ГАМК-рецепторные системы мозга при дисфункции щитовидной железы

Гормоны щитовидной железы играют ключевую роль в развитии и нормальной функции мозга у позвоночных животных. Еще в ранних клинических наблюдениях и экспериментах на животных было отмечено, что при гипертиреозах ослабляются все виды торможения в ЦНС, и прежде всего преси- наптическое торможение, а при гипотиреозах, наоборот, ослабляются процессы возбуждения.

Гамма-аминомаслянная кислота (ГАМК) является основным тормозным нейромедиатором мозга. По данным радиоавтографии, от 20 до 40% всех синапсов мозга являются ГАМК-эргическими [6]. К настоящему времени получены убедительные доказательства о многостороннем взаимовлиянии тиреоидной и ГАМК-эргической регуляторных систем и основное действие тиреоидных гормонов на функции ЦНС опосредуется именно через тормозную ГАМК-эргическую передачу [15]. В экспериментах in vivo и in vitro на крысах и мышах получены данные, которые указывают, что тиреоидные гормоны действуют на различные компоненты ГАМК-эргической системы. Показано влияние тиреоидных гормонов на ферменты, ответственные за синтез и деградацию ГАМК, высвобождение ГАМК и ее обратный захват нервными клетками, экспрессию ГАМК-рецепторов генами и их постсинаптическую функцию [15].

У взрослых животных при гипотиреозе в основном увеличивается активность ферментов, синтезирующих ГАМК, и поэтому уровень ГАМК повышен. При гипертиреозе, наоборот, активность этих ферментов понижена, и уровень ГАМК снижен. Но, как показали исследования in vitro, этот эффект наблюдается не всегда, так как тиреоидные гормоны увеличивают высвобождение ГАМК из пресинаптиче- ских терминалей и подавляют обратный захват ГАМК, поэтому присутствие тиреоидных гормонов в синапсе может продлить действие ГАМК после ее высвобождения. Этот эффект тиреоидных гормонов опосредован через связывание их с цитоплазматическими и ядерными рецепторами [15].

Имеются и противоречивые данные о действии долговременных изменений в уровнях тиреоидных гормонов на обратный захват ГАМК. В экспериментах in vivo увеличение или уменьшение уровней тиреоидных гормонов изменяет плотность связывающих сайтов для ГАМК и бензодиазепинов в ГАМК_А-рецепторах мозга, но результаты варьируют от исследования к исследованию, что может отражать важные региональные различия в мозге [15]. Имеются данные, полученные в экспериментах in vitro, что тиреоидные гормоны неконкурентно ингибируют ГАМК-стимулируемые хлорные токи через связывание с ядерными рецепторами, находящимися в цитоплазме [7].

В щитовидной железе, как и в ЦНС, выявлены ГАМК-транспортирующие системы и ферменты синтеза и деградации ГАМК, которые чувствительны к тиреоидным гормонам. Показано, что у крыс и людей, ГАМК ингибирует высвобождение из гипофиза тиреоидстимулирующего гормона. ГАМК также ингибирует стимулируемое тиреотропным гормоном высвобождение тиреоидных гормонов из щитовидной железы. Таким образом, эти исследования доказывают, что имеется тесная взаимосвязь между тиреоидной и ГАМК-эргической регуляциями у позвоночных животных [15].

Представление о том, что основное действие тиреоидных гормонов на ЦНС опосредуется через тормозную ГАМК-эргическую передачу стало формироваться только в последние 2—3 года. Некоторые экспериментальные работы противоречат друг другу. В этой связи представляются актуальными проверка и уточнение данных разных авторов о влиянии тиреоидных гормонов на ГАМК-эргическую систему. Целью настоящей работы явилось изучение плотности мусцимол- и бензодиазепинсвязываю- щих участков в ГАМКА_А-рецепторном комплексе при экспериментальном гипо- и гипертиреозе.

