Андрогенный дефицит и проблемы его диагностики современными неизотопными методами определения тестостерона

Во второй половине прошлого века произошла технологическая революция в методах определения гормонов и других биологически активных соединений. Ее обеспечило открытие технологии радиоиммуноанализа (РИА). Разработка методов получения высокоспецифичных поликлональных, а позже моноклональных антисывороток к различным низкомолекулярным лигандам позволила использовать методы РИА не только в эндокринологии, но и в фармакологии, физиологии и других областях медицины.

В РИА-методах для стероидных гормонов на преаналитическом этапе использовалась их экстракция из биологического материала соответствующими органическими растворителями. А в необходимых случаях проводилось хроматографическое выделение стероидов. Использование в РИА-методах изотопной метки создавало определенные трудности в их эксплуатации, включая экологические. Поэтому академические лаборатории и коммерческие компании создали неизотопные методы иммуноанализа, включая имму- ноферментные (ИФА) методы, затем методы второго и третьего поколения с высокой разрешающей способностью, где применялись люминесцентная и флюоресцентная метки.

Переход на автоматизированные системы иммуноанализа обеспечивал высокую производительность, что в комбинации с оперативностью получения результатов сделало их экспресс-методами в диагностике эндокринных нарушений. Однако по мере их эксплуатации и накопления полученных данных возникли проблемы, прежде всего для группы близкородственных по химической структуре стероидных гормонов. В последние 5 лет опубликована целая серия оригинальных работ, в которых доказана неадекватность определения в крови общей циркуляции таких гормонов, как тестостерон (Т), эстрадиол, и других стероидов прямыми неэкстракционными методами, включая практически все используемые анализаторы с их химической составляющей. Как правило, они принципиально завышают концентрацию гормона, что входит в противоречие с клиническими проявлениями заболевания.

Более того, практика быстрого получения результатов из лаборатории, не гарантирующая (все выполняет автомат) правильности определения гормонов, приводит к ослаблению анализа клинических проявлений заболевания, а во многих случаях и к неправильному лечению. Итогом многочисленных обсуждений этой проблемы международным сообществом было официальное заявление Международной ассоциации эндокринологов в 2007 г. [27] о недопустимости использования прямых методов иммуноанализа, включая все анализаторы, для определения Т у женщин и детей. В настоящее время крупные лаборатории США и Европы применяют для определения Т и других стероидов высокочувствительную и высокоточную технологию тандем-масс-спектрометрии (TD-MS). Для этой цели рекомендуются масс-спектрометры фирмы "АРГ-3000/5000 или фирмы "Waters/Micromass Quattro".

Диагностика гипогонадизма у мужчин по уровню Т, особенно возрастного дефицита Т с использованием анализаторов, должна быть прежде всего тщательно соотнесена с его клиническими проявлениями. В представленной работе наряду с обсуждением обозначенной проблемы отражен также собственный опыт авторов и даны методические разработки для улучшения диагностики андрогенного дисбаланса по уровню свободного тестостерона (св. Т).

Т — основной гормон мужского организма. Главные его биологические функции — развитие, формирование и обеспечение мужского фенотипа и сперматогенеза. У женщин Т обеспечивает рост, метаболизм костной ткани, ее ремоделирование и поддержание анаболических процессов, особенно в мышечной ткани.

Высокочувствительный и специфический метод определения Т необходим для диагностики многих клинических состояний. Как известно, концентрация Т в крови у женщин низкая и не превышает 7% от его содержания в крови взрослых мужчин. Аналогичная ситуация характерна и для детей, что значительно затрудняет количественное определение Т. Вместе с тем оценка андрогенного статуса у женщин необходима при широком спектре клинических симптомов и патологических состояний, например таких, как гирсутизм, акне, алопеция, ан- дрогенсекретирующие опухоли яичников и надпочечников. Его определение также очень важно для выбора минимальной дозы, необходимой для подавления продукции андрогенов у женщин с гипер- андрогенией [6, 21, 24, 39]. У детей точное количественное определение Т необходимо для установления половой принадлежности новорожденного с необычными, измененными гениталиями, а также для динамического наблюдения за детьми с задержкой пубертата и преждевременным половым развитием. Динамический мониторинг уровня Т требуется пациентам с выявленной врожденной дисфункцией коры надпочечников (ВДКН) вследствие дефицита 21-гидроксилазы и некоторых других ферментных систем стероидогенеза. Мониторинг за уровнем Т необходим также при проведении антиандрогенной терапии определенных форм дисгормонального рака и, в частности, при лечении рака предстательной железы пролонгированными препаратами люлиберина (фармакологическая кастрация; широко используется в настоящее время). Точное количественное определение Т необходимо для диагностики распространенного возрастного андрогенного дефицита (прежнее название PADAM). Сниженный уровень общего тестостерона (об. Т) у мужчин в возрасте 40—60 лет регистрируется в 7% случаев, а в возрасте 60—80 лет — в 21% случаев.

