Гены синтаз оксида азота (NOS) в патогенезе сахарного диабета и его осложнений

Молекулярная генетика открыла принципиально новые перспективы в познании природы сахарного диабета (СД) [9]. Изучение генетических факторов риска при мультифакториальных заболеваниях, к которым относится и СД, имеет особенности, обусловленные концепцией молекулярной генетики об ассоциации полиморфных генетических маркеров с предрасположенностью или устойчивостью к развитию патологии. Изучение этих маркеров позволяет определить риск развития патологии, сформировать группы повышенного риска, организовать их мониторинг и в случае необходимости назначать превентивную терапию [9|. Последнее десятилетие в биологии ознаменовано важным событием: установлено, что простейшее химическое соединение - оксид азота (NO) - непрерывно продуцируется ферментативным путем в организме животных и человека, выполняя функции одного из универсальных регуляторов метаболизма. Лавинообразный рост публикаций (более 60 тыс.) по биологии NO, начавшийся с конца 80-х годов, позволил редакции журнала "Scince" в 1992 г. провозгласить NO молекулой года [18], а решением Шведской академии наук за открытие функциональной активности NO в сердечно-сосудистой системе была присуждена Нобелевская премия по медицине за 1998 г. американским ученым Роберту Форчготу, Фериду Мьюрэду и Луису Иг- нарро ("Оксид азота как сигнальная молекула сердечно-сосудистой системы" [4]). Это открытие уже привело к важным последствиям в медицине, не менее существенное значение оно имеет и для биологии в целом, сформировав особую область биологии - биологию NO [5]. Спектр направлений в этой области огромен и охватывает практически все разделы биологии и медицины. Поскольку NO имеет отношение почти ко всем метаболическим и физиологическим процессам, есть все основания полагать, что исследовательские работы в этой области помогут решать не только фундаментальные биологические задачи, но и прикладные, особенно медицинские. Общие сведения об NO Газообразный химический мессенджер NO, по современным представлениям, играет роль универсального регулятора множества физиологических процессов в организме. NO - свободный радикал, период полужизни которого составляет всего несколько секунд [4, 16]. Высокий диффузный коэффициент NO, который в 1,4 раза выше, чем у кислорода, определяет его способность распространяться в ткани на значительные расстояния [16]. Анализ данных литературы показал, что продукты реакций, связанных с нейтральной молекулой О2 и ее активными формами - супероксидом, пероксидом, а также ферментами активации молекулярного кислорода (Fe2+- и Си2+-содержащими белками), супероксиддисмутазой и каталазой, могут быть замкнуты в цикл. Учитывая принципы симметрии и важную роль супероксидного анион-радикала в процессах, регулирующих содержание NO, этот процесс был назван циклом супероксидного анион-радикала, или циклом супероксида [18]. NO - мощный перехватчик супероксид-анио- на: О; + NO = ONOO-. Известно, что пероксинитрит (ONOO) обладает высокой токсичностью: он способен окислять NH-- и SH--rpynnbi белков, что приводит к ОКОО“-инактивации а,-ингибитора протеаз, тканевого ингибитора металлопротеаз (Mn-COD и Fe-COD) [6, 10]. В то же время в его присутствии образуются тиильные радикалы глутатиона (GS), в результате чего последний превращается в прооксидант и инициирует процессы перекисного окисления липидов в мембранах и ЯП сыворотки крови, что усиливает их захват макрофагами и лежит в основе поражения сосудов при атеросклерозе и диабете [15]. Таким образом, обладая высокой реакционной способностью, NO может как активировать цепные свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их за счет увеличения или подавления активности антиоксидантных ферментов или экспрессии кодирующих их генов [13]. Ингибирование каталазы является важным дополнительным механизмом действия NO: в эксперименте было показано, что тоническое выделение NO, обусловленное образованием ONOO-, участвует в ингибировании каталазы, и сосудистые эффекты зависят от катализируемого каталазой метаболизма перекиси водорода [13]. Образование NO обнаружено в эндотелии сосудов, гранулоцитах, макрофагах, тромбоцитах, гепатоцитах, гладкомышечных, мезангиальных клетках и нейронах. NO регулирует тонус кровеносных сосудов как антагонист адренергической нервной системы, тормозит агрегацию тромбоцитов и их адгезию на стенках сосудов. Он вызывает расслабление гладких мышц не только в