Влияние кортикостероидов в комплексе с аполипопротеином А-1 на биосинтез белка в культуре гепатоцитов

Ранее было показано, что липопротеины различных классов (очень низкой плотности — ЛПОНП, низкой плотности — ЛПНП и высокой плотности — ЛПВП) являются транспортной формой стероидных гормонов в крови [2]. Методом тушения триптофановой флюоресценции показано, что стероиды в липопротеинах взаимодействуют с белками. Для ЛПВП таким белком является аполипопротеин A-I (апоА-I). Константа ассоциации (К_асс) апоА-I с кортизолом оказалась равной 1,66- 10^б М^_|. Для сравнения укажем, что К_асс с транскортином для широкого спектра кортикостероидов равна 3 • 10⁷ М^_| [7]. Для ЛПВП К_асс с кортизолом составляет 4 • 10⁶ М^_|, т. е. является величиной сопоставимой [10]. Возникает вопрос, какой класс биологических явлений стоит за этой транспортной формой стероидных гормонов?

С помощью иммунохимических методов апоА-1 был обнаружен нами в ядрах клеток многих органов и тканей: головной мозг, печень, почки, легкие, сердце, мышцы, надпочечники, семенники, селезенка, костный мозг [3, 4]. Оказалось, что апоА-I присутствует в транскрипционно активном хроматине, ядерном матриксе и во фракции кислых негистоновых белков, а значит имеет отношение к регуляции экспрессии генов. В настоящее время выяснены молекулярные механизмы этого явления [9, 10]. Они связаны с взаимодействием комплексов восстановленных форм стероидных гормонов и апоА-I с GC-богатыми участками ДНК, с разрывом водородных связей в GC-napax, взаимодействием РНК-полимеразы с одноцепочечными участками ДНК [5]. Данный механизм был наиболее полно раскрыт при изучении такой пары стероидных гормонов как кортизол и его восстановленная форма — тетрагидрокортизол (ТГК). Однако неясно, распространяется ли упомянутый механизм действия на другие гормоны? В связи с этим мы провели сравнительные исследования данной пары гормонов и таких стероидных гормонов, как андростерон и дегидроэпиандростеронсульфат (ДГЭАС).

Материалы и методы

Работа выполнена на изолированных гепатоцитах крыс-самцов линии Вистар массой 180—200 г. Гепатоциты выделяли методом ре циркулятор ной ферментативной перфузии с использованием 0,03% раствора коллагеназы ("ICN Biomedicals, Inc", США) и отделяли от непаренхимных клеток с помощью дифференциального центрифугирования. Жизнеспособность клеток, оцениваемая методом исключения трипанового синего ("Serva", Германия), составляла не менее 90%. Инкубацию проводили в СО₂-инкубаторе ("Cole-Parmer", США) в атмосфере, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха.

Липопротеины плазмы крови выделяли методом ультрацентрифугирования в растворах КВг на центрифуге Optima L-90K. ("Beckman-Coulter", Австрия). Делипидирование фракций ЛПВП проводили охлажденной смесью этанол—ацетон (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром. АпоА-I выделяли методом гель-фильтрации на колонке 1,6x100 см с сефарозой CL-6B ("Amersham Biosciences", Швеция). Анализ чистоты апоА-I проводили методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия ("Serva", Германия).

Комплекс апоА-I со стероидными гормонами получали, выдерживая их смесь в молярном соотношении 1:2. Концентрация апоА-I в среде инкубации составляла 60 мкг/мл. В работе использовали кортизол, андростерон, ДГЭАС ("Amersham", Англия). ТГК был любезно предоставлен академиком РАМН Ю. А. Панковым (Институт экспериментальной эндокринологии РАМН).