Преаналитические факторы, влияющие на уровень тестостерона

Сезонные колебания уровня Т. По данным J. Svar- tberg и соавт. [32], сезонные колебания концентрации об. Т достигают 19%, а свободного — 31%. Наиболее низкие концентрации регистрируются летом, пиковые — осенью. Они также зависят от региона проживания. Приведенную разницу в уровнях, естественно, необходимо учитывать при выполнении продолжительных исследований.

Суточные колебания. Как известно, 50—60% об. Т с высокой аффинностью связано с секс-стероид- связывающим глобулином (СССГ), а 40—50% — с альбумином (легко диссоциирующая связь). Только 1—2% Т циркулирует в свободной форме (св. Т) и вместе со связанным с альбумином Т они обозначаются как биодоступный Т (био. Т). Суточные колебания био. Т достигают 57%, св. Т — 68%, тогда как колебания об. Т составляют 45%. Данный процесс обусловлен увеличением синтеза Т в ночное время с одновременным снижением связывающих белков вследствие особенностей гемодинамики организма в горизонтальном положении. С возрастом выраженный суточный ритм сглаживается, что также необходимо учитывать при выборке протокола клинических исследований [32].

Диета. Содержание Т во многом определяется временем приема пищи и ее составом. В большинстве проводимых или опубликованных работах этот фактор не учитывается. Взятие крови натощак или после легкого завтрака может существенно влиять на результаты определения Т. Еще в 1973 г. была опубликована работа, в которой зарегистрировано падение уровня Т в крови у здоровых мужчин после перорального приема глюкозы [40]. Позднее, при проведении глюкозотолерантного теста, наблюдалось падение концентрации об. Т на 15% через 30 мин, которое сохранялось на протяжении последующих 3 ч [18]. Причем зарегистрированное падение было не связано со снижением сигнала со стороны ЛГ, а обусловлено выбросом в кровь глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), который уменьшает импульсную продукцию Т. Наиболее важный эффект диеты — изменение содержания СССГ, концентрация которого снижается при большом потреблении белка, жирной пищи и, наоборот, повышается при приеме вегетарианской пищи и диете, богатой клетчаткой [18]. Большое содержание свободных жирных кислот нарушает процесс связывания половых стероидов с СССГ, что сказывается на уровне св. Т [38].

Алкоголь. В небольшой дозе алкоголь повышает уровень Т в крови на 20% у мужчин [28] и у женщин [16]. Хроническое злоупотребление алкоголем приводит к необратимым деструктивным изменениям клеток Лейдига и клеток Сертоли семенников, к развитию ожирения, повышению уровня эстрогенов, в результате формирует необратимый дефицит андрогенов в комбинации с эректильной дисфункцией.

Физическая активность. Чрезмерные физические нагрузки, например у молодых спортсменов, приводят к падению уровня как об. Т, так и св. Т [7].

Психосоматическое состояние организма. Стресс, как физический, так и психоэмоциональный, приводит к подавлению продукции Т через центральные механизмы — гипоталамус—аденогипофиз— гонадотропины. Кроме того, повышенный выброс кортизола ингибирует стероидогенез в клетках Лейдига [1, 3, 10, 11].

Сексуальная активность. Уровень как об. Т, так и св. Т повышается в процессе интимных отношений у обоих партнеров, мастурбация также сопровождается увеличением концентрации циркулирующего Т.

Курение. У курильщиков уровень об. Т и св. Т возрастает на 5—15% [36].

Преаналитический этап, связанный с получением проб крови и ее обработкой.