Материалы и методы

Эксперименты были проведены на 50 крысах обоего пола. Гипотиреоз воспроизводили введением ингибитора синтеза тироксина — мерказолила в суточной дозе 5 мг/кг в течение 2 мес внутрижелу- дочно, ежедневно. Гипертиреоз воспроизводили также ежедневным внутрижелудочным введением L-тироксина в дозе 100 мкг/кг в течение 2 мес. Данные модели являются классическими и широко применяются в экспериментальной медицине [1]. В работе использовались следующие приборы и реактивы: сахароза, трис-(оксиметил)-аминометан, соляная кислота "Реахим", "хч" (Россия), ³Н-мус- цимол (15 Ки/ммоль), ³Н-диазепам (25 Ки/ммоль) фирмы "Amersham" (Англия); нитроцеллюлозные фильтры "Милипор" с размером пор 0,3—0,4 мкм, ПЛО (РРО) или 2,5-дифенилоксазол, ПОПОП (РОРОР) или п-бис-2-(5-фенилоксазоил), толуол сцинтилляционный.

Взрослых крыс массой тела 150—500 г забивали отсечением головы. Так как связывание мусцимола с ГАМК_А-рецепторным комплексом сильно зависит от стресса животного, крыс перед отсечением головы около 5 мин держали в руках в перчатках и успокаивали. Голову отсекали ножницами, когда было видно, что крыса спокойна. Отдельно у самцов и самок брали кору, мозжечок и ствол мозга. Их отдельно размельчали ножницами в чашке Петри на льду и гомогенизировали в 10 объемах 0,32 М сахарозы в гомогенизаторе Поттера (стекло-тефлон). Гомогенат центрифугировали при 1000 g 10 мин. Супернатант центрифугировали при 20 000 g 30 мин. Полученный осадок (Р₂), представляющий грубую синаптосомально-митохондриальную фракцию, замораживали-оттаивали и трижды отмывали от эндогенной ГАМК ресуспензированием-цен- трифугированием в холодной дистиллированной воде. Операция отмывания является обязательной, так как в тканях мозга содержится довольно много эндогенной ГАМК (2—4 мкг на 1 г ткани), что при гомогенизации мозга в 10 объемах среды может составить концентрацию около 10^-4 М.

Эксперименты по связыванию проводили, как описано в работе О. Chude [3]. Радиоактивность измеряли на счетчике р-2".

Результаты

По данным литературы [4, 8] основные постсинаптические ГАМК_А-рецепторно-канальные комплексы имеют на себе, в разной комбинации, связывающие сайты для различных лигандов: ГАМК, бензодиазепинов, барбитуратов, пикротоксина и ряда других модуляторов.

Для ГАМК-связывающего сайта обычно используют меченый мусцимол — алкалоид из гриба мухомора, который с более высоким сродством, чем ГАМК, связывается с ГАМК_А-рецепторным комплексом и намного слабее связывается с другими типами ГАМК-рецепторов (ГАМК_В и ГАМК_С).

Кривая зависимости количества специфически связавшегося меченого ³Н-мусцимола от концентрации меченого ³Н-мусцимола с фракцией отмытых синаптосомальных мембран из мозга крыс имеет сложный характер, который отражает существование в мозгу нескольких связывающих сайтов для ГАМК [2]. Анализ таких кривых сложен, но для целей настоящей работы нам достаточно изучать связывание с самым высокосродственным сайтом для ГАМК, К_д (константа диссоциации) которого для мусцимола лежит в диапазоне 1—10 нМ. В последующих экспериментах плотность связывающих сайтов мы измеряли при концентрации меченого ³Н-мусцимола 10 нМ, при которой концентрация связывающих сайтов высокого сродства близка к максимальной.

В табл. 1 представлены результаты изучения плотности связывающих сайтов для мусцимола при гипотиреозе и гипертиреозе в различных областях мозга у самцов и самок крыс. Анализ данных показывает, что в коре и мозжечке интактных крыс имеется приблизительно одинаковая плотность ГАМКд-рецепторных комплексов, а в стволе мозга она в 2 раза ниже. Это в целом соответствует данным литературы [11]. Половых различий в плотности ГАМК_А-рецепторов в мозге крыс не выявлено. Как видно из табл. 1, при гипотиреозе во всех изученных областях мозга у самцов и самок плотность ГАМКд-рецепторов повышена на 25—30%, а при гипертиреозе, наоборот, понижена на 30—50%.

