Стимуляция роста "нормальных" тиреоцитов лимфоцитами, инфильтрирующими ткань диффузного токсического зоба

Аутоиммунные заболевания щитовидной желе зы - диффузный токсический зоб (ДТЗ) и тирео идит Хашимото (ТХ) - характеризуются лимфоид ной инфильтрацией органа и присутствием в сы воротке крови антитиреоидных антител. Коренное различие между этими заболеваниями заключается в том, что при ДТЗ происходят активация и про лиферация тиреоцитов, а при ТХ - их гибель и за мещение лимфоидными элементами. Причины и механизмы усиления пролиферации клеток щито видной железы при ДТЗ остаются неясными [3]. Учитывая принципиальную возможность стимули рующего действия лимфоцитов на пролиферацию клеток-мишеней [1, 2], в настоящей работе мы по пытались выяснить, не связано ли характерное для ДТЗ нарастание массы тиреоцитов с действием ин тратиреоидных лимфоцитов (или их продуктов). Ранее нами было показано, что in vitro тиреоциты из ДТЗ отличаются от "нормальных" (выделенных из околоузловой ткани эутиреоидного узлового зоба) существенно меньшей чувствительностью к цито токсическому действию комплементфиксирующих аутоантител и значительно меньшим связыванием сывороточных антител, что трактовалось в пользу снижения количества поверхностных антигенов (ре цепторов) на этих клетках [5]. Такое снижение ин дуцировалось на "нормальных" клетках в ходе их преинкубации с лимфоцитами из ДТЗ [4, 5]. По скольку количество поверхностных антигенов сни жается в процессе клеточного деления [12], описан ный выше эффект лимфоцитов из ДТЗ мог бы явиться следствием ростстимулирующего действия последних на клетки щитовидной железы. Материалы и методы Тиреоциты выделяли из тканей щитовидных желез, полученных при операции больных с эути реоидным узловым зобом и ДТЗ, как описано ра нее [5]. Операции выполняли в хирургическом от делении (зав. - доктор мед. наук Н. С. Кузнецов) ЭНЦ РАМН. Ткань измельчали ножницами и инкубировали 3 ч в растворе Hanks без Са2+ и Mg2+ (pH 7,2) с 1 мг/мл коллагеназы ("Boeringher") при постоянном встряхивании. Клеточные конгломераты измельча ли далее с помощью пипетирования, фильтровали через крупноячеистый фильтр и трижды центрифу гировали в среде МЕМ при 400 g в течение 45 с. Для отделения лимфоцитов от тиреоцитов взвесь клеток центрифугировали при 200 g в течение 1 мин. Ци тологический анализ подтвердил преимущественное присутствие кластеров тиреоцитов в осадке, а лим фоцитов - в супернатанте. Клетки культивировали в среде 199 на Hanks-балансированном солевом рас творе (pH 7,2) с 0,6 мг/мл глутамина, 2,4 мг/мл Таблица 1 Динамика роста тиреоцитов в присутствии разных концентраций FSC (М± т) Концентрация FSC Тиреоциты 0% 0,5% 5% 10% "Нормальные" 100 141 ± 9* 164 ± 7* 160 ± 11 ДТЗ 100 100 ± 10 89 ± 12 104 ± 13 Примечание. Приведены средние величины (в процен тах) из 5 экспериментов; эффект каждой концентрации FSC в опыте оценивали по оптической плотности (D = 594 нм) окра шенных препаратов не менее, чем в 8 лунках. Звездочкой отме чены величины, статистически значимо (р < 0,05) отличающие ся от величин предыдущего столбца. HEPES, пенициллином и стрептомицином (по 50 ЕД/мл) и эмбриональной сывороткой теленка (FCS) в различных концентрациях. Тиреоциты и лимфоциты (по 50 000 клеток) по мещали в лунки плоскодонного 96-луночного планшета и инкубировали при 37°С в насыщенной СО2 и водяным паром атмосфере. По окончании культивирования ростовую среду удаляли, клетки промывали средой 199, высушивали на воздухе, фиксировали 96% этиловым спиртом не менее 20 мин и окрашивали в течение 30 мин раствором азура (1 г/л). Окрашенный препарат промывали во дой, высушивали и для получения гомогенной ок раски перед просмотром заливали этиловым спир том (100 мкл/лунка), экстрагирующим краситель. Окончательное количество клеток в лунках оцени вали по интенсивности окраски (величине оптиче ской плотности при D = 594 нм, определяемой на многоканальном вертикальном спектрофотометре ЭФОС). Альтернативно клетки культивировали в лунках с покрытым агаром дном; подсчет клеток производили в камере Горяева. Результаты и их обсуждение Вначале мы сравнивали динамику роста "нормаль ных" тиреоцитов с таковой тиреоцитов, выделенных из ткани ДТЗ. Эксперименты проводили в присутст вии FCS в концентрации 0,5, 5 и 10%. (табл. 1). В первые 24 ч культивирования