Сравнительно недавно экспериментально была четко обоснована схема получения сыворотки для последующего определения Т: отделение сыворотки от форменных элементов должно проходить в течение 6 ч при комнатной температуре или пробы крови могут храниться при 4°С до 48 ч, а затем их необходимо центрифугировать. Пробы сыворотки можно хранить при — 20°С в течение 3 мес, а при —70°С больше 6 мес. Более продолжительное хранение проб сыворотки не гарантирует правильного определения концентрации Т, так как за это время может измениться сама технология определения гормона. Недопустимы также повторное замораживание и размораживание проб сыворотки, которые приводят к деструкции СССГ и неправильному определению уровня св. Т и био. Т. В случае определения Т с помощью экстракционного РИА-метода использование сыворотки или плазмы не имеет принципиального значения. Однако при применении неизотопных прямых методов исследования, включая автоматические анализаторы, необходимо использовать только сыворотку, так как в плазме определяется заниженная концентрация Т [8, 42]. Использование ЭДТА или цитрата для получения плазмы недопустимо для всех методов. Забор крови в стеклянные или пластиковые пробирки для получения сыворотки не влияет на результаты определения Т. Однако при использовании гелевого разделяющего компонента, что имеет место в вакуумтейнерах для взятия крови, происходит завышение результатов для об. Т до 28%, занижение уровня ФСГ на 43%, завышение общего Т₃ на 58%, Т₄ — на 34%. При одних и тех же ваккумтей- нерах разные анализаторы могут генерировать различные результаты при определении того или иного гормона. Более подробно влияние различных экзогенных и эндогенных факторов на уровень об. Т изложены в цитируемой работе [5].

Проблемы иммуноанализа тестостерона автоматизированными системами

Начиная с конца 60-х годов прошлого века основным методом определения об. Т в сыворотке являлся РИА-метод с предварительной экстракцией его этиловым эфиром. Он принципиально изменил возможности диагностики различных форм андрогенного дефицита. Однако использование радиоактивной метки в методах РИА создавало целый ряд проблем для гормональных лабораторий.

Наиболее популярной альтернативой РИА-методам стало развитие ИФА, где в качестве меченого компонента используется пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др. Несколько позднее были созданы флюоресцентные методы (меченый компонент — европий), метод усиленной люминесценции (меченый компонент — люминол или акридин).

В настоящее время широко используются автоматизированные высокопроизводительные системы определения самых разных гормонов, включая Т. Многие коммерческие диагностические компании используют технологии люминесцентного анализа с регистрацией усиленного люминесцентного сигнала. Все вышеназванные неизотопные методы являются "прямыми", т. е. определение об. Т проводится непосредственно в сыворотке, без предварительной экстракции его органическими растворителями, что увеличивает возможность одновременного определения и других стероидов, близких по химической структуре к молекуле Т.

Проведенный в последнее время целенаправленный анализ результатов определения Т в сыворотке крови с помощью автоматизированных систем по сравнению с референсным методом масс- спектрометрии показал наличие систематической ошибки анализаторов как в сторону завышения (в большинстве случаев), так и в сторону занижения уровня Т. В частности, обстоятельную работу опубликовали французские авторы [33], в ней проведена сравнительная характеристика 10 анализаторов с референсным методом масс-спектрометрии. Вывод авторов: использование вышеуказанной технологии прямых методов неприемлемо для определения низких концентраций Т у женщин и детей. Аналогичные результаты также опубликованы авторитетной группой авторов из США [41] и группой австралийских ученых [30]. Все авторы приходят к выводу о неприемлемости технологии прямых методов, включая ELISA, для определения низких концентраций Т, у мужчин и особенно у женщин и детей [17].

Аналогичные результаты были получены нами при сравнении 4 автоматизированных систем со стандартизированным РИА-методом [12]. Неприемлемое завышение результатов у мужчин было получено при определении концентрации об. Т ниже 10 нмоль/л (рис. 1). В результате принципиально снижается процент (до 20) выявления дефицита андрогенов, который, возможно, требует заместительной коррекции препаратами Т (рис. 2).

В 2004 г. в журнале "JCEM" была опубликована редакционная статья с аналогичными заключениями [22]. И, наконец, в начале 2007 г. напечатано официальное заявление Международной ассоциации эндокринологов о недопустимости использования прямых неэкстракционных методов для определения об. Т у женщин и детей, поскольку это

Рис. 1. Различия (в %) между концентрацией Т (медиана), полученной РИА- и неизотопными методами у мужчин с содержанием Т (по РИА) < 10 нмоль/л.

ведет к ошибкам в диагностике с последующим назначением неправильного лечения [27].

