Участие тирозиновых протеинкиназ, протеинфосфатаз и докинг белков в проведении сигнала от рецептора инсулина

Процессы роста, дифференцировки, выжива ния, метаболизма и смерти клеток регулируются фосфорилированием и дефосфорилированием сиг нальных белков по специфическим тирозиновым остаткам [86]. Многие рецепторы факторов роста обладают тирозинпротеинкиназной активностью. При взаимодействии ростовых факторов с их ре цепторами происходит аутофосфорилирование ре цепторных тирозиновых протеинкиназ, выражаю щееся в их каталитической активации, что приво дит к фосфорилированию многих внутриклеточ ных субстратов этих рецепторов. Считается, что терминация внутриклеточной сигнализации про исходит при участии тирозиновых протеинфосфа- таз (ТПФ). В то же время последние данные сви детельствуют о том, что ТПФ могут не только по давлять сигнализацию, но и усиливать ее [76]. Инсулин оказывает множественное воздействие на клетку. Он регулирует метаболизм глюкозы в организме [44], а также, являясь фактором роста, стимулирует пролиферацию и дифференцировку клеток [71]. Связывание инсулина со своим рецеп тором (IR) на поверхности клеток активирует про- теинкиназный домен рецептора, что приводит к ау тофосфорилированию р-субъединицы рецептора с последующим связыванием и фосфорилированием внутриклеточных мишеней инсулинового рецепто ра - субстрата-1 инсулинового рецептора (IRS-1). Этот докинг-белок в фосфорилированном по тиро зиновым остаткам состоянии связывает множество сигнальных белков, содержащих SI-12-домены, об разуя мультисубъединичные сигнальные комплексы, опосредующие передачу сигнала внутри клет ки. Регуляция инсулиновой сигнализации требует участия ТПФ. К настоящему времени клонирова ны 2 ТПФ, содержащие 5Н2-домены (SH.P-1 и SHP-2), позволяющие этим фосфатазам связывать ся с фосфорилированным инсулиновым рецепто ром и его субстратами - докинг-белками. Выясне ние роли этих фосфатаз в инсулиновой сигнализа ции может помочь понять механизмы инсулиновой сигнализации, которая до сих пор остается одним из белых пятен эндокринологии и физиологии клетки. Роль фосфорилирования тирозиновых остатков в клеточной сигнализации Проведение внешнего сигнала в клетку является одним из основных условий запуска и регуляции клеточного роста, дифференцировки и метаболиз ма, развития нервной системы, взаимодействия клеток иммунной системы и трансформации кле ток [31]. Тирозиновое фосфорилирование играет ключевую роль во многих из этих процессов, непо средственно регулируя активность рецепторов или ферментов на ранних этапах сигнализации и при сборке мультисубъединичных сигнальных ком плексов вокруг активированных рецепторов или их клеточных субстратов [64]. Запуск сигнальных кас кадов, контролируемый рецепторами факторов роста, приводит к фосфорилированию тирозино вых остатков клеточных белков, которое катализи руется тирозиновыми протеинкиназами, активиро ванными в результате димеризации специфичных рецепторов после связывания ими внеклеточного лиганда [74]. Как правило, участки тирозинового аутофосфорилирования в активированных рецеп торах связывают 8Н2-белки, которые имеют гомо логию с Src-киназой. В других случаях аутофосфо рилирование по тирозиновым остаткам повышает каталитическую активность рецепторных тирози новых протеинкиназ, которые опосредуют тирози новое фосфорилирование цитозольных субстратов, так называемых докинг-белков. Последние в свою очередь связывают 8Н2-белки для образования мультисубъединичных сигнальных комплексов [92]. Сигнализация развивается также с участием посредников, несущих другие домены, которые опосредуют белок-белковое или белок-липидное взаимодействие (РТВ-, SH3- и PH-домены) (см. рисунок). Идентификация субстратов, фосфорилируемых инсулиновым рецептором Инсулин стимулирует тирозиновое фосфорили рование белка с относительной мол. массой около 180 кД (р!80) во всех тканях и клетках, чувстви тельных к инсулину. Считается, что инсулиновая сигнализация опосредуется тирозиновым фосфо рилированием внутриклеточных докинг-белков [911. С помощью иммобилизованных антител к фосфотирозину было выделено достаточное коли чество белка ppi80 для определения частичной аминокислотной последовательности, подбора вы рожденных праймеров и клонирования кДНК бел ка, названного 1RS-1 [72, 80]. 