Составной частью ГАМК_д-рецепторных комплексов являются бензодиазепиновые рецепторы. В наших предварительных экспериментах было показано, что константы связывания ³Н-диазепама с препаратами синаптосомальных мембран из коры мозга крыс приблизительно равны: К_д ~ 4,6 нМ и В_Макс ~ 0,27 пмолей на 1 мг белка. Эти результаты согласуются с данными литературы [9]. В последующих экспериментах плотность связывающих сайтов мы измеряли при концентрации меченого ³Н-диазепама — 10 нМ, при которой концентрация связывающих сайтов близка к максимальной.

Таблица 1. Плотность ³Н-мусцимолсвязывающих сайтов в препаратах синаптосомальных мембран из различных областей мозга крыс

Примечание. Концентрацию связывающих сайтов измеряли при концентрации меченого мусцимола 10 нМ. Представлены средние значения из трех экспериментов с 4-кратной повторностью в каждом ± стандартное отклонение; р > 0,95.

Таблица 2. Плотность ³Н-диазепамсвязывающих сайтов в препаратах синап- тосомальных мембран из различных областей мозга крыс

Примечание. Концентрацию связывающих сайтов измеряли при концентрации меченого диазепама 10 нМ. Представлены средние значения из трех экспериментов с четырехкратной повторностью в каждом ± среднее отклонение; р > 0,95.

Табл. 2 представлены результаты изучения плотности связывающих сайтов для диазепама при гипотиреозе и гипертиреозе в различных областях мозга у самцов и самок крыс. Как видно из табл. 2, существенных различий в плотности диазепамсвя- зывающих сайтов у самок и самцов не выявлено. Как и в случае мусцимолсвязывающих сайтов, плотность бензодиазепинсвязывающих сайтов во всех изученных областях мозга при гипотиреозе повышена, а при гипертиреозе, наоборот, понижена. Так как большая часть бензодиазепиновых рецепторов находится в ГАМК_А-рецепторном комплексе, это соответствие указывает, что при гипотиреозе плотность ГАМК_А-рецепторов во всех областях мозга повышена, а при гипертиреозе, наоборот, понижена.

Обсуждение

В литературе имеются противоречивые данные о влиянии экспериментального гипотиреоза и гипертиреоза на количество различных связывающих сайтов в ГАМК_А-рецепторах [15]. В одних работах получены данные об уменьшении связывающих сайтов при гипотиреозе и увеличении при гипертиреозе [10]. В других доказаны прямо противоположные эффекты, т. е. увеличение при гипотиреозе и уменьшение при гипертиреозе [13]. В третьих не обнаружено никакого влияния гипотиреоза и гипертиреоза на плотность связывающих сайтов в ГАМКд-рецепторах [12, 14].

Возможно, что причина этих разногласий заключается в недостаточном отмывании препаратов мембран. В литературе имеются указания, что в экспериментах in vitro трийодтиронин аллостери- чески увеличивает максимальное связывание для меченых бензодиазепинов к их связывающим сайтам [5]. При недостаточном отмывании синаптических мембран в них может оставаться определенное количество эндогенного трийодтиронина. Следовательно, уменьшенное количество ГАМК_А-ре- цепторов под действием хронического введения крысам тиреоидных гормонов может в экспериментах по связыванию казаться увеличенным за счет аллостерического влияния трийодтиронина на ГАМКд-рецепторы.

Таким образом, наши эксперименты, с одной стороны, подтверждают известный факт, что одним из рецепторов для тиреоидных гормонов являются ГАМКд-рецепторные комплексы мозга, и с другой — подтверждают данные литературы о том, что при гипотиреозе плотность ГАМКд-рецепторных комплексов повышается, а при гипертиреозе, наоборот, понижается. Повышенное количество ГАМКд-рецепторных комплексов способствует преобладанию общего торможения, а пониженное способствует преобладанию общего возбуждения.

Вывод

При экспериментальном гипотиреозе у крыс плотность ГАМКд-рецепторных комплексов в си- наптосомах из мозга крыс повышена, а при гипертиреозе — понижена.