Методы масс-спектрометрии и их возможности

Любой из существующих методов иммуноанализа требует при его конструкции технологических разработок для каждого индивидуального гормона, включая основные компоненты, моноклональные антитела, с высокой специфичностью и чувствительностью. Особую сложность при создании тест- систем представляет класс стероидных гормонов и их активных метаболитов по химической структуре, многие из которых циркулируют в крови в очень низких концентрациях. Каждая диагностическая компания конструирует свой вариант метода, что затрудняет стандартизацию. Это одна из причин расхождения в результатах определения гормонов.

Появление и развитие современной технологии масс-спектрометрии в тандеме с высокоразрешающим жидкостным хроматографом, обеспечивающей высокую производительность, практически 100% специфичность, необходимую чувствительность и воспроизводимость, открывают новую эру в биохимии стероидов. В отличие от прежнего, технологически трудоемкого, комплекса газовый хро- матограф/масс-спектрометр (GCMS), современная тандем-масс-спектрометрия (TD-MS) не требуют трудоемкой процедуры подготовки исследуемого биологического материала. При наличии подготовленного специалиста TD-MS может быть использована и уже используется в развитых странах для рутинной диагностики в эндокринологических лабораториях. Сравнительно недавно группа авторов из США [14] опубликовала блестящую работу, в которой продемонстрированы возможности технологии TD-MS с использованием масс-спектрометра API-3000 одновременно определять за 11 мин в 0,2 мл сыворотки 12 основных стероидных гормонов: ДГЭА-С, альдостерон, кортизол, кортикостерон, 11-дезоксикортизол, андростендион, эстрадиол, Т, 17-гидроксипрогестерон, ДГЭА, прогестерон и 25-гидроксивитамин D. Четкое разделение близких по химической структуре стероидов с помощью газо-жидкостной хроматографии под высоким давлением (HPLC) было достигнуто всего за 11 мин. Продемонстрирована высокая надежность метода. Технология TD-MS высокопроизводительна и экономична по сравнению с современными автоматическими анализаторами, которые требуют больших затрат на постоянное приобретение дополнительных расходных материалов (Китов). В методе TD- MS расходные материалы сведены к минимуму. По всем вышеназванным параметрам MS-технология ближайшего будущего в гормональном анализе. Один подготовленный оператор может выполнять до 200 тестов в день. В настоящее время TD-MS получает широкое распространение, прежде всего в США для рутинной диагностики в эндокринологических лабораториях и прежде всего для определения основного спектра С21-, С19- и С18-стерои- дов, а также их многочисленных метаболитов. Уже в настоящее время в разных странах при выполнении скрининговых программ на выявление ВДКН у новорожденных с использованием в качестве маркера 17-альфа-гидроксипрогестерона метод TD-MS (API-3000) незаменим. Он выступает в качестве "арбитра" при наличии ложноположительных результатов, неизбежных при определении в кровяном пятне 17-альфа-гидроксипрогестерона методом флюоресцентного иммуноанализа (Дель- фия). При скрининге на каждый истинный случай ВДКН приходится до 200 ложноположительных результатов, которые требуют внесения ясности с использованием MS — API-3000.

В статье до кт. М. Kushnir и соавт. [20] представлен опыт использования метода TD-MS для определения низких концентраций Т у женщин и детей. По основным параметрам (чувствительность и специфичность) метод является высоконадежным и адекватным для оценки андрогенного баланса, практически исключает эффект матрикса, присущий всем прямым методам иммуноанализа автоматизированных систем. В приведенных табл. 1 и 2 авторы определяют физиологические колебания об. Т в зависимости от возраста мужчин и женщин

Рис. 2. Частота выявления андрогенного дефицита у 100 обследованных мужчин при сравнении с показателями Т, определенными РИА (1-я группа), и при использовании нормативов, указанных в инструкциях (2-я группа).

Таблица 1

Содержание СССГ, об. Т, св. Т и био. Т у детей

с использованием оптимальной выборки. Данные по содержанию св. Т. рассчитаны с использованием математической модели [37].

Приведенные показатели об. Т для мужчин молодого и среднего возраста, полученные методом TD-MS, противоречат общепринятым критериям нижней границы нормы, которая составляет 11 нмоль/л. Возможно, это связано с малой выборкой для данных возрастных групп. Вместе с тем величина пограничной точки отсчета норма -> дефицит Т остается открытым и дискуссионным.

В большой обзорной статье изложены достоинства, преимущества, надежность, реальные трудности и проблемы при использовании высокотехнологичного биоаналитического метода, каким является масс-спектрометрия в тандеме с высокоразрешающей жидкостной хроматографией [43].

