Интенсивность фрагментации ДНК в ткани и карциномах щитовидной железы человека и ее изменение под влиянием α-токоферола и ионов йода in vitro

Межнуклеосомное расщепление (фрагментация) ДНК — одно из биохимических проявлений апоптоза

 [6], который ответственен за элиминацию трансформированных клеток и играет важную роль в контроле величины клеточной популяции. В то же время широко распространенное мнение о снижении апоптоз- ной активности в злокачественных опухолях справедливо только для определенных их типов [16].

Для щитовидной железы (ЩЖ) наибольшая интенсивность апоптоза установлена в медуллярных, анапластических и оксифильноклеточных аденокарциномах [15, 19], тогда как в папиллярных и фолликулярных аденокарциномах его уровень низок [16]. Морфологическими исследованиями выяснено, что апоптозный индекс в папиллярных карциномах существенно выше, чем в фолликулярных и медуллярных карциномах, где он равен нулю [6]. В то же время при сравнении интенсивности апоптоза в папиллярных карциномах ЩЖ было установлено, что в 41% карцином апоптозная активность была на следовом уровне, характерном для нормальной ткани, в 44% — низкой, а в 15% — высокой [13], что мжет быть объяснено как разной скоростью роста опухолей (в быстрорастущих опухолях повышен индекс "оборота" клеточной популяции), так и стадией их развития.

Целью настящей работы явилось исследование интенсивности межнуклеосомной фрагментации ДНК в ткани ЩЖ и карциномах ЩЖ человека. Особый интерес при этом представляло выяснение влияния на фрагментацию ДНК а-токоферола и ионов йода. Установлены роль активных радикалов кислорда в инициации митохондриальных механизмов апоптоза и нарушение последних в клетках папиллярных карцином [17]. Ионы йода в свою очередь дают в тиреоцитах дозозависимый эффект на сигнальные механизмы инициации апоптоза, связанные с участием рецепторов смерти, а также снижают чувствительность клеток папиллярной карциномы к апоптозным стимулам [20]. С другой стороны, известно мнение о том, что токсичность для тиреоцитов избытка молекулярного йода, который образуется при окислении ионизированного эндогенными пероксидазами, связана с образованием активных форм кислорода, продуктов перекисного окисления липидов и активацией апоптоза клеток ЩЖ [18].

В литературе приведены данные, в том числе и для опухолей ЩЖ [19], свидетельствующие о том, что регистрация межнуклеосомной фрагментации ДНК не может быть абсолютным доказательством смерти клетки в результате апоптоза. Строго говоря, наличие фрагментации ДНК указывает на апоптоз лишь в сочетании с анализом характерных для него морфологических изменений или с регистрацией активации каспаз. Учитывая тот факт, что электрофоретическое разделение ДНК на олиго- нуклеосомные фракции в большинстве своем является качественным подтверждением ее межнуклеосомной фрагментации, используют также и различные количественные методы определения содержания растворимых полидезоксинуклеотидов [4, 5, 10]. При этом считают достаточным подтверждение апоптоза одновременным электрофоретическим анализом ДНК ("апоптозная лесенка"). Указанное выше принимали во внимание при обсуждении полученных результатов и формулировании осторожных выводов об уровне апоптоза в опухолях ЩЖ и о возможных механизмах влияния а-токоферола и ионов йода на межнуклеосомную фрагментацию ДНК.

Материалы и методы

На проведение исследований было получено разрешение Комитета института по биоэтике.

Исследовано 20 образцов опухолей ЩЖ (16 папиллярных аденокарцином и 4 фолликулярные аденокарциномы). Средний возраст больных этой группы составил 36,3 года (от 19 до 70 лет), среди них 12 женщин и 8 мужчин. В группу сравнения включены 15 образцов неизмененной (заключение патолога — "ткань нормофолликулярного строения без особенностей") ткани ЩЖ, полученной при субтотальной резекции железы по поводу эутиреоидного узлового зоба или аденомы, а также при тотальной тиреоидэктомии по поводу рака ЩЖ. Возраст больных (8 женщин и 7 мужчин) колебался от 17 до 54 лет (37,4 года).