стенке сосудов, но и в стенке желудочно-кишечного тракта. NO функционирует в центральной и вегетативной нервной системах: показано его участие в регуляции преси- наптического высвобождения нейропередатчиков, синаптической пластичности нервной ткани, памяти [3, 4, 10, 17, 52, 55]. По эфферентным нервам он регулирует деятельность дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы [2, 33, 65, 71]. Наряду с регуляторными функциями NO обнаруживает цитостатическую/цитотоксическую активность, выступая в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета: гиперпродукция NO активированными макрофагами и нейтрофилами коррелирует с их цитотоксическим эффектом при аутоиммунных процессах [5, 10, 18, 20]. Особый интерес представляет способность NO и его производных экспрессировать ряд важнейших белков и ферментов на уровне как транскрипции, так и трансляции (стресс-белков, ферритина, белков антиоксидантной защиты и др.), активировать или подавлять активность многих белков и ферментов (гуанилатциклазы, рибонуклеотидре- дуктазы, компонентов дыхательной цепи и гликолиза, фактора транскрипции NFkB, белков типа цитохрома Р-450 и др.) [5, 8, 13, 22]. Характеристика синтаз NO Синтез NO осуществляется семейством цитохром P-450-подобных гемопротеинов - NO-син- таз (NOS). Различают 3 формы NOS: нейрональную (nNOS), индуцибельную (iNOS) и эндотелиальную (eNOS), кодируют которые соответствующие гены: NOS1, NOS2 и NOS3 [70]. Данные гены идентифицированы, установлены их экспрессия в разные клетки и ткани, а также их взаимосвязь с различной патологией человека (см. таблицу). Ген nNOS - NOS1 - локализован на хромосоме 12 человека и состоит из 29 экзонов и 28 интронов размером более 200 кв. NOS1 постоянно экспрессируется во многих тканях, включая нейроны периферической и центральной нервной системы, скелетные мышцы и клетки эпителия легких. Продуцируемый геном NOS1 NO известен как нейротрансмиттер неадренергических и нехолинергических нервных синапсов, а также как бронходилататор физиологических процессов дыхания [17, 29]. В гепатоцитах, макрофагах, нейтрофилах, мезангиальных и гладкомышечных клетках синтез NO определяет iNOS, при стимуляции которой продукция NO может возрастать в десятки раз, при этом NO приобретает цитотоксические свойства. Ген NOS2 был впервые клонирован и картирован Хартрайном в 1994 г. [30] на хромосоме 17ql 1.2 человека из гепатоцитов. Последующие исследования этого участка хромосомы 17 позволили выделить клоны, содержащие 3 независимых гена. Один клон кодировал ранее идентифицированный ген, обозначенный теперь как NOS2A, и экспрессировался он преимущественно в гепатоцитах. Два других гена были названы NOS2B и NOS2C с преимущественной экспрессией в макрофагах. Экспрессия генов iNOS, как и синтез самой iNOS, обеспечивается сложной многоуровневой молекулярной регуляцией. INOS индуцируется комбинацией факторов: интерлейкина-1 (ИЛ-1), фактора некроза опухолей (TNF), интерферона J и липополисахаридов [10, 45]. К тому же в результате экспрессии iNOS воспалительные стимулы вызывают в кровеносных сосу- Гены изоформ NOS: структура, связь с патологией Признак Ген NOSI NOS2 NOS3 Формальные данные Хромосомная локализация 12q24.2 17qll.2-ql2 7q35-q36 Тканеспецифичная экспрессия Нейроны Гепатоциты, макрофаги Клетки эндотелия Размер гена > 200 kb =37 kb = 21 kb Число экзонов 29 26 26 Размер мРНК 8,5-9,5 kb 4,2-4,5 kb 4,3-4,8 kb Известные полиморфизмы Экзон 29 - (GT)„ Экзон 29 - SNP Экзон 22 - SNP Экзон 18 - SNP Промотор - (ССТТТ),, Промотор - G954C Промотор - A924G, Промотор - С788Т, Промотор - С691Т, Промотор - Т786С, Интрон 4 - VNTR, Экзон 6 - С774Т, Экзон 7 - G894T, Экзон 7 - Glu298Asp, Экзон 16 - C1998G. Патология Эссенциальная гипертензия (-), Япония; бронхиальная астма (+), европеоиды (США) Малярия (-), Африка; диабетическая ретинопатия (+), Северная Ирландия Эссенциальная гипертензия (+), Япония; коронарный атеросклероз (+), Япония; артериальная гипертензия (-), Франция; ишемический инсульт (-), Англия; болезнь Альцгеймера (+), Испания; ИБС, связанная с курением (+), Англия, Австралия; неинсулинзависимый диабет (+), Япония; мигрень (-), Англия; преэклампсия (+), Англия; эмфизема легких (-), Италия; инфаркт миокарда (+), Япония дах стойкую продукцию больших количеств NO. Это происходит при септическом шоке и при местных реакциях, вызванных разрушением эндотелия и атеросклерозом. Таким образом, iNOS в сосудах может защищать ткани благодаря