Свободный тестостерон

Как указывалось выше, Т циркулирует в крови в комплексе со специфическим транспортным глобулином (СССГ) и неспецифическим белком альбумином, который имеет низкую аффинность, но большую емкость за счет высокой концентрации в крови. И только 1—2% Т циркулирует в крови в свободном виде. Константа ассоциации Т, связанная с СССГ, высокая (10⁹ л/моль), тогда как с альбумином она намного ниже (3,6 • 10⁴ л/моль). Приведенные параметры детерминируют и скорость диссоциации Т: с СССГ — около 20 с, а с альбумином — около 1 с, что определяет его биодоступность к тканям-мишеням при прохождении через стенку капилляра. Св. Т и связанный с альбумином Т обозначают как биологически активную форму гормона (био. Т).

Вопрос о биологической роли комплекса Т с СССГ остается открытым, большинство исследователей рассматривают его как буферную систему, препятствующую быстрой деградации Т в печени, а некоторые авторы допускают его биологическое негеномное действие через мембранные рецепторы клетки [29].

Соотношение между свободным и связанным с белками Т в физиологических условиях поддерживается на постоянном уровне. Однако при целом ряде патофизиологических ситуаций оно нарушается, прежде всего за счет изменения концентрации основного специфического транспорта белка СССГ. Стандартное обследование больного с подозрением на дефицит андрогенов начинается с определения об. Т, поэтому неизбежны ошибки в интерпретации полученных результатов, так как остается открытым вопрос о содержании св. Т и био. Т, которые определяют андрогенный статус пациента.

Биологическая значимость СССГ до настоящего времени до конца не раскрыта. Например, он продуцируется в печени только приматов (низших и человекообразных обезьян и человека). Его уровень не подчиняется суточному ритму, тогда как для уровня Т характерен такой ритм.

Поскольку концентрация циркулирующего СССГ влияет на содержание об. Т и св. Т и их соотношение, то необходимо помнить о наиболее значимых факторах, изменяющих содержание СССГ. Эндогенные и экзогенные эстрогены повышают его концентрацию, а андрогены, наоборот, снижают. Гормоны щитовидной железы увеличивают его продукцию, а при их недостатке концентрация циркулирующего СССГ уменьшается. Его содержание в крови детей выше, чем у взрослых. У мужчин старше 50 лет концентрация СССГ нарастает, в связи с этим снижается доля свободного биологически активного Т, усугубляя формирование возрастного гипогонадизма.

Согласно теории о свободных формах циркулирующих в крови гормонов, уровень св. Т отражает андрогенный статус более адекватно, чем содержание в крови об. Т [9]. Именно поэтому идентификация адекватных аналитических методов определения св. Т обеспечила бы наиболее оптимальную диагностику андрогенного статуса пациента. Комплекс св. Т/об. Т — термодинамическая система, в которой свободная фракция гормона зависит от концентрации как об. Т, так и связывающих бел-

Таблица 2

Содержание СССГ, об. Т, св. Т и био. Т в сыворотке у детей и взрослых разных возрастных групп

ков, а также от уровня ассоциации и диссоциации комплекса, что в свою очередь определяется температурой и pH [23]. Традиционно отделение св. Т от Т, связанного с белками, проводят методом равновесного диализа или методом ультрафильтрации (УФ), который появился позднее. При этом необходим ультрачувствительный и высокоспецифичный метод определения низкой концентрации св. Т в фильтрате.

Технология УФ, которая была предложена рядом авторов, действительно позволяет точно выделить свободную форму Т и других стероидов [15, 19]. Однако доступная в то время технология РИА не позволяла определять низкие концентрации св. Т с достаточной степенью точности.

В частности G. Hammond и соавт. [15] приводят результаты определения свободных стероидов (в % от общей фракции) с использованием комбинации УФ с диализом: у мужчин — эстрадиол 2,4, Т 1,97, прогестерон 2,76; у женщин в фолликулярной фазе эстрадиол 1,57, Т 0,9, прогестерон 2,85, в латентной фазе эстрадиол 1,52, Т 0,85, прогестерон 2,54.

Позже коммерческие диагностические компании разработали прямой безэкстракционный метод определения св. Т в сыворотке, который используется в ряде эндокринологических лабораторий, несмотря на обоснованные и аргументированные заявления о недопустимости его применения для оценки андрогенного статуса [25].

