Электрокинетический потенциал лимфоцитов крови при аутоиммунной офтальмопатии у больных диффузным токсическим зобом

Офтальмопатия при диффузном токсическом зобе (ДТЗ) относится к числу хронических аутоиммунных заболеваний [8, 9]. Патогенез аутоиммунной офтальмопатии (АО) характеризуется выраженными изменениями популяционной и субпопуляционной гетерогенности и функциональной активности иммунокомпетентных клеток как в ретроорбитальных тканях, так и в циркуляции [4, 5, 7]. Последнее закономерно сопровождается появлением в крови лимфоцитов с измененным поверхностным фенотипом. Тестирование диффе- ренцировочных, а также мембранно-связанных рецепторов контактного взаимодействия (эти рецепторы составляют до 40% всех охарактеризованных к настоящему моменту поверхностных антигенов иммунокомпетентных клеток) позволяет осуществлять прогнозирование развития АО и разрабатывать оценочные критерии эффективности назначаемой терапии [6].

В настоящее время хорошо известно, что с изменением функциональной активности лимфоцитов, структуры их поверхностных антигенов меняется физическое состояние клеточных мембран и в первую очередь электрический заряд [1, 3]. Исследование электрокинетического потенциала популяций лимфоцитов с помощью непрерывного проточного распределительного клеточного электрофореза является чувствительным методом интегральной оценки изменений архитектоники мембран иммунокомпетентных клеток, связанной со сменой поверхностных рецепторов.

Нередко установление степени тяжести АО и оценка адекватности проводимой терапии на основании лишь клинических параметров бывают затруднены, особенно в ранние сроки лечения; требуется проведение дополнительных чувствительных лабораторных исследований.

Целью настоящей работы явилось исследование электрокинетического потенциала лимфоцитов крови в динамике АО у больных ДТЗ и изучение возможности использования его в качестве одного из критериев тяжести течения АО и оценки эффективности проводимой терапии.

Материалы и методы

Под наблюдением находилось 103 больных ДТЗ в сочетании с АО (80 женщин и 23 мужчины) в возрасте от 20 до 60 лет. ДТЗ диагностировали на основании анамнеза, клинических признаков, определения содержания в крови тироксина, трийодтиронина, тиреотропного гормона гипофиза наборами для радиоиммунологического анализа фирмы "BYK-Mallinkrodt", ультразвукового исследования щитовидной железы. Наличие АО устанавливали по совокупности анамнестических- данных, характерных для данного заболевания офтальмологических проявлений. Диагноз верифицировали при помощи компьютерной томографии орбит на СТ-МАХ-640 ("General Electric"). Оценку степени тяжести АО и динамики патологического процесса осуществляли при расчете орбитального индекса (ОИ) Крисса [10]. В зависимости от исходных показателей ОИ (в баллах) выделены 3 группы больных АО: 20 (19,4%) больных АО I степени, 60 (58,3%) больных АО II степени и 23 (22,3%) больных АО III степени. Все больные находились в состоянии медикаментозного эути-

Изменение выраженности глазных симптомов в процессе лечения АО

Примечание. * — р < 0,05 с ОИ до лечения, реоза на фоне антитиреоидной терапии. У всех пациентов было начато специальное лечение АО традиционными методами с целью оказания противовоспалительного и иммуносупрессивного действия. В зависимости от степени тяжести АО использовали нестероидные противовоспалительные препараты, глюкокортикоиды, глюкокортикоиды в сочетании с лучевой терапией орбит. Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц в возрасте от 20 до 60 лет.

У больных и лиц контрольной группы изучали электрофоретическую подвижность (ЭФП) лимфоцитов крови (у больных — до начала, через 14 и 28 дней специальной терапии АО).

Лимфоциты из крови людей выделяли общепринятым методом центрифугирования в градиенте плотности (Г. Фрик, 3. Прейснер, 1979 г.). Препаративную электрофоретическую сортировку лимфоцитов проводили с помощью непрерывного свободного распределительного электрофореза на аппарате "Elphor Vap V".

