Генетические и биохимические механизмы формирования диабетической нефропатии у детей

Проблема профилактики сахарного диабета типа 1 (СД1), его сосудистых осложнений связана с изучением процессов, которые происходят в организме задолго до возникновения клинических признаков заболевания. В детском возрасте "дебютируют" диабетические ретино- и нефропатия (ДН), которые определяют в дальнейшем инвалидизацию больных и большую социальную значимость заболевания. В разных странах ДН в детском и подростковом возрасте регистрируется в 5—33% случаев [6, 9, 14]. Механизмы развития микроангиопатий при СД1 сложны и активно изучаются [1,4]. Новые данные о роли генетических факторов в формировании ДН позволят наметить реальные пути исследования, направленные на профилактику осложнений данного заболевания.

Цель работы заключалась в изучении вклада полиморфных вариантов генов NOS3 и АСЕ, состояния систем протеолиза и нарушений липидного обмена в развитие ДН.

Материалы и методы

Обследовано 197 детей, больных СД1 (средний возраст 13,1 ± 0,3 года; мальчиков — 100, девочек — 97), находившихся на стационарном лечении в детской больнице № 1 Томска (главный врач В. А. Карташов), обратившихся для консультации в генетическую клинику (главный врач — проф. Л. П. Назаренко) НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН в 1996—2002 гг. В генетической клинике НИИ медицинской генетики РАМН проведено клинико-генеалогическое и молекулярно-генетическое обследование родственников пробанда из 163 семей.

Диагностику ДН осуществляли по классификации С. Mogensen [4] в модификации, принятой в Российской Федерации [5]. Стадию микроальбуминурии диагностировали при содержании альбумина в моче 30—300 мг/сут, стадию протеинурии выявляли при уровне белка в моче более 300 мг/сут. В группу детей без осложнений СД1 не вошли дети с впервые выявленным диабетом. Контрольную группу составили 32 практически здоровых ребенка, средний возраст 12,8 ± 0,1 года.

Выделение тотальной ДНК проводили с помощью неэнзиматического метода с некоторыми модификациями [16]. Для генотипирования I/D-no- лиморфизма гена АСЕ и VNTR-полиморфизма гена NOS3 разделение продуктов амплификации проводили путем электрофореза в 2% агарозном геле с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете. Применяли следующую номенклатуру аллелей: для гена АСЕ — аллель I (490 п. н.) — наличие (инсерция) Alu-повтора, аллель D (190 п. н.) — его отсутствие; для VNTR-полиморфизма аллель А соответствовал длине 393 п. н., аллель В — 420 п. н. В работе использовали реактивы, произведенные фирмами "Sigma" (США), "Медиген" (Новосибирск), "Сибэнзим" (Новосибирск).

Активность калликреина (КК) и его предшественника калликреиногена (ККГ) плазмы крови оценивали по скорости гидролиза N-a-бензоил-Ь- аргининэтилового эфира ("Reanal", Венгрия), выражали в миллиединицах (МЕ/мл) [И]. Для определения активности а,-протеиназного ингибитора (oq-ПИ) и а₂-макроглобулина (а₂-МГ) плазмы крови использовали метод В. Ф. Нартиковой и Т. С. Пасхиной [10]. Активность ингибиторов выражали в ингибиторных единицах (ИЕ/мл). Активность ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) сыворотки крови изучали по кинетике гидролиза фу- рилакрилоилфенилаланилглицилглицина (FAPGG, "Sigma", США) в мкмоль/мин-л [3]. Содержание белка в моче определяли иммунотурдибиметриче- ским методом с помощью наборов фирмы RANDOX (Великобритания).

Исследовали содержание общего холестерина (ХС), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови с помощью наборов фирмы "Biocon" (Франция). Определение изучаемых показателей проводили на биохимическом автоанализаторе FP-900 ("Labsystems", Финляндия). Содержание ХС липопротеинов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП), ХС липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП), холестериновый коэффициент атеро- генности (ИА) вычисляли по общепринятой методике [7].

Статистический анализ проводили с применением программ STATISTICA 5.0, Microsoft Excel- 97. Тестирование распределения генотипов на равновесие Харди—Вайнберга проводили с помощью точного теста Фишера, сравнение распределения генотипов и частот аллелей — с помощью критерия X² с поправкой Йетса на непрерывность [12]. Для оценки ассоциаций полиморфных вариантов генов с патологическим фенотипом рассчитывали относительный риск (RR) по формуле

RR = ad/bc,

где а — частота анализируемого аллеля у больных; b — частота анализируемого аллеля в контрольной выборке; с и d — суммарная частота остальных аллелей у больных и в контроле соответственно [18]. RR = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации, RR > 1 — как положительную ассоциацию ("фактор риска") и RR < 1 — как отрицательную ассоциацию аллеля с заболеванием. Для поиска ассоциации патологии с генетическими маркерами использовали тест на неравновесие по сцеплению — Transmission/Disequilibrium Test (TDT) [13]: TDT = (b — c)²/(b + с), где b и с — наследуемые аллели от гетерозиготных родителей.

