Регуляция лептином окислительной и фагоцитарной активности моноцитов у женщин в разные фазы менструального цикла

Лептин является пептидным гормоном, который, модулируя интенсивность энергетического обмена, регулирует функционирование клеток иммунной системы и направленность развития иммунного ответа, что определяется экспрессией лептиновых рецепторов (Ob-R) на большинстве клеток иммунной системы [9, 10]. Обладая сходством в структуре и молекулярных механизмах сигнальной трансдукции с цитокинами, лептин стимулирует функциональную активность лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов, усиливая продукцию провоспалительных цитокинов, и способствует доминированию клеточно-опосредованного иммунного ответа [4, 9].

Известно, что среди лейкоцитов мононуклеар- ные фагоциты имеют наибольшую плотность экспрессии Ob-R [7, 20]. Неактивированные моноци- ты/макрофаги экспрессируют на поверхности лишь 5—25% молекул Ob-R, в то время как ббль- шая часть рецепторов составляет внутриклеточный пул [11, 17]. При активации мононуклеарных фагоцитов количество Ob-R на их мембране значительно увеличивается [8, 13]. Моноциты/макрофа- ги играют важную роль на всех этапах гестации, накапливаясь в децидуальной оболочке благодаря специфическому стероидному фону, и активно принимают участие в имплантации и плацентации [3]. В период гестации они и их потомки — дендритные клетки [6] — определяют вид иммунного реагирования, усиливая при особых условиях активность Т-лимфоцитов-хелперов (Ill) 2-го типа [15], регулирующих трофическую функцию иммунной системы матери в отношении зародыша [19]. Кроме того, моноциты/макрофаги осуществляют клиренсную функцию, фагоцитируя патогены, клеточный детрит и апоптотические тельца [5]. Беременность сопровождается существенным изменением функциональной активности моноцитов [3], восприимчивость которых к лептину зависит от исходного гормонального фона, в частности от уровня стероидов [12]. Поскольку моноциты являются предшественниками резидентных макрофагов, в том числе и децидуальной оболочки [3], изучение регуляции лептином их функциональной активности в процессе гестации приобретает особую актуальность.

Известно, что уровень лептина значительно нарастает во время беременности, а также варьирует в зависимости от фазы менструального цикла, что обусловлено изменением концентрации половых гормонов, главным образом прогестерона [18]. Кроме того, лептин сам модулирует секрецию половых стероидов, как непосредственно при взаимодействии с Ob-R яичников, так и системно — регулируя продукцию гонадотропных гормонов на гипоталамо-гипофизарном уровне [18]. Установлено, что эстрогены и прогестины разнонаправленно воздействуют на уровень лептина и чувствительность клеток к этому гормону, модулируя экспрессию Ob-R [7, 16]. Поэтому механизмы регуляции функциональной активности моноцитов лептином в дозах, характерных для беременности, на фоне преобладающего влияния эстрадиола или прогестерона в разные фазы менструального цикла можно определенным образом экстраполировать для оценки эффектов гормона в разные триместры беременности.

Цель настоящей работы — исследовать влияние лептина в дозах, сопоставимых с концентрацией гормона в I и II—III триместрах беременности, на окислительную и фагоцитарную активность моноцитов у женщин в разные фазы менструального цикла in vitro.

Материалы и методы

В работе использовали суспензию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (23—32 лет). Периферическую кровь забирали из кубитальной вены в фолликулярную (5—11-й день) и лютеиновую (22—27-й день) фазы менструального цикла. Мононуклеарные клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл- верографина (1,077 г/см³). Полученную суспензию (1 • 10⁶ мл) после двойной отмывки раствором Хен- кса инкубировали в течение часа при 37°С с лептином ("Sigma", США) в дозах, сопоставимых с концентрацией гормона в I и II—III триместрах беременности, — 10 и 35 нг/мл соответственно [12].

Влияние лептина на окислительный потенциал оценивали по активности миелопероксидазы (МПО), секретируемой моноцитами, и по интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Регуляцию лептином фагоцитарной активности моноцитов определяли по поглощению частиц полистирольного латекса.