1RS-1 кодируется од ним геном на хромосоме 2q36-37 человека (или хромосоме 1 мыши) и имеет расчетную относительную мол. массу 132 кД [3, 78]. Существование белка, похожего на IRS-1, было выявлено в клетках гепатомы, в которых специфи ческие антитела к 1RS-1 относительно слабо свя зывались с р 180. Этот нереактивный белок был на зван pl80HMW, так как он имел несколько меньшую электрофоретическую подвижность, чем р180 [53]. Последующие исследования выявили белок с по добной относительной молекулярной массой в миелоидных клетках (субстрат рецептора IL-4, на званный 4PS) и в гепатоцитах, а также у мышей с разрушенным геном IRS-1 [79, 84]. Очистка и мо лекулярное клонирование гена, кодирующего 4PS из клеток FDC-P2, выявили белок, структурно по хожий на IRS-1 и иммунологически идентичный pl80HMW. Новый белок был назван IRS-2 [79]. Ген, кодирующий IRS-2, расположен на коротком пле че мышиной хромосомы 8 вблизи гена, кодирую щего рецептор инсулина [81]. Сравнение амино кислотных последовательностей IRS-1 и IRS-2 вы явило несколько основных особенностей, включая консервативный N-концевой домен, гомологич ный плекстрину (PH-домен), а также домен, свя зывающий фосфотирозин (РТВ-домен), который специфично взаимодействует с NPXY-последова- тельностью. Тем не менее общая гомология этих белков составляет только 35%, так как аминокис лотные последовательности С-концевых участков у них разные. Участки, фосфорилирующиеся по ти розиновым остаткам, либо гомологичны у IRS-2 и IRS-1, либо идентичны. TRS-1 может фосфорилироваться по более чем 20 тирозиновым остаткам и связывается с несколь кими SI-12-белками, включая р85, Grb-2, SHP-2, nek, crk, fyn и SHP-I [9, 40, 47, 56, 75, 80]. Резуль таты сравнительного анализа связывания IRS-1 и 1RS-2 с различными SI-12-белками свидетельствуют о том, что существуют 8Н2-белки, способные свя зываться как с IRS-1, так и с IRS-2, но некоторые Sl-12-белки могут связываться либо только с IRS-1, либо только с IRS-2 [81]. Интересно, что имморта- лизованные фибробласты, у которых отсутствует IRS-1 и гиперэкспрессирован IRS-2, имеют нару шения в инсулиновой сигнализации. Таким обра зом, эти 2 докинг-белка функционально не иден тичны и не могут выполнять функции друг друга [11]. Есть 3 члена этого семейства, гомологичных 1RS-1. Это IRS-2, Gab-1 и p60doc. Они образуют подсемейство 1 RS-белков [30, 81, 93] и имеют об щую функциональную структуру: 1) N-концевой PH- и (или) РТВ-домены, которые опосредуют межбелковое или белок-липидное взаимодействие; 2) тирозиновые остатки, которые при фосфорили ровании образуют места связывания для 5Н2-до- менов других белков; 3) последовательности, бога тые пролиновыми остатками, с которыми связыва ются белки, содержащие SH3- и WW-домены: 4) последовательности, богатые сериновыми и трео ниновыми остатками, которые могут регулировать общую функцию белков через взаимодействие с другими внутриклеточными белками. Другие под семейства докинг-белков включают в себя белки She [65], pl30cas и sin, которые так же, как и IRS- белки, состоят из доменов, опосредующих белок- белковое взаимодействие, а также из многочислен ных участков тирозинового фосфорилирования. IRS-белки координируют разветвленную и гибкую сигнальную систему Что дает участие докинг-белков внутриклеточ ной сигнализации? Во-первых, IRS-белки создают предпосылку к усилению внутриклеточного сигна ла за счет изменения стехиометрии рецепторный комплекс/докинг-белок. Количество SI-12-белков, имеющих возможность связаться с фосфорилиро ванным тирозиновым остатком, в присутствии до кинг-белков будет существенно большим. Напри мер, активированный рецептор PDGF образует сигнальный комплекс из 8Н2-белков, взаимодей ствующих с фосфотирозиновыми остатками