Таблица 1. Распределение генотипов и частот аллелей VNTR-полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) у больных СД1 в зависимости от наличия нефропатии

Примечание. * — р > 0,05 в группах сравнения.

Результаты и их обсуждение

По данным Регистра больных СД1 Томской области, в структуре осложнений нефропатия наблюдается у 12,8%, ретинопатия — 23,2% и нейроангиопатия нижних конечностей — у 19,9% детей. Из 197 детей, находившихся под наблюдением, ДН имела место у 44 (19 мальчиков и 25 девочек). Стадия микроальбуминурии была диагностирована у 20 больных, стадия протеинурии — у 24. Среди больных с ДН преобладали девочки (57%), подростки (средний возраст составил 16,7 ±1,3 года против 13,2 ± 1,8 года в группе без нефропатии), дети с декомпенсированным СД (НЬ А_1с 14,9 ± 0,7%) и из сельской местности.

Анализ родословных выявил, что у детей с ДН чаще наблюдалась отягощенная наследственность по СД1 (27,6%; р = 0,409) и СД типа 2 (СД2) (58,6%; р = 0,01), чем у детей без нефропатии (14 и 19,1% соответственно). Высокий риск развития ДН был выявлен у детей с отягощенной наследственностью по СД2 (RR — 4,798; р = 0,0002), более значимый для лиц женского пола (RR = 6,049; р = 0,002). Зависимости развития ДН от семейных случаев сердечно-сосудистых заболеваний не выявлено.

Распределение генотипов и частот аллелей VNTR-полиморфизма гена NOS3 у больных СД1 в зависимости от наличия нефропатии представлено в табл. 1. У больных с ДН по сравнению с детьми без данного осложнения выявлено преобладание аллеля В (97,62% против 84,24%) над аллелем А (2,38% против 15,73%) гена NOS3. Генотип ВВ наблюдался у 20 (95,2%) детей с нефропатией и у 66 (74,1%) детей без нее. Не обнаружено ДН у больных с генотипом АА, у гетерозигот АВ она встречалась редко (1 пациент с нефропатией против 18 больных без нефропатии).

Таким образом, аллель А эндотелиальной NO- синтазы реже встречается у больных СД с нефропатией (д < 0,05) и является фактором, достоверно, хотя и незначительно, уменьшающим риск RR = 0,13) развития последней (см. табл. 1). Наличие ассоциации между микросателлитом NOS3 4а/4Ь и развитием ДН свидетельствует о вкладе VNTR-полиморфизма гена NOS3 в регуляцию выработки оксида азота, играющего важную роль в патогенезе данного осложнения диабета.

Таблица 2. Активность КК, ККГ, АПФ, оц-ПИ и а₂-МГ у больных СД1 (X ± т)

Примечание. р_} — достоверность различий показателей с контролем; р₂ — достоверность различий показателей с группой больных без осложнений.

Анализ взаимосвязи изучаемых полиморфизмов с патологией с помощью теста на неравновесие по сцеплению (Transmission/Disequilibrium Test) показал также ассоциацию/сцепление аллеля В с ДН (TDT = 4,5; р = 0,034). Таким образом, на семейном материале нами была подтверждена роль аллеля В в развитии ДН. Не обнаружено ассоциации ДН с I/D-полиморфизмом гена АСЕ у больных СД1 с помощью расчета критерия RR. Однако известные исследования [8, 15, 17], показавшие роль аллеля D в развитии ДН, основывающиеся на различии частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в группах сравнений, впервые подтверждены нами с помощью теста на неравновесие по сцеплению (TDT - 3,6; р < 0,05).

