Семейство ксенобиотиков, стимулирующих секрецию гормона роста, и новая физиологическая система ее регуляции

Гормон роста (ГР), или соматотропин, представляющий собой регуляторный белок с мол. массой около 22 кД, секретируется центральной железой эндокринной системы — гипофизом. Являясь важнейшим регулятором процессов роста, он дает широкий спектр физиологических эффектов в организме, затрагивающих различные стороны белкового, жирового и углеводного обмена. В последнее время внимание исследователей привлекает возможная функция ГР как иммуномодулятора. Согласно классической схеме, контроль секреции ГР осуществляется гипоталамусом посредством двух его пептидных гормонов — сома- толиберина, или ГР-рилизинг-гормона (ГРРГ), который ее стимулирует, и соматостатина (СС), который ее подавляет. Молекула ГРРГ у человека и ряда животных построена из 44 аминокислотных остатков, однако N-концевой 29-членный фрагмент сохраняет полную физиологическую активность этого гормона. СС состоит из 14 аминокислотных остатков и имеет за счет дисульфидного мостика между 3-м и 14-м остатками полуцистина циклическую структуру. ГРРГ и СС, вырабатываясь нейросекреторными клетками гипоталамуса, достигают гипофиза через его портальную кровеносную систему и оказывают свое влияние на соматотрофы — высокодифференцированные клетки, имеющие специфические рецепторы к этим нейропептидам и продуцирующие ГР.

Одним из последних заметных событий в нейроэндокринологии и биохимии гормональной регуляции является открытие в организме животных и человека ранее не известной физиологической системы, регулирующей секрецию ГР гипофизом. Получены убедительные доказательства участия в контроле секреции ГР наряду с классическими гормонами гипоталамуса — ГРРГ и СС — еще одного регулятора и его специфического рецептора. Это открытие особенно примечательно из-за нетривиальное™ его истории и доказательств, лежащих в его основе. Целью настоящей статьи является анализ этих доказательств, полученных в результате изучения нового семейства ксенобиотиков, избирательно стимулирующих секрецию ГР.

История данного открытия началась еще в 1980 г., когда в США С. Bowers и соавт. [2, 3} синтезировали аналоги природного опиоидного пентапептида Met-энкефалина Tyr-DTrp-Gly-Phe- Met-NH₂ и Tyr-DPhe-Gly-Phe-Met-NH2, которые были лишены опиоидной активности, но симулировали секрецию ГР клетками гипофиза крыс in vitro. Несмотря на то что эти пептиды проявляли ГР-рилизинг-активность только при использовании в довольно высоких дозах (10—20 мкг/мл среды) и были неактивны in vivo, они представляли несомненный интерес, поскольку в то время химическая структура природного ГРРГ еще была неизвестна. Выделение, расшифровка структуры и химический синтез ГРРГ были впервые осуществлены лишь в 1982 г. Продолжение исследований по компьютерному моделированию, химическому синтезу, изучению биологической активности и структурно-функциональному анализу самых разных отдаленных аналогов энкефалина привело к получению гексапептида His-DTrp-Ala- Trp-DPhe-Lys-NJ^ ^с высокой ГР-рилизинг-активностью in vitro и in vivo [3]. Активность этого пептида, обозначенного как ГР-рилизинг-пептид-6 (ГРРП-6), в стимуляции секреции ГР была близка активности природного ГРРГ.

К настоящему времени различными группами исследователей синтезирован целый спектр родственных ГРРП, способных, подобно ГРРГ, усиливать секрецию ГР у экспериментальных животных и человека. Структуры наиболее активных и наиболее изученных ГРРП приведены на рис. 1. Их объединяют небольшие размеры (6—7 аминокислотных остатков) и наличие в качестве важных элементов D-стереоизомеров аминокислот или других неприродных аминокислотных остатков и ароматических колец в боковых цепях. ГРРП-1 по сравнению с ГРРП-6 имеет дополнительный остаток аланина на N-конце и неприродный 0-наф- тил-Э-аланин вместо триптофана. ГРРП-2 наиболее близок по структуре к ГРРП-1 и отличается от последнего лишь наличием в 1-й позиции D-стереоизомера аланина и отсутствием гистидина, имеющегося в ГРРП-1 во 2-й позиции. Единственным различием в структурах гексарелина, синтезированного группой ’’Европептиды", и ГРРП-6 является замена D-триптофана на его 2-метил- производное.

Исследования физиологических эффектов ГРРП на различных экспериментальных моделях in vivo и in vitro показали, что их действие на секрецию ГР носит достаточно избирательный характер, что они стимулируют освобождение ГР из клеток гипофиза не путем взаимодействия со специфическими рецепторами какого-либо из известных эндогенных стимуляторов секреции ГР — гипоталамического ГРРГ, опиоидных пептидов или полипептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза, и что внутриклеточные и нейроэндокринные механизмы действия ГРРП и природного ГРРГ могут различаться.