рецеп тора, и интенсивность этого сигнала ограничена количеством молекул рецептора, связавших ли ганд. Напротив, стимуляция инсулинового рецеп тора, вызывающая фосфорилирование IRS-1 по тирозиновым остаткам, приводит к активации большого числа докинг-белков, на каждом из ко торых могут связываться 8Н2-белки и образовы вать многочисленные мультиферментные ком плексы. Во-вторых, IRS-белки диссоциируют от трансмембранного рецепторного комплекса и тем самым препятствуют внутриклеточному распаду комплекса рецептора со связанными с ним белка ми сигнального комплекса. Обычно после связы вания лиганда рецепторы интернализуются. Как правило, активированный рецептор мигрирует в клатриновые везикулы, которые образуют эндосо мы и затем либо возвращают рецептор на поверх ность плазматической мембраны, либо направляют его в лизосомы для последующей деградации [7]. Сигнальные молекулы, ассоциированные с рецеп тором, также могут следовать в лизосомы. В случае 1 RS-белков их взаимодействие с рецепторным комплексом кратковременное, поэтому сигналь ный комплекс, образованный на докинг-белке (в отличие от сигнального комплекса, образованного на рецепторе), не подвергается протеолизу, а миг рирует в специальные внутриклеточные органеллы или другие компартменты клетки. "Челночное" по ведение докинг-белков скорее всего обусловливает тканеспецифичность эффектов инсулина: трансло кацию GLUT-4 на клеточную мембрану в адипо цитах, транслокацию активированной Р13-киназы в малые пузырьковые везикулы в фибробластах [39] и образование нейритов в дифференцирующихся нейронах. Способность одной молекулы рецептора акти вировать несколько молекул IRS-1 расширяет спектр регулируемых сигнальных путей. Во время стимуляции клеток инсулином белки IRS-1, IRS-2, Gab-1 и p60doc являются потенциальными субстра тами для активированного рецептора. Каждый из них обладает общими и уникальными последова тельностями, окружающих фосфотирозины. Более того, существование уникальных сайтов фосфори лирования на различных докинг-белках расширяет возможности для более тонкого регулирования многочисленных клеточных ответов. Так, IRS-2 опосредует сигнализацию от рецептора IL-4, ответ ственную за клеточный рост, тогда как специфич ная экспрессия генов в основном регулируется не посредственным взаимодействием между белком STAT6 и рецептором IL-4. Поскольку на клетку в организме действует сразу множество лигандов, то одновременное использование докинг-белков не сколькими рецепторными комплексами интегри рует различные сигналы в координированный кле точный ответ. Помимо рецепторов инсулина и ин сулиноподобного ростового фактора IGF-1, IRS- белки могут фосфорилироваться по тирозиновым остаткам рецепторами гормона роста и пролактина |4, 10, 66, 85], интерлейкинов IL-2, IL-4, IL-9, IL- 13 и IL-15 [9, 13, 33], интерферонов INF-ct/p и INF-y [66, 85], членов IL-6 семейства [4] и рецеп тором ангиотензина [88]. Подобным образом IRS- подобный белок Gab-1 служит субстратом для ре цепторов инсулина, фактора роста гепатоцитов (с- Met) и EGF. P61dac служит мишенью для протоон когенов v-Abl, v-Src, v-Fps, v-Fnis и рецепторов ин сулина, IGF-1 EGF, PDGF, CSF-1 и VEGF [94]. Следовательно, докинг-белки создают общий класс посредников для интеграции различных сиг налов от активированных тирозиновых протеинки наз, вовлеченных в контроль метаболизма и кле точного роста. Сигнальные белки, взаимодействующие с IRS-1 IRS-белки обеспечивают проведение сигнала через прямое связывание с 5Н2-доменами различ ных сигнальных молекул. Найдено несколько сиг нальных молекул и адаптеров, связывающихся с 1RS-1: Р13-киназа, SHP-2, Fyn, Grb2, Nek и Crk [9, 40, 47, 56, 75, 80]. IRS-1 также взаимодействует с большим Т-антигеном SV40, белками 14-3-3 и av|33 независимо от тирозинового фосфорилирования [14, 23, 89]. Белок IRS-I сопрягает рецепторные протеинки- назы с сигнальными молекулами, находящимися "ниже" на пути проведения сигнала. IRS-1 принад лежит к семейству докинг-белков, которые пред ставляют собой