Взаимосвязь I/D-полиморфизма гена АСЕ и Т174М-полиморфизма гена AGT с диабетическими микроангиопатиями у детей и подростков

К достижениям в диабетологии последних десятилетий следует отнести доклиническую диагностику микрососудистых осложнений и новые возможности в области молекулярной генетики, которые открыли перспективы в изучении патогенеза этих состояний [1, 3, 7].

В настоящее время методами молекулярной генетики доказано, что у человека гены многих ферментов и рецепторов характеризуются наличием одного или нескольких структурных полиморфизмов, которые оказывают влияние на функциональную активность кодируемых белков. Эти специфические для конкретной патологии маркеры могут быть выявлены задолго до ее клинической манифестации, что очень важно для уточнения групп риска, их активного наблюдения и терапевтической коррекции [2, 4, 5].

В число генов-кандидатов, продукты которых могут принять участие в развитии диабетических ангиопатий, входят гены, кодирующие компоненты ренин-ангиотензиновой системы (РАС). Роль РАС неоценима в обеспечении нормальной физиологии сосудов. Белки РАС вовлечены в регуляцию локальной тканевой гемодинамики, артериального давления. Значимая роль РАС в патогенезе диабетических ангиопатий подтверждается успешным использованием в клинике ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ).

Активность РАС регулируется уровнем продукции ангиотензиногена, активностью ренина и АПФ и сосудистым рецептором к ангиотензиноге- ну-2 [6].

По-прежнему сохраняется значительный интерес к изучению генетической предрасположенности в развитии микрососудистых осложнений при сахарном диабете (СД).

Целью исследования явились изучение роли генов-кандидатов РАС в развитии микроангиопатий

Таблица 1

Характеристика больных СД (л = 138)

у детей и подростков с СД 1-го типа, а также систематизация по значимости факторов риска развития диабетических микроангиопатий для обоснования оптимальных подходов к профилактике и терапевтической коррекции.

Материалы и методы

Обследовано 138 детей (73 мальчика и 65 девочек), больных СД 1-го типа. Средний возраст обследованных составил 13,2 ± 0,3 года. Характеристика их представлена в табл. 1.

Для более полной оценки влияния факторов внешней среды в качестве контрольной группы обследовали здоровых сибсов.

Как видно из табл. 2, группа больных СД 1-го типа была разделена на 2 подгруппы: с наличием диабетических микроангиопатий и без них.

В группу пациентов с наличием только диабетической нефропатии в основном вошли больные с нефропатией в стадии микроальбуминурии. Анализ подтвердил, что с увеличением стажа диабета прямо пропорционально возрастает риск развития как диабетической ретинопатии, так и сочетания диабетической нефро- и ретинопатии. Необходимо отметить, что у больных с сочетанием диабетической нефро- и ретинопатии возраст дебюта СД 1-го типа приходится на дошкольный период, в то время как число пациентов с наличием только нефропатии возрастает с увеличением возраста дебюта и имеет максимальное значение при дебюте в период пубертата.

Наряду с традиционным клинико-инструментальным исследованием у пациентов определяли уровень гликированного гемоглобина (НЬ А_1с), липидный спектр крови: содержание холестерина (ХС), ХС липопротеидов низкой, высокой, очень низкой плотности, триглицеридов; МАУ, активность АПФ. Проводили поиск генетической основы клинических проявлений СД — полиморфизмов гена ангиотензинконвертирующего фермента (АСЕ) и гена ангиотензиногена (AGT) с использованием с этой целью полиморфного маркера, расположенного в интроне 16 и представляющего двухаллельный полиморфизм типа вставка/отсут- ствие вставки (Insertion/Deletion), в латинской аббревиатуре называемый полиморфизмом типа I/D. Для определения активности АПФ сыворотки крови использовали метод G. Maguire и С. Price (1985), модифицированный П. П. Голиковым и Н. Ю. Николаевой (1998).

Для анализа рестрикционного полиморфизма Т174М (замена треонина на метионин в положении 174) гена AGT продукты амплификации подвергали гидролизу рестриктазой Bspl91 ("Сибэнзим", Россия). При электрофоретическом разделении продуктов рестрикции выявляются 2 аллельных варианта: аллель Т (отсутствие сайта рестрикции) — 1 фрагмент длиной 303 пары нуклеотидов; аллель М (присутствие сайта) — 2 фрагмента 211 и 92 пары нуклеотидов.

Статистическую обработку осуществляли с помощью программ Statistica 5.5, используя параметрические (критерий Стьюдента) и непараметрические (критерий Манна—Уитни) методы исследования.

Изучение ассоциации полиморфизма исследованных генов с патологией проводили с использованием теста на неравновесие при исследовании Transmission/Diseqilibrium Test (TDT). Взаимоотношения между результатами диагностического теста и реальным наличием или отсутствием заболевания вычисляли с помощью расчета чувствительности (Se), специфичности (Sp) теста, распространенности заболевания (Р), прогностической ценности отрицательного (-PV) и положительного (+PV) результатов, отношения правдоподобия положительного (LR+) и отрицательного (LR-) результатов теста.