Доказательства различия рецепторов ГРРГ и ГРРП были получены в опытах in vitro на клетках гипофи-

Рис. 1. Химическая структура ГРРП. ^а ~ ГРРП-6; б — ГРРП-1; в — ГРРП-2; г — гексарелин. зов крыс [3]. Установлено, что DLys³-rPPn-6, являющийся конкурентным рецепторным антагонистом ГРРП-6, не способен подавлять физиологическое действие ГРРГ на гипофизарные клетки, а DArg², А1а⁸’⁹’¹⁵-ГРРГ(1—29)NH₂, являющийся конкурентным антагонистом ГРРГ, не подавляет эффект ГРРП-6. Различие рецепторов ГРРП-6 и ГРРГ подтверждалось отсутствием эффекта 'перекрестной десенситизации" для этих пептидов. Возможное существование самостоятельных рецепторов для ГРРП поставило вопрос о наличии эндогенного лиганда, подобного этим пептидам.

Имеющиеся сведения о биохимических событиях, вовлекающихся в физиологический эффект ГРРП, пока ограничены. Однако они свидетельствуют о том, что действие этих пептидов на сома- тотрофы опосредуется Са²⁺-зависимыми и по крайней мере частично цАМФ-зависимыми механизмами с участием протеинкиназы С. Следует заметить, что данные о возможности вовлечения цАМФ в механизмы действия различных ГРРП, полученных на разных экспериментальных моделях, носят противоречивый характер.

Установлено, что ГРРП имеют 2 точки приложения своего действия в организме — не только гипофиз, но и гипоталамус [3, 4]. Насыщаемое и обратимое специфическое связывание ГРРП-6 выявлено в мембранных фракциях как гипофиза, так и гипоталамуса. В опытах in vitro на ткани гипофизов крыс показано, что стимуляция секреции ГР под влиянием ГРРП-6 была существенно больше в присутствии в инкубационной системе гипоталамической ткани. Нейроэндокринный механизм действия ГРРП на уровне гипоталамуса остается неясным. Согласно гипотезе С. Bowers и соавт. [3], гипоталамический эффект ГРРП состоит, скорее всего, не в освобождении ГРРГ или подавлении освобождения СС, а в освобождении из клеток гипоталамуса некоего неизвестного фактора U (по терминологии С. Bowers), который воздействует на гипофиз, синергично с ГРРГ усиливая секрецию им ГР.

Синергизм в действии ГРРП и ГРРГ in vivo обнаруживается как у экспериментальных животных, так и у человека [3, 4, 10]. Например, сильный синергизм эффектов ГРРГ и ГРРП-1 выявлен при их совместном введении здоровым молодым людям [4].

В Эндокринологическом научном центре РАМН изучено действие одного из наиболее активных ГРРП — ГРРП-2 и комбинации этого пептида с ГРРГ(1—29)NH₂ — аналогом природного ГРРГ у детей с различными формами задержки роста [10]. У детей с идиопатической низкорослостью, когда функция соматотрофов сохранена, внутривенное введение ГРРП-2 сопровождалось значительным и быстрым повышением уровня иммунореактивного ГР в сыворотке крови с пиком реакции через 15—30 мин после введения. При этом, как установлено в нашей лаборатории, имела место хорошая корреляция содержания в крови иммунореактивного и биологически активного ГР [1]. Последний определялся по стимуляции пролиферации клеток Nb2 лимфомы. Низкорослые дети с дефицитом ГР гипофизарного происхождения проявляли очень слабую реакцию на введение как ГРРП-2, так и ГРРГ (1—29)NH₂. При совместном введении ГРРП-2 и ГРРГ(1—29)NH₂ детям с идиопатической низкорослостью выявлен весьма значительный синергизм их действия. Стимуляция секреции ГР под влиянием комбинации пептидов более чем в 2 раза превосходила сумму реакций на индивидуальное введение каждого из пептидов. Таким образом, эффекты ГРРП и природного ГРРГ явно независимы и комплементарны. Вместе с тем их совместное действие в организме носит пермиссивный характер. У человека реакция на введение ГРРП-6 может частично подавляться предварительным введением синтетического рецепторного антагониста природного ГРРГ. Это означает, что для максимальной стимуляции секреции ГР под влиянием ГРРП-6 необходима оккупация специфических рецепторов ГРРГ их эндогенным лигандом.

Весьма важным с точки зрения потенциального использования ГРРП в клинической практике для дифференциальной диагностики или лечения различных форм нарушений роста является способность пептидов этого семейства стимулировать секрецию ГР при интраназальном и даже пероральном введении [4]. Однако при введении per os для достижения значительного физиологического эффекта требуются существенно более высокие дозы этих пептидов.