количество "нор мальных" тиреоцитов увеличивается параллельно концентрации FCS в среде, что соответствует дан ным литературы [8]. В отличие от "нормальных" кле ток интенсивность роста тиреоцитов, выделенных из ткани ДТЗ, не зависела от концентрации FCS. Эта особенность роста тиреоцитов из ДТЗ выявлена нами впервые. Она могла бы быть связана с тем, что в тиреоцитах из ДТЗ рецепторы присутствующих в FCS ростовых факторов были исходно оккупирова ны гипотетическими ростстимулирующими антите лами. Однако, как показано нами ранее с помощью клеточного иммуноферментного метода [5], при ис пользованном способе выделения клеток антитела на поверхности тиреоцитов из ДТЗ отсутствуют. По лученные данные могут свидетельствовать о сниже нии на поверхности тиреоцитов из ДТЗ количества рецепторов к внеклеточным факторам роста, при сутствующим в FCS. Такая трактовка соответствует ранее высказанному предположению [4, 5] об общем снижении количества поверхностных антигенов на тиреоцитах из ДТЗ. Следует отметить, то зависи мость роста "нормальных" тиреоцитов от концентра ции FCS регистрировалась нами лишь при 24-часо вой инкубации клеток, но не при более длительных (72 ч) сроках культивирования. В последующих экспериментах "нормальные" тиреоциты инкубировали с лимфоцитами, изоли рованными из ткани ДТЗ. Для выявления возмож ного эффекта таких предсенсибилизированных лимфоцитов срок совместной инкубации в наших опытах составлял всего 24 ч, поскольку при более длительном инкубировании (более 48 ч) могла про изойти сенсибилизация и десенсибилизированных иммуноцитов [12]. Оказалось, что при совместном культивирова нии "нормальных" тиреоцитов и лимфоцитов из ДТЗ в отсутствие FCS количество клеток через 24 ч (по показаниям экстинкции) увеличивалось в сред нем на 30% (табл. 2). Прирост количества клеток в процессе совмест ного культивирования "нормальных" тиреоцитов с лимфоцитами из ДТЗ происходил, очевидно, именно за счет тиреоцитов, поскольку они прикре пляются к пластику, тогда как лимфоциты при промывании лунок удаляются. При другом способе подсчета (в камере Горяева) прирост количества клеток в случае совместного инкубирования "нор мальных" тиреоцитов с лимфоцитами из ДТЗ дос тигал 100%. При всех других вариантах экспери мента статистически значимая стимуляция роста тиреоцитов отсутствовала (см. табл. 2). Неэффек тивность лимфоцитов из ДТЗ в отношении роста тиреоцитов из ДТЗ может подтверждать отсутствие на последних рецепторов, опосредующих ростсти- мулирующие влияния внеклеточных факторов. Среди факторов иммунной природы, способных влиять на пролиферацию тиреоцитов при ДТЗ, упо минаются тиреостимулирующие и специфические ростстимулирующие антитела [3]. Однако титры ти реостимулирующих антител не коррелируют с раз мерами зоба [5], а существование ростстимулирую- щих антител остается гипотетическим. В связи с этим индуцирующий рост тиреоцитов эффект ауто реактивных лимфоцитов вызывает особый интерес. Существование лимфоцитов, инициирующих заживление ран путем стимуляции деления клеток- мишеней при непосредственном контакте с ними, хорошо известно [1, 2]. Эти "ростстимулирующие" лимфоциты принадлежат к популяции хелперов (СЭ4+-клетки) [2]. Среди лимфоцитов, инфильт рирующих щитовидную железу при ДТЗ, также Таблица 2 Влияние лимфоцитов на пролиферацию тиреоцитов в отсутствие FSC (М ± т) 1. "Нормальные” тиреоциты 100 2. "Нормальные" тиреоциты + лимфоциты из ДТЗ* 130 ± 10 (д < 0,05) 3. "Нормальные" тиреоциты + "нормальные" лим фоциты* 98 ± 12 4. Тиреоциты из ДТЗ 100 5. Тиреоциты из ДТЗ + "нормальные" лимфоциты* 92 ± 16 6. Тиреоциты из ДТЗ + лимфоциты из ДТЗ* 104 ± 5 Примечание. Приведены средние данные (в процентах) об изменении экстинкции (при D = 594 нм) из 4 экспериментов (по 8 лунок в опыте на каждый из вариантов). * - инкубируе мые совместно тиреоциты и лимфоциты были получены как от одного и того же, так и от разных пациентов. преобладают СВ4+-клетки [9]. Таким образом, воз можность ростстимулирующего эффекта лимфо цитов, инфильтрирующих щитовидную железу при ДТЗ, получает дополнительное подтверждение. Хотя индуцирующий пролиферацию клеток-ми шеней эффект показан лишь для аутологичных лим фоцитов [1], при аутоиммунных заболеваниях спе цифичность распознавания лимфоцитами клеточ ных антигенных детерминант может быть нарушена, и