Модификация радиоиммунологического метода определения альдостерона

Как известно, одним из основных регуляторов водно-солевого обмена является альдостерон, синтезируемый клубочковой зоной коры надпочечников. Определение содержания этого гормона приобретает важное значение в клинике внутренних болезней, в эндокринологической практике, особенно при проведении дифференциальной диагностики артериальных гипертензий, заболевании почек и различных форм гиперальдостеронизма.

Кроме того, необходимость определения альдостерона возникает и в эксперименте при разработке и тестировании ряда фармакологических препаратов, изучении различных аспектов водно-солевого обмена и кислотно-щелочного равновесия организма.

Однако у нас в стране до настоящего времени отсутствовали надежные методы определения альдостерона, а закупка высокочувствительных радиоиммунологических наборов за рубежом для определения альдостерона требует значительных валютных ассигнований.

В настоящей работе описан простой высокоспецифичный метод определения альдостерона, доступность которого открывает широкие возможности как в клинических, так и экспериментальных исследованиях.

Материалы и методы

Использовали альдостерон (фирма “Sigma”. США), меченный ³Н-альдостерон (2840 ТБк/моль, Государственный институт прикладной химии МХП РФ), антисыворотку к альдостерону (Институт экспериментальной патологии и терапии). сцинтилляционную смесь (0.5 г 1.4-(ди-5-фенилокса- золилбензола) + 5 г 2,5-дифенилоксазола в 1 л толуола), фосфатную буферную систему (0.1 М. pH 7,4), содержащую 0.1% желатина. 0.1% азида натрия и 0.4% хлорида натрия.

’Н-альдостсрои с целью освобождения от продуктов радиолиза перед использованием для радиоиммунологичсского анализа подвергали хроматографической очистке на колонке с сефадексом LH-20 в системе растворителей толуол - метанол 85:15. Скорость счета рабочего раствора ³Н-альдостерона составляла 4000-5000 имп/мин/ 0,1 мл.

Синтез альдостерона-З-(О-карбоксиметилоксима), а также его конъюгацию с бычьим сывороточным альбумином осуществляли описанным методом [2] в отделе химии стероидных соединений Центрального института микробиологии и экспериментальной терапии АН Германии (Йена). Конъюгат альдостерона с БСА по данным спектрофотометрического анализа содержал 32 молекулы стероида на I молекулу белка.

В НИИ эксперимаитальной патологии и терапии (Сухуми) для получения антисыворотки кроликов породы шиншилла массой 2.5-3.0 кг иммунизировали конъюгатом альдостерона с БСА. На каждое животное брали по 2 мг антигена на 1 иммунизацию. Взвесь антигена в полном адъюванте Фрейнда вводили в область лимфоузлов передних и задних конечностей. Иммунизировали трехкратно с интервалом 1 мес. Через 2 нед после последней иммунизации брали кровь из ушной вены с последующим получением антисыворотки.

Специфичность антисывороток определяли по методу G. Abraham [1] с 32 родственными стероидами; сродство антител к соответствующим стероидам (константу ассоциации) - по графику Скетчарда.

Для оценки воспроизводимости результатов радиоиммуно- логического анализа был изготовлен пул плазмы крови, чтобы в каждом эксперименте, наряду с исследованием очередного биологического материала, в пуле плазмы проводить определение содержания соответствующего стероида и сравнивать с таковым, полученным ранее. Коэффициент вариации значений концентрации альдостерона в пуле плазмы в различных сериях определений не превышал 15%. а в пределах одного эксперимента в параллельных пробах пула плазмы был ниже 12%.

Для экстракции альдостерона 50-200 мкл исследуемой плазмы интенсивно встряхивали с 2 мл свежеперегнанного метиленхлорида на вихревом смесителе в течение 2 мин. Эффективность экстракции стероида из плазмы крови в указанных условиях составляла 85-87%.

Для контроля величины неспецифического фона (бланка), характеризующего качество воды, реактивов, чистоту лабораторной посуды, проводили экстракцию фосфатной буферной системы метиленхлоридом в том же соотношении, как и при экстракции исследуемой плазмы.

Отсутствие достоверных различий в величинах активности проб максимального связывания (В_о) и проб “бланка” исключало влияние факторов неспецифического фона на результаты радиоиммунологических определений.

Метиленхлоридный экстракт отделяли от экстрагированной плазмы замораживанием водной фазы при температуре от -30 до -40°С с последующим декантированием. Мегилен- хлорид упаривали в токе азота при 30°С и к сухому остатку добавляли по 300 мкл фосфатной буферной системы.