Долгое время метод равновесного диализа для определения св. Т и других стероидов рассматривался как "золотой стандарт". Однако с 2003 г. Европейский комитет по стандартизации диагностических систем и их компонентов принял решение о замене термина "золотой стандарт" определением "референсная измерительная процедура" (RMP). Для стероидных гормонов должна быть использована в качестве референсного метода TD-MS [31]. Принцип данного метода гарантирует точность, специфичность и снижение эффекта матрикса при количественном измерении Т или любого другого стероида. А для разделения комплекса об. Т/св. Т предложено использовать технологию УФ или равновесного диализа. Группа авторов, выполнив большое сравнительное исследование, рекомендовала использовать в качестве метода, разделяющего св. Т/об. Т, прямую, более простую технологию УФ вместо диализа с последующим количественным измерением концентрации св. Т референсным методом масс-спектрометрии [34]. При такой комбинации методов содержание св. Т в сыворотке мужчин составляло 1,8% от об. Т, а при использовании диализа 2,2%.

Определение свободного тестостерона в слюне

Неудовлетворительные и зачастую неприемлемые результаты определения об. Т автоматизированными системами послужили для нас основанием поиска альтернативных технологий и прежде всего прямого и доступного метода определения св. Т, как наиболее адекватного маркера андрогенного статуса как у мужчин, так и у женщин.

Однако прямое определение св. Т в крови сопряжено с технологическими трудностями, поэтому мы обратились к альтернативной биологической жидкости — слюне, куда поступают только свободные формы стероидов, включая Т.

Слюна как биологическая жидкость привлекла внимание исследователей почти 50 лет назад, так как слюнные железы обладают особенным свойством: в слюнной проток проникают соединения только с низкой молекулярной массой (< 400 Д), к которым относится и Т, не связанный с альбумином и специфическим глобулином. Концентрация жирорастворимых свободных стероидов, таких как Т, не зависит от скорости выделения слюны и соответствует уровню несвязанной формы стероида в сыворотке крови [35]. Если измерить адекватными методами концентрацию св. Т, который доступен тканям-мишениям и оказывает свое биологическое действие в этой форме, то его уровень в слюне мог бы стать идеальным маркером для определения андрогенного статуса как у мужчин, так и у женщин и детей, у которых уровень Т во много раз ниже.

Сбор слюны прост, не инвазивен и имеет большие преимущества перед традиционными методами определения стероидов в венозной крови, взятие которой требует квалифицированного персонала и само по себе является добавочным стрессор- ным фактором, способным искажать показатели гормонального статуса.

Необходимо отметить, что в процессе развития методов гормонального анализа неоднократно предпринимались попытки использования слюны в качестве биологической среды для диагностики гормональных нарушений. Однако РИА-методы, а в последующем и традиционные иммунофермент- ные методы не обеспечивали достаточной чувствительности, необходимой для определения низких концентраций свободных стероидов в слюне. Поэтому для анализа были необходимы большие объемы слюны (до 3 мл), после сбора слюны следовала процедура экстракции диэтиловым эфиром, который является огне- и взрывоопасным растворителем. В результате такую технологию было сложно адаптировать для рутинного использования в гормональных лабораториях для клинической диагностики.

Таблица 3

Характеристика исследуемых групп (медиана и 10/90-й процентили)

пмоль/л

700-1

600-

500-

400-

300-

200-

100-

-------------------------- 1--------------------------

День                 Вечер

0-I-----------------

Утро

Рис. 3. Суточная динамика св. Т в слюне у здоровых мужчин.

• — медиана, достоверность различий между угром и вечером р - 0,0012, между днем и вечером — р = 0,0006.

Диагностические наборы для прямого измерения свободных стероидов, в особенности в крови, пока не пригодны для диагностического исследования и могут использоваться лишь в научных целях [26, 33]. Как известно, группой A. Vermeulen [37] предложена формула для расчета концентрации св. Т на основе определения об. Т и СССГ в крови. В этом случае корректное определение концентрации св. Т в крови основано на четком знании истинной концентрации об. Т. Реально это непростая проблема, так как современные автоматизированные технологии для измерения об. Т дают совершенно разные результаты [12, 30, 33, 41]. Кроме того, требуется также оптимальный метод для определения СССГ, что значительно повышает стоимость вычисления концентрации св. Т.

Лишь появление современной технологии иммуноанализа, основанной на усиленной хемолюминесценции [4], сочетающей ультрачувствительность и высокую специфичность, сделало возможным определение свободных, не связанных с белками, стероидных гормонов в очень малых объемах слюны прямым методом (без экстракции). Высокая аналитическая (6,2 пмоль/л) и функциональная (17,3 пмоль/л) чувствительность позволяет количественно определять очень низкие (2—3 пг в пробе) концентрации Т в слюне, что особенно важно для диагностики андрогенного статуса у женщин и детей.