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных статистических программ, достоверность различия средних величин определяли по /-критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

В результате лечения АО отмечался постепенный регресс глазных симптомов по оценке ОИ через 14 и 28 дней от начала терапии (см. таблицу), при этом в первую очередь уменьшались такие субъективные проявления, как слезотечение, светобоязнь, ощущение песка в глазах, чувство распирания в орбитах. Значительно медленнее регрессировали диплопия, экзофтальм и периорбитальный отек.

Различие в величинах ОИ до лечения и через 14 дней не были статистически значимыми (р > 0,05) при всех степенях тяжести АО. Достоверное снижение ОИ было установлено через 28 дней после начала лечения во всех группах больных (р < 0,05).

Параллельно с оценкой клинических признаков определяли ЭФП лимфоцитов крови. Исследования ЭФП показали (см. рисунок, а), что у здоровых лиц (контрольная группа) профиль гистограммы распределения клеток по ЭФП был представлен четырьмя пиками, содержащими 22,56 ± 3,65,     24,21 ± 2,87,    34,92 ± 4,18 и

18,31 ± 2,05% клеток соответственно. У больных АО III степени ЭФП основной массы клеток была значительно ниже контрольной (р < 0,01). Выявлены 3 электрофоретически гетерогенные популяции лимфоцитов. Популяция с наименьшим электрокинетическим потенциалом тестирова-

ЭФП лимфоцитов крови больных АО до (а) и через 14 (б) и 28 (в) дней после назначения лечения.

1 — тяжелая форма; 2 — средняя тяжесть; 3 — легкая форма; 4 — контроль.

По осям ординат — процент выхода клеток; по осям абсцисс — номера фракций.

лась в 67—70-й фракции и содержала 58,27 ± 5,24% клеток, в то время как в норме в этих фракциях содержалось всего 2,98 ± 0,65% лимфоцитов. ЭФП лимфоцитов больных АО II степени была значительно выше, чем регистрируемая у больных АО III степени (р < 0,05). Максимальный выход клеток регистрировался в 58—64-й фракции и составлял 79,58 ± 4,12%. Профиль распределения лимфоцитов также отличался от зарегистрированного как в контрольной группе, так и у больных АО III степени. У больных АО II степени идентифицировали 2 основных пика с максимальным выходом клеток в 52-й и 61-й фракциях. У больных АО I степени отмечались еще более высокие значения ЭФП основного пула лимфоцитов. Так, во фракциях с высокой ЭФП (51—59-я) у больных АО I степени регистрировалось 65,68 ± 5,79% клеток, в то время как у больных АО III и II степени — 3,15 ± 0,62 и 25,60 ± 3,17% клеток соответственно. В группе здоровых лиц в данном интервале фракций определялось 33,15 ± 3,21% лимфоцитов.

Через 14 дней после назначения терапии ЭФП лимфоцитов крови больных АО III степени значительно увеличивалась (см. рисунок, б) по сравнению с исходными данными. Максимальный выход клеток отмечался в 56-й фракции, что было на 12 каналов больше, чем до лечения. У больных АО II степени также наблюдалось повышение подвижности лимфоцитов в электрическом поле, но несколько менее выраженное. Максимальный выход клеток отмечался в 57-й фракции (до лечения — в 61-й). У больных АО I степени диапазон распределения лимфоцитов по ЭФП значительно расширился также за счет появления высокоподвижных фракций. В этот срок исследования у больных АО I степени во фракциях с высокой ЭФП (51—59-я) регистрировалось 64,18 ± 4,11% клеток, в то время как у больных АО III и II степени — 90,48 ± 6,33 и 75,45 ± 3,82% клеток соответственно. Профили распределения лимфоцитов по ЭФП были характерны для каждой из групп обследуемых больных и статистически достоверно (р < 0,05) отличались как от контроля, так и от гистограмм, полученных до назначения терапии.