Концентрацию растворимых низкомолекулярных фрагментов ДНК определяли после лизиса клеток в надосадочной жидкости, а высокомолекулярных — в осадке в реакции с дифениламином [4]. ДНК выделяли из ткани ЩЖ ранее описанным методом [3] после предварительной инкубации срезов железы на протяжении 4 ч при 37°С в 1 мл Кребс— Рингер-фосфатного буфера [4]. В пробы вносили соответственно растворы а-токоферола или йодида калия (KI) до конечной расчетной концентрации 10^_3 М или 10~⁷ М. а-Токоферол предварительно растворяли в небольшом количестве этилового спирта, после чего готовили его буферные растворы. В одну пробу препараты не вносили и рассматривали интенсивность фрагментации ДНК в ней как базальную.

Электрофорез ДНК проводили в агарозном геле [3]. Локализацию фрагментов ДНК на геле определяли в трансиллюминаторе, фореграммы с цифровых фотографий сканировали, используя программу "Photo Capt Mw", с помощью последней рассчитывали относительное содержание фракций олигонуклеосом. Эффект препаратов оценивали в процентах от базального уровня (± Д%). Полученные данные обработаны статистически с использованием критерия t Стьюдента и непараметрических критериев Вилкоксона и Манна—Уитни. Критический уровень значимости принимали равным 0,05. В таблицах данные представлены как М ± т.

Результаты и их обсуждение

Как следует из данных, представленных в табл. 1, содержание высокомолекулярной ДНК (в составе хроматина) в ткани папиллярных аденокарцином оказалось выше, чем в неизмененной ткани ЩЖ. Более значимые изменения наблюдались в опухолях, размер которых соответствовал стадии Т₄ и опухолях фолликулярно-папиллярного строения. В то же время концентрация низкомолекулярных фрагментов ДНК (растворимые полидезоксинуклеотиды, которые выходят после фрагментации ДНК из ядра в цитоплазму) и их доля в ткани папиллярных карцином ниже, чем в неизмененной ткани ЩЖ, при этом не отмечено значительных различий уровня фрагментированной ДНК в зависимости от размера опухоли. Доля фрагментированной ДНК наиболее низка в папиллярных карциномах фолликулярно-папиллярного строения, менее значительно это снижение в опухолях типичного папиллярного строения. Полученные данные

Таблица 1. Концентрация ДНК и доля фрагментированной ДНК в неизмененной ткани и ткани карцином ЩЖ

Примечание. • — р < 0,05 в сравнении с уровнем в неизмененной ткани; ⁶ — р < 0,05 в сравнении с уровнем в ткани папиллярной карциномы;" — р < 0,05 в сравнении с уровнем в ткани папиллярной карциномы фолликулярно-папиллярного строения.

подтверждают мысль о том, что решающее значение в формировании опухоли конкретного типа имеет баланс между противоположно направленными процессами — пролиферацией и элиминацией трансформированных клеток [6]. В то же время в трех опухолях солидно-фолликулярного строения, исследованных в работе, существенных изменений уровня ДНК и доли фрагментированной ДНК не отмечено (см. табл. 1). О разной апоптоз- ной активности в различных образцах папиллярных карцином свидетельствуют и данные литературы [13].

Анализ выявленных изменений концентрации ДНК в папиллярных карциномах ЩЖ в зависимости от пола больных показал, что более высокая концентрация высокомолекулярной ДНК, а также более низкая концентрация и доля фрагментированной ДНК в ткани папиллярных карцином по сравнению с таковыми в нормальной ткани ЩЖ наблюдается только в опухолях, удаленных у женщин. В опухолях мужчин эти изменения были значительно менее выражены (табл. 2). Показано, что эстрадиол стимулирует пролиферацию фолликулярных клеток, увеличивая при этом соотношение содержания анти- и проапоптозных белков — Вс1- Х[/Вах — за счет надэкспрессии первого [12]. Тестостерон не дает такого эффекта. Эти данные обсуждают в плане известного факта повышенного в 2—3 раза риска возникновения карцином ЩЖ у женщин по сравнению с мужчинами.

В ткани фолликулярных аденокарцином отмечен повышенный уровень низкомолекулярной ДНК и ее доли при неизмененной концентрации высокомолекулярной ДНК (см. табл. 1). Величина этих показателей в ткани фолликулярной и папиллярной карцином существенно различалась. Немногочисленные данные литературы не позволяют составить четкого представления о различиях в интенсивности апоптоза в папиллярных и фолликулярных аденокарциномах. Так, в одних исследованиях показана одинаково низкая апоптозная активность в ткани этих карцином ЩЖ [16], в других — апоптозный индекс в папиллярных карциномах был существенно выше, чем в фолликулярных [6].