В наших исследованиях [2, 13] показано, что концентрация св. Т в слюне хорошо коррелирует и отражает концентрацию несвязанного Т в крови и является дополнительным существенным диагностическим критерием для определения андрогенного статуса мужчин. Были обследованы 35 здоровых мужчин в возрасте 21 года—57 лет и 30 мужчин с различными формами андрогенной недостаточности в возрасте 22 года—68 лет. Один пациент транссексуал-женщина (женщина -> мужчина) — сбор слюны осуществлялся утром до и после внутримышечного введения сустанона.

Процедура сбора слюны

Чтобы исследовать колебания концентрации Т, 3 порции слюны собирали в течение 1 ч трижды в день. Порции слюны собирали по следующей схеме: образец 1 — в 8 ч 30 мин; образец 2 — в 9 ч; образец 3 — в 9 ч 30 мин; образец 4 — в 15 ч 30 мин; образец 5 — в 16 ч; образец 6 — в 16 ч 30 мин; образец 7 — в 22 ч; образец 8 — в 22 ч 30 мин; образец 9 — в 23 ч.

Наш опыт показал, что правильный сбор слюны — ключевой момент в достижении точных и воспроизводимых результатов измерения св. Т. Для этого мы разработали детальную процедуру сбора слюны.

Образцы слюны необходимо собирать в специальные контейнеры (SaliCaps®, IBL) с трубочкой, изготовленные из материала, который не сорбирует стероиды. Слюна должна быть собрана не менее чем через 30 мин после еды, питья, чистки зубов или жевания жвачки. Требовалось примерно 2 мин, чтобы собрать необходимое количество слюны (0,6—0,8 мл). Образцы с небольшим окрашиванием из-за контаминации кровью необходимо исключить. Все образцы были помечены специальным маркером (имя пациента, дата, время). Собранная слюна могла храниться до 5 дней при 20°С, 10 дней при 2—8°С и 6 мес и более при —20°С. Св. Т измеряли в 50 мкл слюны в дубликатах.

Ниже приведены некоторые приемы для быстрого и простого сбора слюны:

• При сборе слюны не рекомендуется делать перерыв и удалять трубочку изо рта и/или из пробирки.
• Сбор слюны становится легче, если вы слегка сжимаете зубами верхний конец трубочки.
• Рекомендуется собирать слюну перед зеркалом, чтобы контролировать процесс наполнения пробирки.

Параллельно проводили определение содержания об. Т и СССГ в сыворотке крови.

Таблица 4

Суточная динамика св. Т в слюне (в пмоль/л) у здоровых мужчин и мужчин с андрогенным дефицитом (медиана и 10—90-й процентили)

Время сбора слюны, ч

пмоль/л

500-)

он---------------------------- 1------------------ 1------------------------ 1

Утро               День                 Вечер

Рис. 4. Суточная динамика св. Т в слюне больных мужчин с андрогенным дефицитом.

♦ — медиана, достоверность различий между утром и вечером р = 0,583, между днем и вечером р = 0,0006.

Определение св. Т проводили люминесцентным LIA-методом (фирма "IBL-Гамбург", Германия), основанном на принципе конкурентного связывания. Регистрацию люминесцентного сигнала осуществляли на мультианализаторе Victor (фирма "Wallac”, Финляндия). Определение об. Т в образцах крови проводили методом усиленной хемолюминесценции с помощью автоматизированного анализатора Vitros ECi ("Ortho-Clinical Diagnostics", "J&J", Великобритания) как наиболее адекватного метода [12].

Определение содержания глобулина, связывающего половые стероиды (СССГ), проводили методом отсроченной по времени флюоресценции с помощью автоматизированной системы Аи- todelfia (фирма "Wallac", Финляндия). Вычисление концентрации св. Т в крови осуществляли с помощью математической формулы, использующей показатели в крови об. Т и СССГ и описанной в работе A. Vermeulen [37] (калькулятор расчетного св. Т в Интернете http://www.issam.ch/ freetesto.htm).

Рис. 5. Сравнение показателей расчетного св. Т в крови и св. Т в слюне в утренние часы у здоровых мужчин.

