Гликозаминогликаны и диабетическая нефропатия

Диабетическая нефропатия (ДН) занимает одно из ведущих мест в структуре летальности больных сахарным диабетом (СД) в России и за рубежом. Несмотря на интенсивное изучение, причины и механизмы развития этого осложнения оконча­тельно не ясны. Чаще всего диабетическое пораже­ние почек рассматривается как результат сложного взаимодействия обменных, гемодинамических, ге­нетических и иных механизмов. При этом ведущую роль большинство исследователей отводят гиперг­ликемии и запускаемым ею метаболическим рас­стройствам. К последним относят интенсифика­цию процессов неферментативного гликирования, активацию протеинкиназы С и полиолового шун­та, окислительный и карбонильный стресс, гипер­липидемию, дисбаланс факторов транскрипции и цитокинов, нарушения обмена коллагена. Роль этих факторов в формировании ДН нашла отраже­ние в ряде недавних обзоров (16, 22].

Еще одна метаболическая поломка, вероятно, не менее важная для развития ДН, затрагивает био­синтез и распад гликозаминогликанов (ГАГ). ГАГ — это углеводные биополимеры, состоящие из че­редующихся остатков аминосахаров и уроновых кислот (или галактозы). Существует несколько ти­пов ГАГ: гиалуроновая кислота, хондроитинсуль­фат, дерматансульфат, гепарин, гепарансульфат и кератансульфат. Различия между ними касаются структуры, клеточной и органной локализации и выполняемых функций. Комплексные соединения ГАГ с белками называют протеогликанами.

Основными видами сульфатированных ГАГ в почках являются гепарансульфат, хондроитинсуль­фат и дерматансульфат. Гепарансульфатсодержа- щие протеогликаны (перлеканы и др.) входят в со­став базальных мембран (БМ), хондроитинсуль- фат- и дерматансульфатсодержащие протеоглика­ны (версиканы, декорины и др.) локализованы в мезангии и интерстиции. Почечные протеоглика­ны выполняют 3 основные функции: 1) структур­ную: являются одними из основных структурных элементов БМ, мезангиального матрикса и интер- стиция; 2) барьерную: обеспечивают нормальную зарядоселективность и проницаемость почечного фильтра; 3) регуляторную: участвуют в межклеточ­ных взаимодействиях, регуляции роста и пролифе­рации разных типов клеток [39, 78]. Помимо тра­диционных продуцентов ГАГ, таких как фибробла­сты, синтез почечных ГАГ осуществляют эпители­альные и мезангиальные клетки [66, 69].

Данные, полученные в последние годы, показа­ли важную роль нарушений обмена ГАГ в форми­ровании ДН и позволили определить новые подхо­ды к лечению этого осложнения.

1. Роль нарушений обмена ГАГ в патогенезе ДН

Протеогликаны наряду с коллагеном IV типа и ламинином относят к главным компонентам БМ почечных клубочков. В начале 80-х годов прошлого века появились сообщения о том, что в гломеру­лярной БМ больных СД людей и лабораторных жи­вотных понижено содержание гепарансульфата [56, 59]. В дальнейших исследованиях эти данные получили неоднократное подтверждение [23, 71, 77]. Такая находка не могла не привлечь внимания, поскольку известно, что гепарансульфатсодержа- щие протеогликаны являются основным компо­нентом БМ клубочков, создающим ее отрицатель­ный заряд. Последний препятствует прохождению через почечный фильтр небольших негативно за­ряженных молекул, в том числе альбумина. Оказа­лось, что плотность анионных сайтов в клубочко­вой БМ при диабете действительно снижается при увеличении альбуминурии [77], и это снижение связано с редукцией гепарансульфатсодержащих протеогликанов [31]. Повышенную экскрецию с мочой альбуминов и других белков при СД стали объяснять снижением содержания гепарансульфа­та в гломерулярной БМ.