Через 28 дней с начала лечения распределение по ЭФП лимфоцитов больных АО практически укладывалось в диапазон фракций, характерный для здоровых лиц (53—71-я фракции) (см. рисунок, в\ Гистограммы распределения лимфоцитов так же, как и в контроле, состояли из 4 хорошо выраженных пиков. Однако количество клеток, составляющее эти пики, и каналы максимального выхода клеток в них достоверно отличались от значений, обнаруженных в контрольной группе. У больных АО I степени во фракциях с высокой ЭФП (51—59-я) регистрировалось 34,28 ± 6,17% клеток, у больных АО III и II степени — 35,34 ± 5,23 и 35,81 ± 2,11% клеток соответственно, что статистически значимо (/? > 0,05) не отличалось от средних значений нормы (33,15 ± 3,21%).

Обращает на себя внимание тот факт, что у больных без выраженного клинического улучшения (несмотря на проводимое в течение 28 дней лечение) в крови продолжало регистрироваться повышенное количество клеток с высоким элек- трокинетическим потенциалом: в 51—59-й фракции идентифицировалось 54,39 ± 4,27% клеток.

Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что компоненты клеточных мембран имеют гидрофильные ионизированные полярные группы, ориентирующиеся в сторону водной среды, и обладают поверхностным ионным зарядом, который играет важную роль во многих процессах, обеспечивающих жизнедеятельность клеток. Электрический заряд в значительной степени определяет физико-химические свойства поверхности клетки и в свою очередь зависит от биологического состояния клетки и ее окружения. Колебания зарядов лимфоцитов у разных, но здоровых индивидуумов очень незначительны [2, 3]. Последнее приобретает большое значение для дифференциации многих патологических состояний. При патологии заряд может существенно меняться как в результате изменения физико-химической структуры клеточной поверхности (в том числе изменения поверхностного фенотипа, обусловленного сменой дифференцировочных антигенов, рецепторов контактного взаимодействия), так и вследствие нарушения состава окружающей среды — появления в крови антител, патологических белков, продуктов распада клеток. ЭФП связана не только с поверхностными, но и с внутренними физико-химическими свойствами клеток и отдельных структур [1, 2]. Поэтому изучение величины электрического заряда клеток приобретает важное значение для мониторинга изменений гомеостаза, в том числе иммунологического [3]. Повышение ЭФП лимфоцитов коррелировало с

тяжестью течения АО (коэффициент обратной корреляции г = -0,87 ± 0,11; р < 0,05), т. е. чем тяжелее протекало заболевание, тем меньшую ЭФП имел основной пул лимфоцитов крови. Назначение специальной терапии АО приводило к достоверному повышению ЭФП лимфоцитов. Динамика возвращения электрокинетического потенциала лимфоцитов и профилей их распределения по ЭФП к контрольным значениям отражала эффективность      проводимой терапии

(г = 0,82 ± 0,17; р < 0,05). Обнаруженные нами изменения ЭФП лимфоцитов крови в динамике терапии офтальмопатии могут явиться интегральным показателем выраженности иммунобиологической перестройки и позволяет составить представление о доле лимфоцитов периферической крови, вовлекаемых в патологический процесс.

Таким образом, метод препаративного клеточного электрофореза в свободном потоке можно рекомендовать в качестве дополнительного высокоинформативного и чувствительного критерия изменения иммунологического гомеостаза в комплексе клинико-лабораторных методов оценки тяжести течения и эффективности терапии АО.

Выводы

1. У больных АО регистрируются значительные изменения в распределении лимфоцитов крови по ЭФП. Электрокинетический потенциал лимфоцитов находится в обратной корреляционной зависимости от тяжести заболевания.
2. Назначение специальной терапии АО приводит через 14 дней к повышению ЭФП лимфоцитов, а затем (через 28 дней) — к возвращению к значениям, регистрируемым у здоровых лиц.
3. Достоверные изменения ЭФП лимфоцитов крови предшествуют статистически значимой положительной динамике ОИ.