Рис. 6. Сравнение показателей расчетного св. Т в крови (7) и св. Т в слюне (7) в утренние часы у пациентов с андрогенным дефицитом.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные были обработаны с помощью программы Statistica 6 Windows, StatSoft, Inc. Результаты представлены в виде медианы и 10/90-го процентилей. Для выявления достоверности различий между сравниваемыми параметрами был использован тест Манна—Уитни. Для оценки связи между различными показателями применяли ранговый тест Спирмена и линейный регрессионный анализ. При р < 0,05 различия считали статистически достоверными.

Концентрация об. Т, уровень СССГ, вычисленный св. Т в крови и средний возраст здоровых мужчин представлены в табл. 3.

Обнаружено, что сопоставимые по возрасту мужчины и мужчины с андрогенным дефицитом имели сравнимый уровень СССГ (медиана соответственно 36,1 и 33,0 нмоль/л). Однако уровень об. Т был значительно выше в группе здоровых

пмоль/л 800-1

700-

CV»9±7%

Недели

600-

500-

Рис. 7. Воспроизводимость концентрации св. Т в слюне в группе здоровых мужчин в течение 5 нед (сбор образцов слюны 1 раз каждую неделю).

Рис. 8. Динамика св. Т в слюне у транссексуала (женщина -> мужчина).

мужчин (18,8 и 6,7 нмоль/л соответственно). Концентрация вычисленного св. Т в крови у здоровых мужчин также была в 3 раза выше, чем у пациентов с андрогенным дефицитом (374 и 135 пмоль/л соответственно).

Средняя концентрация Т в слюне у здоровых мужчин (по 3 утренних образца от каждого, в 8 ч 30 мин—9 ч 30 мин) составляла 380 (270—544) пмоль/л, средняя концентрация днем и вечером — соответственно 80 ±15 и 71 ± 21 % от утренней концентрации (рис. 3, табл. 4).

В отличие от здоровых мужчин суточная динамика св. Т в слюне у больных с андрогенным дефицитом выражена менее заметно. Концентрации св. Т утром и днем практически не различались, статистически достоверное различие было обнаружено только вечером — 68 ± 29% от утреннего уровня (рис. 4, см. табл. 4).

Концентрация св. Т в слюне и расчетная концентрация св. Т в крови у здоровых мужчин практически не различались: 380 (270—544) и 374 (225— 544) пмоль/л (р = 0,111) (рис. 5), тогда как у пациентов с андрогенным дефицитом концентрация св. Т часто отличалась от вычисленной концентрации св. Т в крови. Медиана св. Т в трех утренних образцах слюны была выше (215 пмоль/л, разброс 55—249 пмоль/л), чем вычисленная концентрация св. Т в крови — 135 пмоль/л (разброс 9,3— 215 пмоль/л; рис. 6).

Чтобы изучить воспроизводимость концентрации св. Т в слюне во времени, мы собирали слюну в группе здоровых мужчин в течение 5 нед (1 раз в неделю, утром). В начале исследования (1-я неделя) концентрация св. Т у обследуемых была в пределах 180—745 пмоль/л. Последующие определения Т (2—5-я недели) показали высокую повторяемость результатов (коэффициент вариации 9%, разброс от 5 до 23%; рис. 7).

Следующий важный аспект — мониторинг заместительной терапии андрогенами по уровню св. Т в слюне. Мы проводили мониторинг определения св. Т в слюне у транссексуала (женщина -> мужчина) после лечения сустаноном. До лечения уровень общего и вычисленного св. Т в крови был очень низок (соответственно 3,9 нмоль/ и 42,3 пмоль/л). Через 1 нед после инъекции сустанона уровень об. Т в крови вырос на 29%, концентрация вычисленного св. Т в крови — на 140%, тогда как содержание св. Т в слюне увеличилось утром на 275% и вечером на 527% (рис. 8).

Мониторинг заместительной терапии андрогенами более адекватен при определении св. Т в слюне с помощью люминесцентного иммунного анализа (ЛИА-технологии). С этим методом достаточно просто изучать фармакокинетику в каждом отдельном случае, чтобы подбирать оптимальную дозу препарата и пути его введения.

Таким образом, с введением в практику очень чувствительной и специфичной ЛИА-технологии концентрация Т в слюне может быть широко использована как объективный и адекватный гормональный критерий в диагностике различных форм гипогонадизма у мужчин, а его определение ЛИА- методом может служить методом выбора для целого ряда научных исследований, мониторинга и лечения гонадальных дисфункций, включая изучение фармакокинетики производных Т при заместительной терапии.