Диапазон концентрации альдостерона в калибровочной кривой составлял от 12.5 до 400 пг/0,1мл.

Растворы калибровочных проб. ³Н-альдостерона и антисыворотки готовили в фосфатной буферной системе. Затем раствор антисыворотки и ’Н-альдостерона предварительно смешивали в равных объемах и добавляли во все пробы в виде смеси по 200 мкл.

Далее содержимое пробирок интенсивно встряхивали на вихревом смесителе, инкубировали па водяной бане 30 мин при 37”С. после чего переносили в ледяную баню с температурой воды 2-4°С на 2ч.

Для разделения свободной и связанной с антисывороткой фракций стероидов в каждую пробу добавляли 0.5 мл 1% суспензии активированного угля в фосфатной буферной системе. После инкубации в течение 10 мин на ледяной бане и центрифугировании при 2000 g в течение 10 мин надосадочную жидкость сливали во флаконы для счета радиоактивности. содержащие 10 мл сцинтилляционной смеси. Содержимое флаконов инкубировали на водяной бане при 60°С в течение 5 мин. встряхивали 5 с. охлаждали и через 1,5 ч изМёфяли уровень радиоактивности.

Расчет содержания альдостеронов в пробах исследуемой плазмы проводили по графику зависимости относительного процента связывания проб калибровочной кривой от концентрации калибровочных проб в системе logit-log координат.

Результаты и их обсуждение

В результате иммунизации животных была получена антисыворотка с конечным титром 1:15000. Константа ассоциации, характеризующая сродство антител к альдостерону, составила 3,8 х Ю⁹ л/моль.

Величины перекрестных реакций антисыворотки к альдостерону приведены в табл. 1. Как видно, максимальные значения (0,7%) перекрестных реакций антисыворотки к альдостерону были зарегистрированы для дезоксикортикостерона и прогестерона. Однако учитывая невысокие концентрации указанных стероидов в крови

Таблица 1

Специфичность антисыворотки к альдостерону

50 /00 200 400 мкл плазмы

Рис. 1                                                                           Рис. 2

Рис. 1. Калибровочная кривая радиоиммунологического определения альдостерона (а) и кривая теста на параллелизм (б), построенные в системе logit-log координат.

у = 23.24.X-- 0.16. г= -0,931.

По оси ординат - отношение радиоактивной фракции, полученной в присутствии гормона (В), к активности фракции, связанной в отсутствие конкурента (Во): по оси абсцисс — возрастающие концентрации стандарта (пг) или плазмы крови (мкл).

Рис. 2. Зависимость определяемого количества альдостерона от количества гормона, добавленного в бесстероидную плазму. у = 13.04 х +36, г = 0.998.

По оси ординат - количество открытого альдостерона (в пг); по оси абсцисс - количество добавленного альдостерона (в пг).

человека и животных (сопоставимые с концентрацией альдостерона), приведенные величины перекрестных реакций не искажали результаты определений.

Калибровочная кривая для определения альдостерона и кривая теста на параллелизм (с использованием плазмы крови самок павианов гамадрилов) в системе logit-log координат приведены на рис. 1.

В диапазоне от 12,5 до 400 пг отмечался линейный характер калибровочной кривой. Коэффициент вариации процентов связывания параллельных проб каждой дозы калибровочной кривой колебался от 2,5 до 8,0%.

Линейность кривой теста на параллелизм, проведенного с использованием плазмы крови обезьян и путем сравнения с калибровочной кривой, демонстрирует независимость конечного результата концентрации альдостерона в тестируемой плазме от объема биологического материала, взятого на исследование.

При оценке открываемое™ для установления точности метода получена кривая зависимости определяемого количества альдостерона от добавленного в пробу (рис. 2). Эффективность открытия для всех добавленных доз составляла 100,5 ± 4,6%.

В табл. 2 приведена сравнительная характеристика описанного в настоящей статье метода и набора фирмы “Sorin” (Франция). По всем основным параметрам предложенный набор не уступает зарубежному аналогу, обеспечивая воспроизводимые значения концентрации альдостерона в крови человека и обезьян.

Изложенные результаты показали, что разработанный метод радиоиммунологического определения альдостерона обладает высокой чувствительностью и специфичностью, прост в выполнении, что обеспечивает широкие возможности его применения в эндокринологической клинике и при проведении экспериментов на приматах.

В последние 3 года метод используется в Эндокринологическом научном центре РАМН как в диагностической практике, так и для выполнения научно-исследовательских проектов.