Скорость биосинтеза белка в культуре гепатоцитов определяли по включению радиоактивной метки в количестве 2 мкКи/мл среды, используя ¹⁴С- лейцин ("Amersham", Англия). Радиоактивность образцов измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике ("Mark-Ш", США) и выражали в имп/мин на 1 мг белка. Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью Г-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

В работе использовали андростерон — метаболит тестостерона и андростендиона, в котором оксигруппа гормона в 3-м положении и водород в 5-м положении находятся в транс-позиции; ДГЭАС — гормон сетчатой зоны коры надпочечников, в котором оксигруппа в 3-м положении кольца А заменена на сульфогруппу, находящуюся в цис-позиции, а углерод в 5-м положении не имеет атомов водорода; кортизол — гормон пучковой зоны коры надпочечников, содержащий А⁴, 3-кетогруппу в кольце А, и тетрагидрокортизол — основной метаболит кортизола, содержащий восстановленную А⁴, 3-кетогруппу в A-кольце в транс-позиции и водород в 5-м положении в цис-позиции и считавшийся неактивной формой гормона [8]. Структуры этих гормонов представлены на рис. 1. Отражаются ли структурные особенности гормонов на их биологических свойствах, в частности на скорости биосинтеза белка?

Оказалось, что скорость биосинтеза белка под влиянием комплекса андростерон—апоА-I не изменялась по сравнению с действием одного апоА-I и контроля (рис. 2). Комплекс ДГЭАС—апоА-I резко усиливал скорость биосинтеза белка, как по сравнению с действием одного апоА-I или одного гормона, так и по сравнению с контролем. Комплекс кортизол—апоА-1 не влиял на скорость включения ^|4С-лейцина в белок гепатоцитов, в то время как комплекс ТГК—апоА-I значительно ее усиливал, как по сравнению с действием одного апоА-I, так и по сравнению с действием одного гормона. Однако самый высокий результат оказался в случае использования комплекса ДГЭАС—апоА-1.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что для проявления биологического эффекта (усиления биосинтеза белка) в стероидных гормонах должна присутствовать оксигруппа в 3-м положении A-кольца, которая может быть заменена на сульфогруппу. Наличие водорода у 5-го углеродного атома необязательно. Хотя его присутствие (цис- или транс-позиция) может иметь значение при взаимодействии комплекса с ДНК. Вероятно, то же можно сказать и о позиции оксигруппы в 3-м положении A-кольца. Для биологического действия гормона предпочтительнее цис-позиция.

Следует отметить, что восстановленные формы стероидных гормонов (тетрагидросоединения) оказывают биологическое действие в комплексе с апоА-I. Данные комплексы образуются в резидентных макрофагах при кооперативном захвате ЛПВП и стероидных гормонов [9]. Не менее важная роль принадлежит дегидроэпиандростерону, который синтезируется в основном в сульфатированной форме. Функция этого гормона до конца не изучена, однако есть указание на то, что он принимает участие в регуляции транскрипции [6]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что это может происходить при участии комплекса ДГЭАС—апоА-I. Формирование такого комплекса было подтверждено нами с помощью ИК-спектроскопии и методом тушения триптофановой флюоресценции.

Таким образом, указанные различия в структуре стероидных гормонов наиболее важны при взаимодействии соответствующих комплексов с ядерной ДНК. Другие группы стероидных гормонов принципиальной роли в данном механизме не играют. ЛПВП, как транспортная форма стероидных гормонов, определяют участие последних в усилении биосинтеза белка. Мы полагаем, что это имеет прямое отношение к регуляции таких процессов, как пролиферация клеток и внутриклеточная регенерация.

Выводы

1. Восстановленные формы стероидных гормонов (тетрагидросоединения) обладают высокой биологической активностью. В комплексе с апоА-1 они повышают скорость биосинтеза белка в гепатоцитах.
2. ДГЭАС в комплексе с апоА-I усиливает скорость биосинтеза белка в гепатоцитах, что подтверждает участие этого гормона в регуляции экспрессии генов.
3. В механизме усиления биосинтеза белка важную роль играет оксигруппа в 3-м положении А-кольца стероидных гормонов, которая может быть заменена на сульфогруппу.
4. Андростерон, у которого оксигруппа в 3-м положении A-кольца и водород при 5-м углеродном атоме находятся в транс-позиции, не обладает биологической активностью. Более предпочтительной для биологического эффекта является цис-позиция этих групп.