Вместе с тем оказалось, что количество гепаран­сульфата понижено не только в БМ клубочков, но и в БМ капилляров других органов: скелетных мышц [83], кожи [73], сетчатки глаза [6]. Отметим, что гепарансульфат сосудистой стенки выполняет несколько важных функций: участвует в создании отрицательного заряда эндотелия, обеспечивает антикоагулянтные свойства сосудистой стенки, ре­гулирует пролиферацию гладкомышечных клеток [39]. Хорошо известно, что развитие ДН часто со­провождается прогрессированием других микроан­гиопатий и атеросклероза. Снижение содержания гепарансульфата в различных участках микроцир- куляторного русла может объяснить генерализо­ванный характер микроангиопатий при СД.

Причины снижения содержания гепарансуль­фата в почках <и микроциркуляторном русле боль­ных СД остаются загадкой до настоящего времени. Существует несколько версий, объясняющих появ­ление подобной аномалии. Одна из них связывает снижение содержания гепарансульфата в БМ с уменьшением биосинтеза этого вещества. Предпо­лагают, что причиной может быть снижение актив­ности N-деацетилазы — фермента, участвующего в образование гепарансульфата [21]. Возможно, что снижение синтеза гепарансульфата при СД имеет генетическую природу. В гене гепарансульфатпро- теогликана описан полиморфный участок BamHI [41], который оказался ассоциированным с разви­тием ДН у больных СД типа 1 в европейской по­пуляции [35]. Исследования, проведенные в Япо­нии, не выявили ассоциации между полиморфиз­мом этого гена и развитием нефропатии при СД типа 2 [24]. Образование гепарансульфата при диа­бете может быть подвержено и метаболическим влияниям. Показано, что синтез этого вида ГАГ эпителиальными клетками клубочков тормозится в условиях гипергликемии [75] и под действием поздних продуктов гликации [7]. Гипергликемия снижает экспрессию агрина — основного белка ге- парансульфатсодержащих протеогликанов в подо­цитах [81].

Другая гипотеза состоит в том, что при СД син­тезируется аномальный ("дефектный") гепаран­сульфат, измененные физико-химические свойства которого затрудняют взаимодействие с другими молекулами и встраивание в состав БМ. О наличии качественных аномалий биосинтеза свидетельству­ют недавно описанные структурные изменения по­лисахаридных цепей гепарансульфата в почках больных диабетом [23]. Показано, что протеогли­каны, синтезируемые мезангиальными клетками в условиях гипергликемии, имеют меньший по срав­нению с нормой отрицательный заряд [61]. Веро­ятно, это связано с нарушением сульфатирования гепарансульфата, которое наблюдается при повы­шенном уровне глюкозы [75].

Наконец, возможно, что потеря гепарансульфа­та является следствием ускоренного распада про­теогликановых комплексов БМ. В пользу послед­него предположения свидетельствует обнаружен­ное нами [2] и другими исследователями [47, 60] высокое содержание гепарансульфата в моче боль­ных СД с начальной и выраженной нефропатией. Не исключено, что триггером гиперкатаболизма протеогликанов при диабете выступает повышен­ный уровень циркулирующих лизосомальных гли­козидаз. По нашим данным, повышенная экскре­ция ГАГ с мочой у больных с ДН взаимосвязана с высокой сывороточной активностью лизосомаль­ных ферментов [42].

Помимо снижения количества гепарансульфата, в составе БМ при диабете происходят и другие из­менения. В частности, у крыс с диабетом в гломе­рулярной БМ обнаруживаются хондроитинсуль- фатсодержашие протеогликаны, которые в норме присутствуют в ней лишь на этапе формирования почек [17]. Хондроитинсульфат при этом отклады­вается в субэндотелии клубочковых капилляров в зонах утолщения БМ и повреждения эндотелиаль­ной выстилки [48]. Аккумуляция хондроитинсуль­фата в участках утолщения гломерулярной БМ об­наружена и у больных с ДН [31]. Вероятно, эти на­рушения усугубляют изменения заряда и прони­цаемости клубочковой БМ и, следовательно, спо­собствуют развитию протеинурии.