С целью изучения прямого влияния ГРРП на соматотрофы человека и возможных взаимоотношений этих стимуляторов секреции ГР с классическими гипоталамическими регуляторами — ГРРГ и СС — на уровне гипофиза в нашей лаборатории исследованы эффекты ГРРП-2 (отдельно взятого, а также в комбинации с ГРРГ(1—29)NH₂ или с СС) в первичных монослойных культурах клеток аденом гипофиза, секретирующих ГР или ГР и пролактин [5, 6]. Установлено, что ГРРП-2 способен, подобно ГРРГ, оказывать непосредственное избирательное действие на клетки гипофиза человека, усиливая секрецию ими ГР, но не пролактина. Согласно результатам наших экспериментов с использованием комбинации разных доз ГРРП-2 и ГРРГ(1—29)NH₂, совместное прямое действие двух стимуляторов секреции ГР в зависимости от их доз может быть аддитивным либо носить характер слабого синергизма. Это подтверждает тот факт, что ГРРП-2 и ГРРГ реализуют свое действие в гипофизе человека через различные рецепторы и пострецепторные сигнальные пути. Поскольку синергизм ГРРП-2 и ГРРГ(1—29)NH₂ in vivo проявляется явно больше, чем in vitro, есть основание предположить, что в условиях целого организма он реализуется за счет действия ГРРП-2 в основном на уровне гипоталамуса.

Интересным фактом, установленным в наших исследованиях [5] на культурах клеток аденом гипофиза человека, продуцирующих ГР, является то, что СС блокирует ГР-рилизинг-эффект ГРРП-2, ГРРГ(1—29)NH₂ или их комбинации в условиях, при которых этот ингибитор не влияет или слабо влияет на базальную секрецию ГР. Диссоциация влияния СС на базальную и стимулированную секрецию ГР, проявляющаяся значительно большей чувствительностью к СС последней, может быть связана со сложностью механизма действия СС, который включает в себя разные внутриклеточные события, цАМФ-зависимые и цАМФ-не- зависимые, опосредуемые Са²⁺. Известно, что в клетках ГР-секретирующих аденом гипофиза человека СС может вызывать гиперполяризацию плазматической мембраны и таким образом инактивировать кальциевые каналы, что приводит к понижению внутриклеточной концентрации Са²⁺. Имеющиеся данные о важной роли ионных каналов и Са²⁺ в стимуляции секреции ГР позволяют предположить, что подавление в культурах клеток аденом гипофиза человека ГР-рилизинг-эф- фекта ГРРП-2 и ГРРГ в присутствии в среде СС может быть следствием вызываемой СС гиперполяризации мембраны соматотрофов и инактивации Са²⁺-каналов.

Неожиданным поворотом в развитии работ по изучению ГРРП явился синтез исследователями фирмы "Мерк" непептидных низкомолекулярных стимуляторов секреции ГР с физиологическими характеристиками, свойственными ГРРП [7, 9]. Вначале было получено 2 родственных производных бензолактама (L-692,429 и L-692,585), оказавшихся довольно сильными стимуляторами секреции ГР in vitro и in vivo, в том числе у человека, а затем был синтезирован другой весьма активный низкомолекулярный непептидный стимулятор секреции ГР МК-0677, существенно отличающийся от двух предыдущих по химической структуре и представляющий собой спироиндолин сульфонамид. Дизайн этих соединений осуществлялся на основе структуры ГРРП как матрицы. Химические структуры L-692,429 и МК-0677 приведены на рис. 2.

В опытах in vitro на культурах клеток гипофизов крыс установлено, что действие бензолактамов и МК-0677 на секрецию ГР опосредуется теми же механизмами, что и действие ГРРП [7, 9]. Например, соединение L-692,429, подобно ГРРП-6, не влияло на внутриклеточную концентрацию цАМФ, но усиливало накопление цАМФ в клетках под влиянием ГРРГ и действовало синергично с ГРРГ на освобождение из клеток ГР. Соединение L-692,429 и ГРРП-6, добавленные вместе в культуру клеток в максимально эффективных концентрациях, не вызывали дополнительного освобождения ГР в среду по сравнению с эффектом каждого из стимуляторов, добавленных по отдельности. Их максимальные эффекты были близки. Действие L-692,429, подобно действию ГРРП-6, подавлялось в присутствии СС. Концентрация МК-0677, необходимая для полумакси- мальной стимуляции секреции ГР (ED50), состав-

Рис. 2. Структура непептидных стимуляторов секреции ГР. а - l-692,429; б - МК-0677.