В условиях предварительной инкубации срезов ткани, выделения ДНК и проведения электрофореза в образцах, полученных из внеузловой неизмененной ткани ЩЖ больных, четко делятся фрагменты ДНК, отвечающие размерам 200, 400, 600 и 800 п. о., образуя характерную "апоптозную лесенку" [3]. Наибольшее количество фрагментов при электрофорезе ДНК из неизмененной ткани ЩЖ приходится на фракцию мононуклеосом (200 п. о.), а суммарное количество моно-, ди-, три- и тетрануклеосом составило около 1/3 от общего количества ДНК (табл. 3).

Суммарное содержание олигонуклеосом, которые регистрируются на электрофореграммах ДНК, выделенной из ткани папиллярной карциномы, значительно ниже, чем на электрофореграммах ДНК, выделенной из неизмененной ткани ЩЖ (см. табл. 3), как и общая концентрация фрагментированной ДНК, содержание которой определяли спектрофотометрически (см. табл. 1). Статистически значимые различия были установлены для тетра-, три- и особенно мононуклеосом, а более четко — в опухолях категории Т₂—Т₃: в этом случае снижен также уровень и динуклеосом. Концентрация фрагментированной ДНК также несколько ниже в опухолях категории Т₂—Т₃ (см. табл. 1). Обсуждая эти данные, прежде всего следует указать на более выраженную интенсивность фрагментации ДНК на ранних стадиях опухолевого роста [5] и на уменьшение активности Са²⁺-, Mg^-зависимой эндонуклеазы по мере прогрессирования процесса трансформации [9]. Известно также, что недоступность сайтов ДНК для эндонуклеаз может быть обусловлена такими структурными перестройками хроматина, в основе которых лежит экранирование чувствительных для эндонуклеаз участков вследствие образования ковалентных сшивок ДНК—белок. Последние являются результатом повреждения молекулы ДНК, что имеет место и при канцерогенезе.

Таблица 2. Концентрация ДНК и сдержание фрагментированной ДНК в неизмененной ткани и в ткани папиллярной карциномы ЩЖ мужчин и женщин

Примечание. * — р < 0,05 в сравнении с уровнем в неизмененной ткани; ** — р < 0,05 в сравнении с уровнем в ткани папиллярной карциномы женщин.

Таблица 3. Содержание олигонуклеосом (в %) в неизмененной ткани и ткани карцином ЩЖ

Примечание. * — р < 0,05 в сравнении с уровнем в неизмененной ткани; ** — р < 0,05 в сравнении с уровнем в ткани папиллярной карциномы категории Т₂—Т₃; *** — р < 0,05 в сравнении с уровнем в ткани папиллярной карциномы.

Учитывая тот факт, что в большинстве случаев межнуклеосомная фрагментация ДНК может служить показателем гибели клеток путем апоптоза, полученные данные о снижении интенсивности стимулированной межнуклеосомной фрагментации ДНК одновременно с уменьшенным суммарным уровнем фрагментированной ДНК позволяют предположить, что в папиллярных карциномах ЩЖ (особенно в карциномах ЩЖ женщин) наблюдается существенное торможение терминальной стадии этого механизма.

В отличие от папиллярной карциномы в ткани фолликулярной карциномы одновременно со сниженным уровнем мононуклеосом наблюдали несколько повышенное содержание тетра-, три- и динуклеосом (см. табл. 3). Вследствие этого суммарное содержание олигонуклеосом, которые регистрируются на электрофореграммах ДНК, существенно не отличалось от такового на электрофореграммах ДНК, выделенной из неизмененной ткани ЩЖ. Учитывая тот факт, что общее содержание низкомолекулярной ДНК в ткани фолликулярной карциномы повышено (см. табл. 1), можно осторожно говорить об ускорении фрагментации ДНК в участках хроматина, расщепление которых приводит к высвобождению олигонуклеосом большого размера, и торможении фрагментации ДНК, приводящей к образованию мононуклеосом. Таким образом, в фолликулярных карциномах интенсивность межнуклеосомной деградации ДНК меняется менее значительно и не так однозначно, следовательно нет оснований говорить о существенном изменении уровня апоптоза в этих карциномах. Ряд данных литературы также свидетельствует в пользу такого вывода [6, 13, 16].