белки-посредники между рецеп торными комплексами и белками, содержащими 8Н2-домены. Р13-киназа - наиболее изученный фермент из тех, которые активируются IRS-1. Он играет важную роль в регуляции широкого спектра биологических ответов клетки на различные гор моны, факторы роста и цитокины, запуская мито- генез [87, 95], участвуя в дифференцировке [37], хе мотаксисе клеток [43, 59], изменениях цитоскелета (membrane ruffling) [90] и инсулинзависимой акти вации метаболизма глюкозы [60]. Р13-киназа пред ставляет собой димер, состоящий из каталитиче ской и регуляторной субъединиц. Каталитическая субъединица с мол. массой 110 кД (рПОа и рНОр) при определенных условиях связывается с регуля торной субъединицей, которая имеет мол. массу 85 кД (р85а и р85|3), и тем самым активируется. Во время поиска других белков, связывающихся с 1RS-1 и содержащих БН2-домены, была клониро вана регуляторная субъединица р55пк, экспресси рующаяся в мозгу и семенниках. С-конец р55Р1К сходен с тем же участком р85, включая богатую пролином последовательность, а также 2 БН2-до- мена и консенсусную последовательность для свя зывания рНО [19], а 8НЗ-домен и последователь ность, гомологичная Вег, присутствующие в р85, в р55Р|К заменены на другую последовательность из 30 аминокислотных остатков [69]. Как и р85, р55Р|К связывается с фосфорилированным по тирозино вым остаткам IRS-1, и это взаимодействие активи рует Р13-киназу [69]. Две другие регуляторные субъ единицы (р85а и р85р) кодируются тем же геном, что и р85, и являются продуктами его альтернатив ного сплайсинга [2, 28, 32]. Р13-киназа играет важнейшую роль в инсулин зависимых метаболических процессах, таких как транспорт глюкозы, синтез гликогена, а также син тез белка. Связывание 5Н2-доменов регуляторной субъединицы Р13-киназы с фосфорилированными последовательностями YMXM в IRS-1 активирует каталитическую субъединицу киназы, и эта акти вация максимальна при связывании обоих 8Н2-до- менов [6]. Одновременное связывание может про исходить на одной и той же молекуле белка [70]. Поскольку IRS-1 содержит 9 YMXM-последова тельностей, он представляет собой идеальный до кинг-белок для активации Р13-киназы. Этот меха низм активации инсулином Р13-киназы был проде монстрирован в клетках 32D, в которых отсутству ют эндогенные IRS-1 и IRS-2. С использованием ингибиторного анализа выявлены следующие фер менты, которые могут передавать сигнал от Р13-ки- назы: p70S6K, РКВ, РКС^ и другие киназы [20, 26, 57]. Регуляция РКВ (Protein Kinase В) осуществля ется путем связывания с ее PH-доменом и фосфо рилирования специфических сериновых и треони новых остатков [1]. РКВ и РКСЕ, вовлечены в раз личные биологические эффекты, в том числе в транслокацию GLUT4 в плазматическую мембра ну, синтез белков, ответственных за рост клетки, синтез гликогена [1, 8, 15, 29]. Тирозиновые протеипфосфатазы SHP-1 и SHP-2 Нерецепторные ТПФ, содержащие 8Н2-доме- ны, были идентифицированы в различных видах животных. В высших организмах обнаружены 2 ТПФ, содержащие тандем из двух функционально активных SH2 доменов - SHР-1 и SHP-2. У обеих фосфатаз специфичность по отношению к мише ням, содержащим фосфотирозин, различается у С- приближенного и N-концевого 8Н2-доменов. SHP-1 экспрессируется преимущественно в клет ках гематопоэтической системы и в мозге [67], в несколько меньших количествах этот белок был обнаружен в клетках других типов [77]. Известна природная мутация в гене, кодирующем SHP-1 мыши, приводящая к появлению фенотипа moth- eaten (me/me) мышей. Эти мыши послужили моде лью для изучения многих физиологических эффек тов SHP-1. Фосфатаза млекопитающих SFIP-2 экс прессируется во всех типах тканей [25]. Наличие у данных ТПФ двух сцепленных 8Н2-доменов по зволяет предположить, что эти ТПФ могут взаимо действовать с известными сигнальными каскада ми, запускаемыми тирозиновыми протеинкиназа- ми. Последние исследования, сочетающие в себе биохимические и генетические подходы, подтвер ждают высказанное выше предположение. Были обнаружены пути