ляла в одних и тех же условиях инкубации для МК-0677, L-692,585, ГРРП-6 и L-692,429 соответственно 1,6, 3,0, 10,3 и 60 нМ.

Детальное изучение действия соединения МК0677 у собак [9] показало, что его пероральное введение вызывает значительное и длительное увеличение содержания ГР в циркулирующей крови, которое сопровождается повышением уровня в крови инсулиноподобного ростового фактора-1, продуцирующегося в печени под влиянием ГР и являющегося посредником его рост- стимулирующего эффекта. Отмечена хорошая всасываемость МК-0677 в кишечнике, иначе говоря, высокая биодоступность при пероральном введении (более 60% от введенной дозы), тогда как биодоступность ГРРП и бензолактамовых производных при пероральном введении составляла лишь 1—3%.

Самым веским доказательством реальности существования эндогенного регулятора секреции ГР, родственного по своим свойствам ГРРП и их непептидным функциональным аналогам, явилась идентификация в гипофизе и гипоталамусе уникального сопряженного с G-белком рецептора, избирательно связывающего указанные неприродные стимуляторы секреции ГР [8].

Исследования в этом направлении были представлены в нескольких докладах на 10-м Международном конгрессе по эндокринологии (San Francisco, 1996 г.) и на 79-м Годичном собрании общества эндокринологов США (Minneapolis, 1997 г.). С помощью меченного ³⁵S МК-0677 рецептор с высокой аффинностью (K_d = 200 пМ) и ограниченной связывающей способностью был обнаружен во фракции плазматических мембран гипофиза и гипоталамуса. Новый рецептор, вовлекающийся в стимуляцию секреции ГР, был клонирован. Нуклеотидная последовательность кДНК, полученной для рецептора из гипофизов человека, свиньи и крысы, свидетельствовала об отсутствии значительной гомологии этого рецептора с каким-либо другим известным рецептором, сопряженным с G-белком. Методом гибридизации in situ доказана активная экспрессия мРНК нового рецептора в гипофизе, аркуатном и вентромедиальном ядрах гипоталамуса и некоторых зонах гиппокампа мозга крыс, а также в нормальной ткани и в ткани аденом гипофиза человека.

Хорошо известно, что нормальная физиологическая секреция ГР, как и многих других гормонов, имеет эпизодический характер с закономерной частотой и амплитудой отдельных пульсов. Такая эпизодичность секреции ГР является важнейшим условием оптимальной реализации его регуляторных функций и поддержания метаболического гомеостаза в организме. Есть основания полагать, что вновь открытый рецептор гипофиза, гипоталамуса и, возможно, иных структур мозга и его эндогенный лиганд могут представлять собой физиологическую систему, обеспечивающую во взаимодействии с ГРРГ и СС и их рецепторами пульсовой режим секреции ГР гипофизом. Обнаружено, что в противоположность "эффекту де- сенситизации", наблюдаемому in vitro, продолжительное воздействие соединения L-692,429 in vivo приводит к инициации и амплификации пульсового освобождения ГР, подобного физиологическому. Такой же эффект получен у человека при пероральном введении соединения МК-0677.

Суммируя все изложенное, отметим следующее. Компьютерное моделирование, химический синтез, изучение биологической активности и структурно-функциональный анализ коротких пептидов, представлявших собой отдаленные аналоги энкефалинов, привели к получению целого семейства низкомолекулярных пептидных и непептидных ксенобиотиков, способных избирательно стимулировать секрецию ГР клетками гипофиза. В свою очередь детальное исследование этих неприродных стимуляторов секреции ГР, их физиологических эффектов и механизмов действия in vitro и in vivo, взаимоотношений с ГРРГ и СС — классическими природными регуляторами секреции ГР — послужило базой для открытия новой физиологической системы, контролирующей нормальную пульсовую секрецию этого гормона. Она включает в себя уникальный сопряженный с G-белком рецептор, который присутствует в гипофизе, гипоталамусе и, возможно, в других структурах мозга и был недавно клонирован, и эндогенный лиганд этого рецептора, который является, по-видимому, структурным и функциональным аналогом указанных выше ксенобиотиков пептидной или непептидной природы. Открытие новой системы, участвующей в регуляции секреции ГР, несомненно, имеет принципиально важное теоретическое и практическое значение, заставляя по-новому оценить механизмы контроля соматотрофной функции гипофиза и патогенеза ее нарушений, а также возможности диагностики и коррекции этих нарушений. Хотя молекулярную структуру нового эндогенного стимулятора секреции ГР еще предстоит установить, уже сейчас очевидно, что в данном случае мы имеем определенную историческую аналогию, повторение ситуации с открытием в недалеком прошлом морфиноподобных пептидных биорегуляторов — энкефалинов и эндорфинов и опиоидной физиологической системы в целом.