При исследовании влияния а-токоферола на межнуклеосомную фрагментацию ДНК было установлено, что в нормальной ткани ЩЖ препарат в концентрации 10^-7 М тормозил ее интенсивность (см. рисунок, а) за счет снижения образования моно-, три- и тетрануклеосом (-44,2 ± 7,99, —22,0 ± 5,10 и —19,8 ±4,21% соответственно к базальному их уровню, р < 0,05). В ббльшей концентрации (10^_3 М) препарат существенно не влиял на интенсивность стимулированной межнуклеосомной фрагментации ДНК.

Представленные результаты о торможении стимулированной фрагментации ДНК в неизмененной ткани ЩЖ больных под влиянием а-токоферола вполне соответствуют современным представлениям о возможных механизмах влияния антиоксидантов на апоптозные процессы, в первую очередь о предотвращении открытия неспецифической митохондриальной поры вследствие снижения уровня активных форм кислорода или продуктов перекисного окисления липидов. Так, в присутствии а-токоферола наблюдали торможение индуцированной под действием Н₂О₂ фрагментации ДНК в тимоцитах [2], а инкубация митохондрий сердца крыс с растворимым аналогом витамина приводила к угнетению открытия митохондриальной поры в условиях окислительного стресса [8].

Показано, что межнуклеосомной фрагментации ДНК предшествует снижение в клетке соотношения восстановленный/окисленный глутатион, который занимает едва ли не центральное место в антиоксидантной защите организма. Усиление антиоксидантных свойств токоферолов связывают с синергизмом их действия с другими антиоксидантами, в первую очередь с глутатионом [1]. Еще одним возможным звеном влияния а-токоферола на меж- нуклеосомную фрагментацию ДНК может быть устранение действия активных соединений кислорода на эндонуклеазы, которые принимают непосредственное участие в деградации ДНК. Активация этих ферментов под влиянием окислительного стресса происходит вследствие повышения уровня свободного Са²⁺, который высвобождается в этих условиях из депо одновременно с торможением удаления его избытка за пределы клетки из-за окисления тиоловых групп в структуре трансмембранных каналов [ 1].

Следует отметить, что в действии препарата четко прослеживается дозозависимость его влияния. Снижение эффекта а-токоферола с увеличением его концентрации может быть связано с тем фактом, что перехват переокисленных радикалов липидов, который является основным антиоксидантным механизмом действия токоферолов, происходит при их физиологических концентрациях, тогда как избыток витамина Е может действовать даже прооксидантно [1]. Эффекты токоферолов зависят от их химической структуры, природы агентов, повреждающих клетки, и, возможно, от вида клеток. Так, а-токоферол в концентрации 10^-4 М не влиял на фрагментацию ДНК в тимоцитах при индукции апоптоза инкубацией клеток в течение 18 ч, уменьшал ее при стимуляции апоптоза Са²⁺-ионофором и существенно повышал в условиях развития Са²⁺- цитотоксичности [7].

Инкубация срезов неизмененной ткани ЩЖ с йодидом калия (KI) в концентрации 10^-7 М приводила к снижению интенсивности стимулированной фрагментации ДНК (см. рисунок, б) за счет уменьшения содержания моно- и динуклеосом (-32,1 ± 11,5 и —28,2 ± 7,4% соответственно к базальному их уровню, р < 0,05). KI в большей концентрации не влиял на содержание олигонуклеосом в неизмененной ткани ЩЖ.

Результаты большинства исследований свидетельствуют о повышении интенсивности апоптоза в ЩЖ животных при введении им йодсодержащих препаратов, содержании на диете с высоким содержанием йода или в опытах на тиреоцитах при действии ионов йода in vitro [10, 11]. При этом увеличение количества апоптозных клеток сопровождается снижением уровня экспрессии Вс1-2 и повышением экспрессии Вах. В то же время при апоптозе, индуцированном антителами к рецептору смерти Fas, высокая концентрация йодида повышала, а низкая снижала его интенсивность в первичной культуре тиреоцитов человека [20]. Результаты наших исследований свидетельствуют о торможении под действием низкой дозы KI межнуклеосомной фрагментации ДНК, стимулированной инкубацией срезов ткани ЩЖ-