Наряду с БМ значительные изменения при неф­ропатии претерпевает мезангий, где обнаружива­ются гиперпролиферация мезангиальных клеток и расширение матрикса. Изменениям мезангия при­дают важнейшую роль в формировании диабетиче­ского гломерулосклероза [53]. Как известно, для развития склеротических процессов характерна ак­кумуляция ГАГ, в частности хондроитин- и дерма­тансульфата. Именно эти виды ГАГ накапливаются в почках при СД [10]. Оказалось, что мезангиоциты крыс с диабетом продуцируют намного больше ГАГ, особенно дерматансульфата, чем клетки здо­ровых животных [33], а клубочковые клетки усили­вают синтез гиалуроновой кислоты [44]. По-види­мому, эти изменения не связаны непосредственно с гипергликемией: культивирование мезангиаль­ных клеток в среде с повышенной концентрацией глюкозы не приводит к усилению синтеза ГАГ [33, 61]. Вместе с тем имеются данные о том, что про­дукцию ГАГ мезангиальными клетками могут за­пускать цитокины и липопротеиды низкой плотно­сти [13, 18] Вероятно, нарушения баланса цитоки­нов и гиперлипидемия, часто наблюдаемые при СД, усугубляют дисфункцию мезангиоцитов и сти­мулируют гиперпродукцию компонентов мезанги­ального матрикса.

В отличие от других типов ГАГ содержание ге­парансульфата в мезангиальном матриксе при ДН понижено [45]. Синтез гепарансульфата клетками мезангия в условиях гипергликемии снижается [51]. При этом известно, что гепарансульфат спо­собен тормозить пролиферативную активность ме­зангиальных клеток (хондроитинсульфат дает про­тивоположный эффект) [32]. Следовательно, дефи­цит гепарансульфата в мезангии может способст­вовать гиперпролиферации мезангиоцитов и уско­ренному развитию гломерулосклероза [19].

Таким образом, накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о значительных качественных и количественных изменениях со­става ГАГ и протеогликанов в почках при СД. Эти изменения могут играть непосредственную роль в развитии ДН.

1. Исследование экскреции ГАГ с мочой в диагностике ДН

Показано, что нарушения метаболизма протеог­ликанов сопровождаются изменениями количества и состава ГАГ, экскретируемых с мочой. О меха­низмах экскреции известно немного. Предполага­ют, что в норме ГАГ попадают в мочу только путем фильтрации; секреции и реабсорбции этих веществ не установлено. Исследование уровня ГАГ в моче нашло применение в диагностике ряда заболева­ний, прежде всего лизосомальных болезней нако­пления (мукополисахаридозов), при которых име­ется генетический дефект ферментов лизосом, рас­щепляющих ГАГ [9]. Изменения гликозаминогли- канурии характерны также для системных заболе­ваний, связанных с нарушением метаболизма со­единительной ткани [20]. Считается, что сдвиги в экскреции ГАГ при патологии почек связаны с на­рушениями состава протеогликанов БМ и других почечных структур [10]. В связи с этим исследова­ние гликозаминогликанурии предложено в качест­ве теста для диагностики и мониторинга ряда забо­леваний почек. Изменение экскреции ГАГ обнару­жено при гломерулонефритах, амилоидозе почек, хроническом пиелонефрите [3, 67].

зо

Достаточно подробно изучена экскреция ГАГ при экспериментальном и клиническом СД. При этом в большинстве исследований выявлено повы­шение экскреции ГАГ [34, 40, 47, 62] и лишь в еди­ничных — ее снижение [10, 70]. Показано, что по­вышенная гликозаминогликанурии выявляется да­же при отсутствии явных признаков ДН [62], одна­ко наибольшей выраженности она достигает по ме­ре развития диабетической ретинопатии и ДН [34, 40]. У больных СД установлена взаимосвязь между выделением ГАГ и экскрецией альбумина с мочой (ЭАМ) [2, 47].

