. Важно отметить, что ТФР-р, является наиболее активным и разносторонним медиатором фибро- и ангиогенеза, и уменьшение его синтеза также может способствовать нормальному заживлению язвеных дефектов стоп.

Таким образом, очевидно, что метаболизм аминокислоты L-аргинина и его регуляция, в частности ТФР-Р|, играет важную роль в процессе заживления ран. Нарушение последовательной активации ферментов HNO-синтазы и аргиназы, участвующих в катаболизме аргинина, в результате стойкой активации клеток воспаления и изменения продукции цитокинов и факторов роста может приводить к хроническому воспалению, замедленному заживлению ран и их рецидивированию у больных СД.

Выводы

1. Снижение продукции NO у больных СД в сочетании с другими факторами риска, такими как степень тяжести периферической нейропатии, длительность заболевания, дислипидемия, может предрасполагать к развитию язвенных дефектов стоп у больных СД типов 1 и 2.
2. Избыточный синтез NO у больных СД с нейропатическими язвами обусловлен повышенной экспрессией индуцибельной формы NO-синтазы, что приводит к нарушению процесса заживления трофических язв.
3. Гиперпродукция NO наиболее выражена у больных с рецидивирующими нейропатическими язвенными дефектами по сравнению с больными, имеющими первичные язвы.
4. Замедленное заживление нейропатических язвенных дефектов стоп во многом обусловлено интенсивным образованием участков гиперкератоза, окружающих язвы, что может объясняться повышенной активностью фермента аргиназы, участвующего в процессе синтеза белков, коллагенов.
5. Изменение цитокинового фона у больных СД находит свое отражение в снижении локальной экспрессии ТФР-р! у больных с нейропатическими язвенными дефектами, играющего важную роль в процессах синтеза и отложения коллагена, ангиогенезе и регулирующего временную последовательность фаз заживления кожных ран в физиологических условиях.