Обращает на себя внимание подобие эффектов а-токоферола и KI на фрагментацию ДНК в неизмененной ткани ЩЖ (см. рисунок). Считают, что в реализации механизмов апоптоза при действии молекулярного йода определенную роль может играть снижение уровня тиолов и реактивных соединений кислорода [14]. Исследования с использованием линии иммортализованных тиреоидных клеток, а также первичной культуры клеток ЩЖ человека показали, что апоптоз при действии йода был р53- независимым, не сопровождался синтезом белков и изменениями экспрессии анти- или проапоптоз- ных белков (Bcl-2, Bcl-_XL, Вах) [18]. Предполагают, что важнейшими при этом являются повышение уровня активных форм кислорода, продуктов перекисного окисления липидов и активация митохондриального пути инициации апоптоза.

Высказано предположение, что эффект йодида на апоптоз тиреоидного эпителия является непрямым, а опосредуется йодированными производными, в частности полиненасыщенными жирными кислотами — йодолактонами [11]. Альтернативное мнение отводит решающее место в действии йода на фрагментацию ДНК его влиянию на синтез полиаминов, которые, отвечая за структуру хроматина и контролируя активность эндонуклеаз, контролируют и интенсивность межнуклеосомной фрагментации ДНК [10]. Следовательно, вопрос о возможных механизмах, реализация которых приводит к изменению межнуклеосомной фрагментации ДНК, как одного из проявлений апоптоза, в неизмененной ткани ЩЖ под влиянием йодида остается невыясненным и дискуссионным.

Эффект обеих доз а-токоферола в ткани папиллярной карциномы отсутствовал, а в ткани фолликулярной карциномы препарат в концентрации КГ⁷ М оказывал влияние, подобное, но менее выраженное и менее закономерное (0,1 > р > 0,05), таковому в неизмененной ткани ЩЖ (см. рисунок, а). Характер действия ионов йода в концентрации 10^-7 М на межнуклеосомную фрагментацию ДНК в ткани фолликулярной карциномы ЩЖ также остался подобным таковому в неизмененной ткани — суммарное содержание моно-, ди-, три- и тетрануклеосом был сниженным (см. рисунок, б), хотя эти изменения были менее выражены (0,1 > р > 0,05), чем в неизмененной ткани. В то же время обе концентрации йодида не влияли на интенсивность межнуклеосомной фрагментации ДНК в ткани папиллярной карциномы ЩЖ.

Выяснение факта отсутствия влияния а-токоферола и ионов йода в папиллярных карциномах и подобного таковому в неизмененной ткани ЩЖ "ответу" клеток фолликулярной аденокарциномы на действие препаратов требует дальнейших исследований, однако можно высказать предположение о сохранении определенного уровня внутриклеточных механизмов регуляции и реализации апоптоза в фолликулярных карциномах и о недееспособности таковых в папиллярных аденокарциномах. Это может быть связано с различиями характера процессов трансформации эпителиальных клеток ЩЖ в случае формирования фолликулярных и папиллярных карцином.

Показано, что скорость деления клеток находится в обратной зависимости от уровня свободных радикалов. В клетках злокачественных опухолей наблюдается значительное снижение активности механизмов антиоксидантной защиты, однако эта недостаточность компенсируется путем накопления в опухолях жирорастворимых антиоксидантов, в первую очередь а-токоферола. В этих условиях способность активных форм кислорода тормозить деление клеток в опухоли снижается. Важно отметить, что реализация указанных механизмов существенно зависит от природы опухоли и стадии ее развития [1] .

Выводы

1. Концентрация фрагментированной (низкомолекулярной) ДНК и интенсивность стимулированной межнуклеосомной фрагментации ДНК в ткани папиллярной аденокарциномы значительно снижены. В ткани фолликулярной аденокарциномы уровень фрагментированной ДНК повышен, а интенсивность межнуклеосомной фрагментации ДНК существенно не отличается от таковой в нормальной ткани ЩЖ.
2. а-Токоферол и KI in vitro в концентрации 10^-7 М снижают интенсивность стимулированной межнуклеосомной фрагментации ДНК в нормальной ткани ЩЖ и менее значительно в ткани фолликулярных карцином. Эффект препаратов в ткани папиллярных карцином отсутствует.