Ценность изучения гликозаминогликанурии по­вышается, когда определение суммарной концен­трации ГАГ дополняется исследованием их фрак­ционного состава. Для идентификации отдельных фракций ГАГ используют электрофоретические, хроматографические, иммунологические методы. В норме основным видом ГАГ мочи является хон­дроитинсульфат, в качестве минорной фракции может присутствовать гепарансульфат [2]. При па­тологии почек нормальное соотношение между фракциями меняется. При повреждениях почечной ткани, например, в первые часы после трансплан­тации почки, в моче увеличивается содержание ге­парансульфата [65]. Гиперэкскреция этого вида ГАГ закономерно обнаруживается при заболевани­ях почек, протекающих с протеинурией. Так, по­вышение соотношения гепарансульфат/хондрои- тинсульфат, коррелирующее с величиной альбуми­нурии, наблюдается при различных видах нефро­тического синдрома [38]. При СД также обнаруже­на взаимосвязь между ЭАМ и гиперэкскрецией ге­парансульфата. Наши исследования показали, что, начиная со стадии микроальбуминурии, развитие ДН у больных СД типов 1 и 2 сопровождается уве­личением доли гепарансульфата и реже дерматан­сульфата в составе экскретируемых фракций [2]. Об увеличении количества гепарансульфата в моче при ДН сообщают и другие авторы [47]. Имеются данные о том, что гиперэкскреция ГАГ может ука­зывать на скрытую дисфункцию почечного фильт­ра даже у больных с нормоальбуминурией. G. Gam- baro и соавт. обнаружили патологическое увеличе­ние ЭАМ в ходе провокационного теста с лизином у пациентов с СД, имевших нормальную базальную экскрецию альбумина, но повышенную экскрецию ГАГ [26]. Очевидно, необходимы дальнейшие про­спективные исследования для установления про­гностической значимости обнаружения повышен­ного выделения ГАГ при СД.

Таким образом, исследование экскреции ГАГ с мочой у больных СД может быть дополнительным неинвазивным тестом в ранней диагностике ДН. Выявление повышенного содержания ГАГ и осо­бенно доли гепарансульфата в составе экскрети­руемых фракций является достаточно чувствитель­ным, хотя и неспецифичным признаком диабети­ческого поражения почек.

• Препараты ГАГ в лечении ДН

Опыт применения ГАГ в клинической практике насчитывает уже несколько десятилетий. Прежде наиболее часто используемым препаратом был нефракционированный гепарин, в настоящее вре­мя предпочтение отдается его низкомолекулярным формам, а также комбинированным препаратам ГАГ (сулодексид, данапароид натрия).

Гепарины. Многообразие фармакологических эффектов гепарина, а также его структурное сход­ство с гепарансульфатом послужили основой для исследования эффективности тепаринотерапии при ДН. Установлено, что как нефракционирован­ный, так и низкомолекулярный гепарин (НМГ) уменьшает ЭАМ у пациентов с СД и микроальбу­минурией [49]. Имеются данные о том, что НМГ снижает ЭАМ и у больных с выраженной ДН [66]. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ГАГ могут тормозить развитие морфоло­гических изменений в почках при СД [27], хотя развитие гипертрофии почек гепаринотерапия не предупреждает [46, 55]. Показано, что гепарин пре­дупреждает характерное для диабета утолщение клубочковых БМ [29, 46, 55]. Этот эффект свойст­вен как НМГ, так и нефракционированному гепа­рину. Кроме того, гепарины могут снижать синтез коллагена IV типа гломерулярными клетками и его отложение в мезангии [12, 29], а также уменьшать экспансию мезангиального матрикса [46]. Эти дан­ные свидетельствуют о том, что гепарины тормозят формирование диабетического гломерулосклероза.

Нефропротективное действие гепаринов объяс­няют несколькими механизмами. Во-первых, гепа­рины способны уменьшать дисфункцию и гипер­пролиферацию мезангиальных клеток, свойствен­ную СД. НМГ повышает синтез гепарансульфата и уменьшает синтез хондроитинсульфата [И], а так­же тормозит образование коллагена IV типа мезан­гиальными клетками [12]. Показано, что НМГ пре­дотвращает вызываемую гипергликемией актива­цию гена трансформирующего фактора роста р в мезангиоцитах [83]. Последний является одним из ключевых медиаторов развития ДН: с гиперэкс­прессией трансформирующего фактора роста р связан повышенный синтез компонентов гломеру­лярного матрикса, таких как коллаген IV типа, фибронектин и протеогликаны (кроме гепаран- сульфатсодержащих) [82]. Во-вторых, гепарины повышают зарядоселективность клубочковой БМ. делая ее менее проницаемой для молекул белка. Доказано, что гепарин предотвращает потерю ани­онных сайтов в гломерулярной БМ, возникающую при СД [27, 52]. В-третьих, гепарины повышают

отрицательный заряд эндотелиальных клеток и предупреждают тем самым развитие микротромбо­зов во внутрипочечных сосудах. Возможно, это свойство связано со способностью гепаринов по­вышать синтез гепарансульфата в клетках эндоте­лия [39].