сигнализации, находящиеся под контролем этих двух ТПФ, а также потенциальные мишени действия как каталитического домена, так и БНТ-доменов. Несмотря на то что эти 2 фосфа тазы имеют идентичную доменную организацию и являются близкими (более 55%) гомологами, они могут иметь разные биологические функции. Ранее SHP-1 рассматривалась как белок, подавляющий сигнализацию от рецепторных ТИК, a SHP-2 и Csw - как фосфатазы, усиливающие этот сигнал. Более поздние исследования свидетельствуют в пользу того, что характер действия этих фосфатаз зависит от конкретного сигнального пути. SHP-1 в гематопоэтических клетках Мыши фенотипа motheaten, несущие мутацию в локусе SHP-1, имеют широкий спектр метаболиче ских и митогенных дефектов, которым подверже ны практически все линии клеток крови. Это вы звано тем, что SHP-1 подавляет внутриклеточную сигнализацию от рецепторов цитокинов и таких мультисубъединичных рецепторов, как рецепторы антигенов, Fc-рецепторы и рецепторные тирози новые протеинкиназы. В клетках, в которых рецеп торы эритропоэтина имеют мутацию, предотвра щающую связывание с SHP-1, происходит пролон гированное фосфорилирование 1ак2-киназы, ассо циированной с c-kit, с которым в свою очередь свя зан рецептор эритропоэтина, вследствие чего эти клетки обладают повышенной митогенной актив ностью [38]. Подобным же образом у мышей с фе нотипом me/me макрофаги, стимулированные ин- терфероном-а, обладают заметно повышенным уровнем тирозинового фосфорилирования Jakl-ки назы. На основании этого можно предположить, что одной из основных функций SHP-1 является взаимодействие с семейством Janus-киназ (Jak). Однако не все тирозиновые протеинкиназы семей ства Janus могут инактивироваться путем дефосфо рилирования, которое осуществляется фосфатазой SHP-1. Так, интерферонзависимая активация Тук2 протекает одинаково хорошо в нормальных макро фагах и макрофагах из те/те-мышей [18]. Было обнаружено, что взаимодействие SHP-1 с рецепто ром IL-2P положительно коррелирует с понижени ем содержания фосфотирозина в киназах Jakl и Jak3, ассоциированных с рецептором IL-2|3 [52]. В этих исследованиях было продемонстрировано, что SHP-1 регулирует активность некоторых из ассо циированных с рецепторами изоформ Jak, но пря мого дефосфорилирования этой протеинкиназы фосфатазой SHP-1 не обнаружено. Возможно;, что во взаимодействии между SHP-1 и протеинкиназа- ми семейства Janus участвуют белки-посредники. Открытым остается вопрос о том, какая фосфатаза берет на себя функцию SHP-1 у мышей с феноти пом me/me. Активация лимфоцитов антигеном че рез В-клеточный рецептор подавляется при кросс сшивке молекул Fc-рецептора (FcyRIIB). При этом изменяется также образование антител под дейст вием иммунных комплексов. Мутация специфиче ского тирозинового остатка в FcyRIIB переводит В- клетки в необратимо активированное состояние. Синтетический фосфопептид, отражающий после довательность I/VXYXXL из рецептора FcyRIIB, связывается с SHP-1, SHP-2 и инозитолмонофос фатазой (SHIP) [61]. Обнаружено, что в В-лимфоцитах мышей с фе нотипом me/me FcyRIIB не может подавлять акти вацию клеток антигеном, на основании чего пред положено, что SHP-1 является сигнальной молеку лой, используемой FcyRIIB для подавления сигна лизации от В-клеточного рецептора (BCR). При нарушении связывания SHP-1 с FcyRIIB общий уровень тирозинового фосфорилирования не изме няется, что свидетельствует о том, что фосфатаза SHP-1, активированная связыванием с FcyRIIB, имеет ограниченный доступ к своим субстратам или же количество активированных молекул фос фатазы невелико [17]. У мышей фенотип me/me FcyRIIB сохранял способность подавлять актива цию тучных клеток, на основании чего было пред положено, что в этом случае SHIP или SHP-2 вы полняют функцию SHP-1. Более поздние данные тех же исследователей, полученные на линиях В-клеток с разрушенными генами SHP-1 или SHIP, показали, что проведение регуляторного сигнала от рецептора FcyRIIB зави сит в большей степени от SHIP, чем от SHP-I, то гда как