Определение активности МПО. Активность МПО в клеточных супернатантах тестировали спектрофотометрическим методом [1,2]. Для этого 0,05 мл клеточного супернатанта помещали в лунки плоскодонного 96-луночного планшета, затем вносили 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из 0,04% ортофенилендиамина и 0,014% Н₂О₂ на фосфат-цитратном буфере (pH 5,0). Инкубировали 10 мин при комнатной температуре и добавляли 0,1 мл 10% H₂SO₄. Интенсивность оптической плотности фиксировалась в многоканальном спектрофотометре Anthos HMTL III ("Labtec Instruments", Австрия) при длине волны 492 нм. Результаты выражали в единицах оптической плотности (Е).

Оценка ЛЗХЛ. Влияние лептина на микробицидный потенциал оценивали по интенсивности ЛЗХЛ. В качестве стимулятора клеток использовали латекс (1,5 мкм; "ДиаМ", Россия). В пластиковую кювету прибора вносили 0,8 мл раствора, содержащего ПО мМ NaCl, 10 мМ трис-НС1, 2,5 мМ MgCl₂, 5 мМ глюкозы и 1 • 10⁴ М люминола (pH 7,4). После инкубации в течение 3—5 мин при 37°С и замера фонового свечения добавляли 0,1 мл клеточной суспензии (1 • 10⁶/мл) и при непрерывном перемешивании измеряли интенсивность спонтанной ЛЗХЛ. Затем в кювету вносили 0,1 мл раствора, содержащего частицы латекса в концентрации 1 • 10⁷/мл и фиксировали интенсивность стимулированной ЛЗХЛ в течение 20 мин через каждые 5 мин. Анализ проводили на биолюминометре БЛМ- 8703М ("Наука", Россия). Результаты выражали в имп/с/клетка.

Таблица 1. Влияние лептина на активность МПО моноцитов периферической крови женщин в разные фазы менструального цикла (М ± т)

Примечание. Здесь и далее: * — непарный t-критерий Стьюдента, значения р представлены только для достоверных (р < 0,05) результатов.

Фагоцитарную активность моноцитов оценивали по поглощению частиц полистирольного латекса. Для этого к 0,1 мл фракционированных моно- нуклеаров (1 • 10⁶/мл) добавляли 0,1 мл отмытой латексной суспензии в концентрации 1 • 10⁷/мл. Пробы инкубировали при 37°С в течение 20 мин, после чего содержимое пробирок перемешивали и готовили мазок, который фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому—Гимзе. Рассчитывали процент фагоцитоза — количество фагоцитов, захвативших объекты фагоцитоза, на 100 подсчитанных моноцитов, и фагоцитарный индекс — количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на одну фагоцитирующую клетку.

Статистический анализ результатов проводили с использованием непарного /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Учитывая, что биоцидное действие моноцитов, направленное на внеклеточную деструкцию патогенов, осуществляется за счет выброса активных форм кислорода, с последующей их трансформацией МПО в галогеноиды, экстрацеллюлярная окислительная активность моноцитов оценивалась как по продукции активных форм кислорода в ЛЗХЛ, так и по активности секретируемой МПО.

Установлено, что низкая доза лептина (10 нг/ мл) разнонаправленно модулирует окислительный потенциал моноцитов в зависимости от фазы менструального цикла, в которую были получены клетки. В фолликулярную фазу гормон не влияет ни на активность МПО (табл. 1), ни на продукцию активных форм кислорода, фиксируемую в спонтанном и стимулированном латексом варианте ЛЗХЛ (табл. 2), тогда как в лютеиновой фазе низкая доза лептина на окислительный потенциал моноцитов дает противоположный эффект. Гормон не влияет на активность МПО в супернатантах культур мононуклеарных фагоцитов и угнетает спонтанную и латекс-индуцированную продукцию активных форм кислорода фагоцитами на 15—20-й минуте инкубации.

Высокая доза гормона (35 нг/мл), напротив, дает однонаправленные эффекты на окислительный потенциал моноцитов, независимо от фазы цикла. Лептин угнетает активность МПО (см. табл. 1) и продукцию активных кислородных метаболитов в стимулированном латексом варианте ЛЗХЛ (см. табл. 2).