Недавние исследования обнаружили новые ме­ханизмы нефропротективного эффекта гепаринов. Оказалось, что гепарин может уменьшать апоптоз (запрограммированную гибель) различных типов клубочковых клеток [37]. Кроме того, обнаружена способность гепаринов уменьшать выраженность оксидативного стресса в клубочках [14].

Возможно также, что нефропротективное дей­ствие гепаринов при СД связано с их гиполипиде- мическим эффектом. Роль гиперлипидемии в про­грессировании ДН в последние годы четко уста­новлена. Показано, что модифицированные (окис­ленные и гликированные) липиды при СД накап­ливаются в сосудистой стенке и мезангии, что при­водит к ускоренному формированию атеро- и гло­мерулосклероза. Гиполипидемическая активность гепаринов у больных СД изучена недостаточно. В одном из недавних исследований показано, что 6- месячная терапия фраксипарином у находящихся на гемодиализе больных СД типа 2 с гиперлипиде­мией приводит к снижению уровня триглицеридов (в среднем на 34%) и липопротеидов низкой плот­ности (в среднем на 26%) [80]. Другие авторы не подтверждают гиполипидемический эффект гепа­ринов при СД [50].

Гепарины не оказывают неблагоприятного влияния на углеводный обмен, а также на гемоди­намику в почках [66]. Однако имеются данные о том, что частота геморрагических осложнений на фоне лечения гепаринами выше у больных с почеч­ной недостаточностью [30]. Кроме того, следует помнить, что гепарин снижает синтез альдостерона и может вызвать гиперкалиемию у пациентов с вы­раженной ДН [54]. У больных СД, находящихся на гемодиализе и получающих гепарин, возможно развитие выраженных кожных некрозов [43].

Несмотря на то что не существует четких дока­зательств того, что терапия НМГ при ДН более эф­фективна, чем лечение обычным (нефракциониро- ванным) гепарином, использование НМГ пред­ставляется более предпочтительным из соображе­ний безопасности и удобства применения. По обобщенным данным 3. С. Баркагана и соавт. [1], НМГ по сравнению с обычным гепарином реже вызывает серьезные геморрагические осложнения и гепариновую тромботическую тромбоцитопе­нию, практически не оказывает активирующего влияния на тромбоциты, малые дозы НМГ оказы­вают более выраженное блокирующее действие на пусковые механизмы свертывания крови. НМГ вы­годно отличает простота подкожного введения (1— 2 раза в сутки), а также возможность применения в амбулаторных и домашних условиях. В большин­стве случаев НМГ в качестве профилактического антитромботического средства применяют в дозах, не превышающих 4000—6000 анти-Ха-ЕД в сутки. Доза НМГ, обеспечивающая антипротеинуриче- ский эффект при СД, составляет 4000 анти-Ха-ЕД в сутки [49, 66]. Общепризнано, что при использо­вании таких доз проводить лабораторный монито­ринг гипокоагуляционного действия НМГ не тре­буется.

Из препаратов НМГ в нашей стране нашли при­менение эноксапарин (клексан), далтепарин (фрагмин), надропарин (фраксипарин).

Сулодексид. Впервые на фармацевтическом рынке сулодексид появился в 1974 г. и с тех пор на­шел широкое применение как антитромботиче- ский препарат. Сулодексид представляет собой ГАГ высокой степени очистки, на 80% состоящий из высокоподвижной гепариноподобной фракции и на 20% из дерматансульфата. Гепариноподобная фракция сулодексида по сравнению с нефракцио- нированным гепарином имеет средненизкую моле­кулярную массу, меньшую степень сульфатирова­ния и проявляет пониженную антикоагуляцион­ную активность. Дерматансульфат обеспечивает антитромботическую активность препарата. При­сутствие в составе гепариноподобной фракции и дерматансульфата дает синергический эффект, обеспечивающий высокий антитромботический потенциал при меньшем по сравнению с гепари­ном риске кровотечения [8, 36].