сигнализация от рецепторов семейства KIR (от Killer cells Inhibitory Receptors) в большей сте пени использует SHP-1, чем SHIP [62]. При этом остается вопрос о причине нарушения сигнализа ции у me/me-мышей, а также о роли SHIP в клет ках этих мышей. Возможно, что эти 2 фосфатазы действуют скоординированно или же влияют на активность друг друга. Аминокислотные последовательности, подоб ные найденным в рецепторе FcyRIIB, были обна ружены также в других рецепторах и впоследствии получили название ITIM (Immune receptor Tyrosine based Inhibitory Motives) [55]. ITIM-последователь ность была обнаружена в KIR и белке CD22 (В- клеточный корецептор). Белки KIR связываются с М НС-молекулами первого класса и защищают клетки хозяина от лизиса натуральными киллера ми. SHP-1 связывается с фосфотирозином в соста ве ITIM через SH2-домены, и это вызывает акти вацию ее тирозинпротейнфосфатазного домена. Более, того, гиперэкспрессия каталитически неак тивного мутанта SHP-1, у которого цистеин в ак тивном центре заменен на серин (SHP-1-CS), бло кирует опосредованное KIR ингибирование акти вации NK-клеток [12]. Учитывая то, что SHP-1, SHP-2 и SHIP могут связываться через свои SH2- домены с фосфотирозинами в составе разных бел ков, трудно представить, что только SHP-1 регули рует сигнализацию, вызываемую KIR. SHP-1 мо жет непосредственно взаимодействовать с CD22, и эффективность этого взаимодействия может опре делять порог чувствительности В-клеток к антиге ну [21]. У трансгенных мышей по BCR, получен ных на основе me/me-мышей, не наблюдалось по вышенной чувствительности к антигенам [16], что подтверждает данную гипотезу. Тем. не менее нет доказательств того, что ITIM в молекуле CD22 дей ствительно необходим для того, чтобы CD22 мог ингибировать сигнал, проводимый от BCR. Другой молекулой, подавляющей активацию В- лимфоцитов, является парный иммуноглобулин- подобный рецептор, в цитоплазматической части которого есть 4 тирозиновых остатка, фосфорили рующихся при активации В-клеток. Тирозиновый остаток Y771 удовлетворяет консенсусной последо вательности для ITIM, и его замена на фенилала нин лишает рецептор способности подавлять акти вацию В-клеток. Было показано, что обе фосфата зы SHP-1 и SHP-2 связываются с этим фосфори лированным тирозиновым остатком [50] и, по-ви димому, активация одной или обеих фосфатаз не обходима для подавления активации В-лимфоци- тов. SHP-1 может связываться с фосфорилирован ным рецептором c-kit и фосфорилируется под дей ствием фактора steel, который является лигандом c-kit. Показано, что в гематопоэтических клетках на ранних стадиях дифференцировки дефосфори лирование c-kit опосредуется SHP-1, а высокая ак тивность регуляторного пути, в котором участвует c-kit, может являться одной из причин развития фенотипа motheaten [48, 49, 63]. IRS-1-активирует фосфатазу SHP-2 ТПФ SHP-2, обладающая двумя Sl-12-доменами, экспрессируется в большинстве клеток млекопи тающих [27]. Некоторые из рецепторов факторов роста, включая EGFR, PDGFR, c-K.it, специфично связываются с ЗН2-доменами SHP-2 [24, 45, 46, 83]. При стимуляции клеток инсулином SHP-2 мо жет связываться с тремя фосфорилированными ти розиновыми остатками в IRS-1 [22, 40], она также связывается с фосфорилированным Y1U6 в регуля торной петле инсулинового рецептора [36]. SHP-2 активируется при связывании с фосфорилирован ными фосфопептидами, повторяющими последо вательности YXXL из IRS-1, причем полная акти вация достигается при связывании фосфопептидов с обоими 8Н2-доменами [67]. Связывание SHP-2 с различными докинг-белками может обеспечивать локализацию фосфатазы в специфических клеточ ных компартментах, тем самым регулируя опреде ленные сигнальные пути. Опубликованы данные о том, что каталитиче ская активность SFIP-2 требуется для проведения метаболического сигнала от рецептора инсулина, так как стабильная экспрессия каталитически не активной формы фосфатазы подавляет инсулинза висимую активацию MAP-киназы и транскрипцию c-fos в интактных клетках [58, 73, 93]. Этот