Таблица 2

Характеристика обследованных с диабетическими микроангиопатиями

Результаты и их обсуждение

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что у пациентов с СД 1-го типа с наличием и отсутствием диабетических микроангиопатий из всех клинических факторов риска в развитии ангиопатий наибольшее значение имели степень компенсации углеводного обмена, стаж патологического процесса и возраст дебюта заболевания. При этом у пациентов с сочетанием нефро- и ретинопатии диабет чаще дебютировал в возрасте до 7 лет, а у пациентов с наличием только нефропатии — после 11 лет.

Кроме известных метаболических факторов, оказывающих влияние на эндотелий сосудов, АПФ, ангиотензиноген-2 являются одними из ключевых звеньев поддержания равновесия между факторами вазодилатации и, следовательно, регуляции сосудистого тонуса.

Анализ наших исследований свидетельствует о том, что уровень активности АПФ не имел статистически значимой зависимости от пола, возраста, давности диабета, возраста дебюта, наследственной отягощенности по СД 1-го и 2-го типов, артериальной гипертонии, наличия кетоацидотической комы в анамнезе. Отмечены статистически значимые различия активности АПФ в группах с микро- сосудистыми осложнениями и без них (50,73 ± 4,45 и 37,41 ± 3,56 мкмоль • мин^-1 • л^-1 соответственно; р = 0,02).

Для верификации достоверности данного показателя провели оценку чувствительности и специфичности теста. Уровень активности АПФ имел чувствительность более 50% при специфичности более 70%. Анализ ассоциаций I/D-полиморфизма гена АСЕ с СД 1-го типа показал, что распределение аллелей I и D гена АСЕ у больных СД 1 -го типа не зависело от пола; не выявлено также статисти-

Таблица 3

Распределение генотипов и частот аллелей I/D-полиморфизма гена АСЕ у обследованных в зависимости от наличия микроангиопатий

Примечание, р — достоверность различий с группой больных СД 1-го типа без осложнений.

чески значимой разницы в зависимости от стажа диабета, возраста дебюта.

Ассоциация семейных случаев СД 1-го типа и I/D-полиморфизма гена АСЕ у пробандов не установлена. Однако у девочек с СД 1-го типа получена статистически значимая ассоциация аллеля I с наличием отягощенной наследственности по СД 2-го типа. Распределение генотипов и частот аллелей I/D-полиморфизма гена АСЕ у больных в зависимости от наличия микроангиопатий представлено в табл. 3.

Как видно из табл. 3, у больных с диабетической нефропатией по сравнению с больными без осложнений преобладал аллель D (75% против 57%).

Диабетической нефропатии не обнаружено у больных с генотипом II, у гетерозигот ID она встречалась редко (13 пациентов с нефропатией против 29 без нефропатии).

На основании полученных данных можно высказать предположение о том, что пациенты с СД 1-го типа — носители аллеля D имеют генетическую предрасположенность к развитию диабетической нефропатии.

Изучение частоты наследования аллелей I и D от гетерозиготных родителей выявило, что аллель D ассоциирует с СД 1-го типа, при этом тест на неравновесие при наследовании (TDT) составил 4,18 (р = 0,04), TDT на ассоциацию со здоровыми сиб- сами — 1,82 (р = 0,18).

Таким образом, впервые установлена ассоциация I/D-полиморфизма гена АСЕ с развитием диабетической нефропатии у детей с СД 1-го типа в сибирской популяции. Аллель I гена АСЕ реже встречается у больных СД с наличием нефропатии (р > 0,05) и является фактором, уменьшающим риск ее развития. Наличие ассоциации между аллелем D и развитием диабетической нефропатии свидетельствует о вкладе полиморфизма гена АСЕ в регуляцию выработки АПФ, играющего важную роль в патогенезе данного осложнения. Не обнаружено ассоциации изучаемого полиморфизма с наличием у больного сочетания диабетической нефро- и ретинопатии.

Поиск ассоциации Е174М-полиморфизма гена AGT у обследованных дал следующие результаты. Анализ ассоциаций Т174М-полиморфизма гена AGT с диабетическими микроангиопатиями показал, что при сравнении распределения гена AGT в группах больных с микроангиопатиями и без них статистически значимых различий не обнаружено. Выявлена ассоциация аллеля Т гена AGT с СД 1-го типа, подтвержденная отрицательным TDT-тестом на ассоциацию со здоровыми сибсами. Также обнаружена ассоциация аллеля Т с диабетической нефропатией.

Выводы

1. Частота развития микроангиопатий при СД 1-го типа определяется сочетанием средовой компоненты (стаж диабета, возраст дебюта заболевания, повышенным уровнем активности АПФ) и генетических факторов (полиморфизмом генов ан- гиотензинконвертирующего фермента и ангиотен- зиногена).
2. Аллельные варианты гена АСЕ (I/D-поли- морфизм) и гена AGT (Т174М-полиморфизм) являются составной частью в структуре наследственной предрасположенности к СД 1-го типа.
3. Установленная ассоциация аллеля D исследуемого I/D-полиморфизма гена АСЕ и ассоциация аллеля Т Т174М-полиморфизма гена AGT с диабетической нефропатией позволяет решить вопрос о превентивной терапии данного осложнения.