При сосудистой патологии большое значение уделяется состоянию калликреин-кининовой (ККС) и ренин-ангиотензиновой (РАС) систем. Обе системы связаны между собой посредством КК и АПФ, которые оказывают противоположное действие на гемодинамику. В общей группе больных СД1, включающей в себя 106 детей, наблюдалась активация кининогенеза, о чем свидетельствовало повышение активности КК в 1,6 раза и снижение активности ККГ на 30% (табл. 2). С увеличением длительности заболевания, осложненного развитием нефропатии, до 10 лет активность КК и ККГ сыворотки крови детей снижалась. Достоверно значимое снижение активности КК было зарегистрировано в группе детей с ДН в стадии протеинурии. На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что на ранних стадиях СД1 у детей (группа без осложнений) происходит активация ККС, сопровождающая полиурию. При длительном течении заболевания с развитием нефропатии в большей степени активирована РАС.

Особый интерес при развитии патологических процессов представляет изучение взаимосвязи ген—фермент. В связи с этим нами была изучена активность АПФ при СД1 (см. табл. 2). Существенных изменений активности АПФ сыворотки крови в общей группе больных по сравнению с контролем не выявлено. Однако с увеличением длительности заболевания активность АПФ повышалась с 36,6 ± 2,9 мкмоль/мин-л (при впервые выявленном диабете) до 58,0 ± 3,8 мкмоль/мин-л (р < 0,05; при длительности заболевания более 10 лет). Установлено, что при ДН на стадии микроальбуминурии и протеинурии активность АПФ повышалась в 1,5 и 1,7 раза соответственно (р < 0,05).

Изучение активности АПФ у детей с различными генотипами I/D-полиморфизма гена АСЕ показало, что у детей с генотипом II активность АПФ составила 35,6 ± 3,5 мкмоль/мин-л. В группе детей с генотипом ID активность фермента увеличивалась на 10% и составляла 38,8 ± 3,1 мкмоль/ мин • л, в группе детей с генотипом DD данный показатель возрастал в 1,3 раза (45,4 ± 3,7 мкмоль/ мин • л; р < 0,05) по сравнению с группой детей с генотипом II.

Таблица 3. Показатели липидного обмена у детей с СД1 (X ± т)

Примечание, р — достоверность различий с контролем; Р]_₂ — достоверность различий показателей между группами больных без осложнений и с ДН в стадии микроальбуминурии; Pj_3 — достоверность различий показателей между группами больных без осложнений и с ДН в стадии протеинурии; р₂_₃ — достоверность различий показателей между группами с нефропатией в стадии микроальбуминурии и стадии протеинурии.

Состояние протеолиза зависит от специфических белков-ингибиторов, которые инактивируют протеолитические ферменты. oq-ПИ связывает до 90% всех сериновых протеиназ плазмы человека, а₂-МГ лимитирует активность плазмина, КК, эластазы и др. [2]. В общей группе больных СД1 не обнаружено значительных изменений активности обоих ингибиторов (р > 0,05). При ДН активность о^-ПИ снижалась на 24% по сравнению с контролем (р < 0,05) без изменения активности а₂-МГ. Однако достоверно значимое изменение изучаемых показателей было зарегистрировано у больных с ДН в стадии протеинурии. Следовательно, активность а,- ПИ может иметь существенное значение для оценки и прогнозирования развития нефропатии при СД1.

В патогенезе сосудистых осложнений СД обще- признана роль гипергликемии, однако дислипидемия также вносит вклад в их развитие. Результаты исследования показали, что у детей с нефропатией было повышено содержание ХС, ТГ, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП, снижен уровень ХС ЛПВП, а также увеличен ИА (в 2 раза) у больных в стадии протеинурии по сравнению с показателями больных диабетом детей без данного осложнения (д < 0,001) и в меньшей мере по сравнению с данными детей с ДН в стадии микроальбуминурии (/? < 0,05; табл. 3). Таким образом, уровни ХС ЛПВП и ИА могут служить дополнительными прогностическими критериями перехода ДН из стадии микроальбуминурии в стадию протеинурии. В целом полученные результаты свидетельствуют о мультифакториальном генезе ДН при СД1 и необходимости проведения не только коррекции гликемии, но и адекватной патогенетической терапии с учетом отмеченных нарушений в липидном обмене и системе протеолиза.

Выводы

1. Установлен вклад VNTR-полиморфизма гена NOS3, а также I/D-полиморфизма гена АСЕ и его продукта в развитие ДН у детей и подростков при СД1.
2. Повышенная активность КК плазмы крови играет роль на ранних стадиях развития нефропатии (гиперфункции). Увеличение активности АПФ при существенном угнетении oq-ПИ вносит вклад в развитие нефропатии на стадиях микроальбуминурии и протеинурии.
3. Полученные данные указывают на то, что одним из механизмов формирования ДН может быть наличие гиперлипидемии, которая проявляется повышением уровня ХС, ТГ, ХС ЛПНП и снижением ХС ЛПВП.