Изначально в диабетологии сулодексид (Vessel Due F) нашел применение как средство для лече­ния сосудистых поражений нижних конечностей и лишь затем привлекли внимание его нефропротек- тивные свойства. Эксперименты показали, что вве­дение сулодексида животным с СД предупреждает утолщение клубочковой БМ, потерю ею отрица­тельного заряда, рост альбуминурии. При этом влияния на метаболический контроль и скорость клубочковой фильтрации препарат не оказывает [27]. Многочисленные клинические исследования подтвердили, что сулодексид уменьшает ЭАМ у больных СД типов 1 и 2 с микро- и макроальбуми­нурией [4, 5, 63, 64, 76].

Механизмы антипротеинурического действия препарата аналогичны таковым гепарина. Помимо снижения альбуминурии, сулодексид дает гиполи­пидемический эффект. Результаты исследований у больных СД с поражениями периферических арте­рий показали, что сулодексид достоверно снижает уровень триглицеридов и повышает уровень холе­стерина липопротеидов высокой плотности, а так­же снижает содержание фибриногена и вязкость крови [25]. В экспериментальных условиях проде­монстрированы антиоксидантные свойства суло­дексида [57]. Показанием к назначению препарата при СД, помимо нефропатии, могут быть макросо- судистые осложнения: макроангиопатия нижних конечностей [25], ишемическая болезнь сердца и перенесенный инфаркт миокарда [15].

Важным преимуществом сулодексида по срав­нению с гепаринами является его эффективность не только при парентеральном введении, но и при приеме внутрь. Общепринятой схемы лечения не существует. Обычно рекомендуется назначать пре­парат внутримышечно в дозе 600—1200 ЛЕ в тече­ние 15—20 дней, а затем перорально в дозе 1000 ЛЕ/сут на протяжении 1—6 мес. В исследованиях сулодексида у больных с ДН дозы варьировали от 600 ЛЕ/сут [63, 64] до 1500 ЛЕ/сут [5], а длитель­ность применения — от 3 нед [63] до 6 мес [76].

яя

Имеются данные о возможности более длительного применения сулодексида [15].

В последние годы в мире накапливается опыт использования и других препаратов ГАГ. Одним из комбинированных препаратов является дана- пароид натрия (Orgaran), представляющий собой смесь ГАГ, содержащую 84% гепарансульфата, 12% дерматансульфата и 4% хондроитинсульфата. Показано, что данный препарат оказывает отчет­ливое антипротеинурическое влияние у больных СД типа 1 [72].

В заключение можно отметить, что ГАГ являют­ся новым и весьма перспективным классом препа­ратов для лечения больных с ДН. Однако, несмотря на многочисленные благоприятные эффекты, мно­гие вопросы, связанные с клиническим примене­нием ГАГ при СД, остаются нерешенными. Преж­де всего неясно, способна ли терапия препаратами ГАГ приостановить или хотя бы замедлить темпы прогрессирования нефропатии у больных СД. От­вет на этот вопрос может быть получен лишь в кли­нических исследованиях с достаточно длительным сроком наблюдения, в которых бы оценивали не только суррогатные точки (ЭАМ, протеинурию и т. д.), но и клинические исходы (частоту развития почечной недостаточности, смертность от уремии и др.). Окончательно не решен вопрос о длитель­ности и схемах лечения. В проведенных исследова­ниях длительность терапии не превышала 6 мес, что не позволяет оценить долгосрочные эффекты лечения. Наконец, не определены возможности и преимущества сочетания ГАГ с другими нефропро- тективными препаратами (ингибиторами АПФ, блокаторами рецепторов ангиотензина II, дезагре- гантами). Последнее представляется весьма инте­ресным в свете недавно полученных данных о том, что ангиотензин II ингибирует продукцию гепа­рансульфата мезангиальными клетками [74], а эна­лаприл нормализует синтез гепарансульфата в клу­бочках и предотвращает потерю гепарансульфата с мочой [58]. Решение перечисленных вопросов — предмет будущих исследований.