эффект частично устраняется при коэкспрессии протоон когена v-ras или адапторного белка Grb2, указывая на то, что SHP-2 действует "выше” от киназы Ras, и возможно, выполняя функцию адаптерного бел ка между инсулиновым рецептором и Grb2 [58]. Другими авторами было показано, что SHP-2 мо жет дефосфорилировать IRS-I и тем самым моду лировать некоторые из сигналов, проводимых этим белком [41]. Эта гипотеза подтверждалась данными о том, что у мышей с одной разрушенной аллелью гена SHP-2 и соответственно экспрессирующих половину нормального количества фосфатазы, фосфорилирование IRS-1 было интенсивнее, и ак тивность связанной с IRS-1 Р13-киназы была выше в ответ на стимуляцию клеток инсулином [5]. Ко гда мутант 1RS-1, не несущий сайтов связывания с SHP-2, был экспрессирован в клетках 32D, наблю далось повышение уровня его тирозинового фос форилирования и увеличение связанной с ним ак тивности Р13-киназы, а также двукратное возраста ние включения [3Н]-тимидина в ДНК в ответ на стимуляцию инсулином [51]. Ингибирование сигнализации через IRS-1 Для контроля уровня тирозинового фосфорилиро вания IRS-1 было предложено 2 механизма. Один из них заключается в ингибировании тирозинового фос форилирования IRS-1 за счет его фосфорилирования по сериновым и треониновым остаткам [34, 35, 82]. Так, в адипоцитах ЗТЗ L1 обработка окадаевой кисло той увеличивает сериновое фосфорилирование IRS-1, уменьшает его тирозиновое фосфорилирование и ин сулинзависимую активацию Р13-киназы [82]. Точеч ная мутация в IRS-1, заменяющая серин на аланин в консенсусной последовательности для фосфорилиро вания 1RS-1 MAP-киназой, увеличивает и тирозино вое фосфорилирование IRS-1, и ассоциированную с ним активность Р13-киназы [54]. Эти данные свиде тельствуют о том, что фосфорилирование сериновых остатков в IRS-1 может ингибировать инсулинстиму- лированное фосфорилирование последовательностей YMXM в IRS-1, тем самым подавляя взаимодействие р85 с 1RS-1. Альтернативный и более специфический меха низм регуляции IRS-1 заключен в прямом дефос форилировании фосфотирозиновых остатков IRS-1. О существовании фосфатаз, дефосфорилируюших 1 RS-белки, свидетельствует тот факт, что в покоя щихся клетках эти белки не фосфорилированы по тирозиновым остаткам. Как было упомянуто выше, фосфатазы, содержащие Sl-12-домены, являются подходящими кандидатами для выполнения этой функции, так как они могут специфично связы ваться только с фосфорилированным по тирозино вым остаткам IRS-1. Сообщалось, что SHP-2 свя зывается с фосфорилированным IRS-1 [40], дефос- форилирует его in vitro [41], но в экспериментах в клеточной системе данные по прямому дефосфо рилированию 1RS-1 этой фосфатазой не подтвер дились [36, 42]. Другой, наиболее вероятной ТПФ, выполняющей эту функцию, является SHP-1. Инсулиновая сигнализация осуществляется пу тем фосфорилирования и дефосфорилирования специфических тирозиновых остатков в молекулах белков. Выявлено 2 класса ферментов - тирозино вые протеинкиназы и ТПФ, катализирующие эти превращения. Классифицировано семейство бел ков-посредников, или докинг-белков, на которых собираются мультиферментные, сигналпроводя- щие комплексы, а также определена роль доменов белков, за счет которых образуются эти сигналпро- водящие комплексы. Вместе с тем остается не до конца выясненным механизм "разборки" этих мультисубъединичных комплексов. Если основополагающим принципом для сборки этих комплексов служит тирозиновое фосфорилирование, то для разборки этих белковых комплексов основную роль должно играть тирозино вое дефосфорилирование. ТПФ, содержащие SFI2- домены, являются прекрасными кандидатами на роль фосфатаз, дефосфорилируюших докинг-белки. Эти фосфатазы могут высокоспецифично связываться с последовательностями, содержащими фосфорилиро ванные тирозиновые остатки, тем самым как бы вхо дя в состав этих сигналпроводящих комплексов. По иск непосредственных субстратов этих фосфатаз, без условно, важен для более полного понимания карти ны внутриклеточной сигнализации.