такие лимфоциты могут приобретать способность стимулировать пролиферацию и гетерологичных клеток. Известно, например, что при одном из ауто иммунных заболеваний (ТХ) цитотоксические Т- лимфоциты способны лизировать и гетерологичные тиреоциты [7]. Обнаруженное нами стимулирующее действие лимфоцитов из ДТЗ (но не из околоузло вой ткани) на пролиферацию "нормальных" тирео цитов позволяет предполагать, что некоторые попу ляции интратиреоидных лимфоцитов (которые в норме могли бы играть репаративную роль) при аутоиммунных поражениях щитовидной железы приобретают зобогенную активность. В последние годы показано, что тиреоциты из ДТЗ, экспрессируя лиганд "смертельного" рецептора Fas (FasL), инду цируют апоптоз инфильтрирующих железу цитоток сических Т-лимфоцитов, тем самым защищая себя от цитотоксического эффекта [10]. Поэтому среди интратиреоидных лимфоцитов при ДТЗ могут пре обладать клетки с иными (в частности, с репаратив- ными/пролиферативными) функциями. Увеличение количества тиреоцитов, наблюдае мое при ДТЗ in vivo, могло бы определяться не только стимуляцией пролиферации этих клеток, но и замедлением их гибели (за счет потери рецепто ров, опосредующих цитотоксическое действие комплементфиксирующих антител [3] и FasL [И]). Высказанная нами ранее гипотеза об общем снижении количества поверхностных рецепторов тиреоцитов под действием аутореактивных лимфо цитов подтверждается индукцией последними ос лабления чувствительности "нормальных" тирео цитов к влиянию ростовых факторов FCS (табл. 3). В табл. 3 приведены результаты одного из опы тов (однотипные клетки инкубировали в 8 лунках одного и того же планшета), поскольку базальные показатели экстинкции клеток, выделенных из разных щитовидных желез, различались и, несмот ря на общую закономерность, усредненные пока затели (в процентах) значительно затрудняли бы восприятие полученных данных. Совместное куль тивирование "нормальных" тиреоцитов с лимфоци тами из ДТЗ лишает клетки щитовидной железы способности реагировать на возрастание концен трации FCS, т. е. придает им особенность, харак терную для тиреоцитов из ДТЗ (см. табл. 1). Лим фоциты, изолированные из околоузловой ткани ("нормальные"), такого влияния не оказывали. В свете полученных данных можно предполо жить, что в начале развития ДТЗ индуцируемая аутореактивными интратиреоидными лимфоцита ми пролиферация тиреоцитов сопровождается "по терей" последними поверхностных рецепторов, опосредующих не только гибель клеток, но и рост- стимулирующий эффект сывороточных факторов (что наблюдается in vitro). В дальнейшем, по-види мому, на тиреоцитах исчезают и рецепторы, опо средующие ростстимулирующее действие и самих Таблица 3 Влияние лимфоцитов из ДТЗ на чувствительность "нормальных" тиреоцитов к ростстимулирующему эффекту FSC (по показате лям экстинкции при D - 594 нм) (М ± и) Клетки Концентрация FSC 1. "Нормальные" тиреоциты 0,077 ± 0,005 0,115 ± 0,006 <0,05 2. Тиреоциты из ДТЗ 0,081 + 0,003 0,079 ± 0,010 нд 3. "Нормальные" тиреоциты + лимфоциты из ДТЗ 0,120 ± 0,01 0,125 ± 0,007 нд 4. "Нормальные" тиреоцить' + "нормальные" лимфои-’ты 0,090 ± 0,010 0,135 + 0,009 <0,05 Примечание, нд - недостоверно. аутореактивных лимфоцитов, и основной причи ной увеличения количества фолликулярных клеток щитовидной железы становится замедление их ги бели, которое не успевает проявиться при кратко временной инкубации in vitro. Именно этим, веро ятно, объясняется отсутствие ростстимулирующего действия аутореактивных лимфоцитов на тиреоциты из ДТЗ в наших опытах (см. п. 6 в табл. 2). В дина мике развития ДТЗ in vivo "потеря" поверхностных рецепторов тиреоцитов, сопровождающаяся замед лением их гибели, становится, очевидно, основным и необходимым условием увеличения этих клеток. Выводы 1. Тиреоциты из ДТЗ по характеру роста отли чаются от "нормальных" отсутствием пролифера тивного ответа, пропорционального дозе стимуля торов роста, присутствующих в FCS. 2. Лимфоциты, инфильтрирующие щитовидную железу при ДТЗ, стимулируют пролиферацию "нормальных" тиреоцитов; лимфоциты из околоуз ловой ткани щитовидной железы в описанных ус ловиях опыта такого эффекта не дают. 3. Ростстимулирующее влияние лимфоцитов из ДТЗ на "нормальные" тиреоциты сопровождается потерей чувствительности последних к изменению дозы стимуляторов роста в среде.