При изучении фагоцитарной активности установлено, что внесение низкой дозы лептина в культуры мононуклеарных фагоцитов, полученных от женщин в фолликулярной фазе менструального цикла, приводит к уменьшению количества фагоцитирующих клеток и угнетению их поглотительной способности (табл. 3). Высокая доза гормона не оказывает влияния на фагоцитоз моноцитов. В отношении моноцитов, полученных от женщин в лютеиновой фазе менструального цикла, установлено, что обе дозы лептина достоверно усиливают поглотительную активность моноцитов, не влияя на долю фагоцитирующих клеток.

Таким образом, в фолликулярную (эстрогендо- минантную) фазу исследуемые дозы лептина разнонаправленно модулируют окислительную и фагоцитарную активность моноцитов. Низкая доза не влияет на окислительный потенциал моноцитов, при этом угнетает фагоцитарную активность клеток. Высокая доза гормона снижает активность МПО и продукцию активных форм кислорода во внеклеточную среду, но не влияет на поглотительную функцию моноцитов. В лютеиновую (прогес- терондоминантную) фазу исследуемые дозы лептина, напротив, сходным образом регулируют окислительный потенциал и фагоцитарную активность моноцитов. Гормон независимо от количества угнетает активность МПО и продукцию экстрацеллюлярных кислородных метаболитов, усиливая фагоцитоз моноцитов.

Таблица 3. Влияние лептина на фагоцитарную активность моноцитов периферической крови женщин в разные фазы менструального цикла (М ± т)

Контроль                                         53,62 ±  2,65                        3,36   ±  0,12                          45,37   ± 2,56                          2,43 ± 0,06

Лептин (10 нг/мл)                             45,57 ± 0,83*                       2,92   ±  0,15*                        47,13   ± 1,71                          2,81 ±0,11*

Лептин (35 нг/мл)                             55,73 ±  1,89                        3,06   ±  0,12                          51,83   ± 2,80                          2,89 ± 0,07*

Принимая во внимание, что лептин является провоспалительным гормоном, он, теоретически, должен способствовать аборту. Однако этого не происходит, видимо, потому, что разнонаправлен- ность эффектов изучаемых доз лептина, определяемая половыми стероидами, формирует тонкий баланс, обеспечивающий поддержание естественной резистентности организма матери и предупреждающий развитие антизиготных реакций при беременности. Стимуляция фагоцитарной активности моноцитов в лютеиновую фазу цикла может служить одним из необходимых факторов сохранения беременности, так как при помощи фагоцитоза утилизируются не только патогенные агенты, но и апоптотические клетки, избыточное накопление которых в фетоплацентарной зоне может иметь негативные последствия для плода. Усиление окислительных процессов в этот период, вероятно, связано с внутриклеточной деструкцией объектов фагоцитоза.

Лептин дифференцированно модулирует экстрацеллюлярную продукцию активных форм кислорода и фагоцитарную активность моноцитов у женщин в зависимости от того, в какую фазу цикла были получены клетки. В разные фазы менструального цикла соотношение половых стероидных гормонов и/или уровень гипофизарных гормонов (ЛГ, ФСГ, пролактин), по-видимому, за счет модуляции уровня экспрессии Ob-R, формируют разную чувствительность моноцитов к лептину, что способствует успешной имплантации оплодотворенной яйцеклетки и последующей плацентации.

Выводы

1. Лептин в исследуемых дозах (10 и 35 нг/мл) угнетает продукцию активных форм кислорода интактными моноцитами женщин и в высокой дозе (35 нг/мл) снижает активность секреторной МПО независимо от того, в какую фазу менструального цикла получены клетки.
2. В моноцитах, полученных от женщин в фолликулярной фазе менструального цикла, лептин в низкой дозе (10 нг/мл) угнетает процессы фагоцитоза, а в высокой — продукцию активных форм кислорода в индуцированном варианте ЛЗХЛ.
3. В моноцитах лютеиновой фазы лептин оказывает стимулирующее действие на фагоцитарную активность, но существенно снижает индуцированную экстрацеллюлярную продукцию активных кислородных метаболитов.