вазодила- таторному, антитромботическому и ингибирующему адгезию лейкоцитов действию NO [20]. NO активно влияет на процесс генетически запрограммированной гибели клеток - апоптоз, что крайне важно для понимания патогенетических механизмов дебюта СД типа 1 (СД1) и его сосудистых осложнений [5, 20]. Единственный способ снять это отрицательное действие на организм - ослабить с помощью специфических ингибиторов iNOS генерацию этим ферментом NO [5]. Имеются данные о положительных результатах такого подхода. Разрабатываются фармакологические средства, которые способны подавлять или усиливать активность NOS и тем самым модулировать генерацию эндогенного NO [5, 14, 39, 43, 57]. Перспективным подходом является регуляция синтеза NOS на генетическом уровне. Например, показано угнетающее действие глюкокортикоидов на активность гена, ответственного за синтез iNOS у животных. Другая группа лекарственных средств, разрабатываемых в настоящее время, - это соединения, способные продуцировать NO [5]. В то же время [[2] Б. С. Тэйлор обнаружил защитное влияние NO как in vivo, так и in vitro, которое проявляется в его способности предотвращать апоптоз и ослаблять токсикоз печени. Экспрессия iNOS в печени рассматривается как адаптивный ответ ткани, обеспечивающий снижение степени ее повреждения. NO способен инициировать перекисное окисление липидов, окислять сульфгидрильные группы и реагировать с активными формами кислорода с образованием токсичных продуктов, что сказывается на течении СД. В клетках эндотелия сосудов находится зависимая от Са2+ и кальмодулина неиндуцируемая NOS, ген которой (NOS3) расположен на хромосоме 7. Вырабатываемый ею NO является самым мощным из известных эндогенных вазодилататоров [4, 40, 69]. Сосуды малого диаметра и артерии синтезируют больше NO, чем крупные сосуды и вены. За счет этого NO регулирует периферическое сопротивление, АД и распределение кровотока в сосудистой сети [14]. По мнению нобелевского лауреата Дж. Вейна "эндотелий - это маэстро кровообращения, а NO - дирижерская палочка в руках маэстро" [18]. В опытах продемонстрировано, что депонирование NO в гладкой мышце в отсутствие эндотелия также может служить компенсаторной реакцией, обеспечивающей вазодилататорный тонус сосудов при повреждении эндотелия, вызванном, например, атеросклерозом, процедурой катетеризации сердца или трансплантацией сосуда [19]. У животных с недостатком NOS3 наблюдается сужение сосудов, что приводит к ряду расстройств сердечно-сосудистой системы. Недостаток NOS3 может быть обусловлен как наследственными факторами, так и повреждением эндотелия сосудов при склеротических изменениях. Купирование таких патологических реакций достигается введением лекарств, продуцирующих NO, или активацией синтеза NOS3 в эндотелиальных клетках сосудов. В этом плане являются перспективными исследования по пересадке животным с врожденной гипертензией гена NOS3, что ведет к нормализации АД у животных [5]. Поэтому изучение полиморфных вариантов гена NOS3 представляет интерес для познания генетических основ сердечно-сосудистой патологии. Так, установлена его взаимосвязь с ЭГ [53], инфарктом миокарда [47, 62], коронарным атеросклерозом [67], синдромом преэклампсии во время бе- Патогенетическая роль NO при СД1. ременности у женщин [24] и гипертрофией левого желудочка [21]. Таким образом, противоречивая природа NO как химического вещества и отбор его в качестве метаболита для выполнения многих, подчас прямо противоположных функций постоянно ставят перед исследователями задачи, методы решения которых незивестны, а результаты не только не предсказуемы, но, даже будучи логически безупречными, часто необычайно трудны психологически для восприятия и первоначально выглядят заведомо артефактом [16]. По мнению А. Ф. Ванина, "ни одно из достижений фундаментальной биологии не нашло столь быстрого приложения к практической медицине, как результаты исследований биологической роли NO" [5]. Ассоциация NOS и СД Патогенетическая роль эндогенного NO при СД1 изучается с двух точек зрения: как фактора, участвующего в индукции самого заболевания, и как фактора, аномальная экспрессия которого играет заметную роль в формировании ангиопатий [12, 35]. В первом случае молекула NO выступает в роли важного эффектора в аутоиммунной деструкции [З-клеток поджелудочной железы, что приводит к их резкому количественному уменьшению и развитию клинической картины СД1 (см. рисунок). Эксперименты с различными клеточными культурами показали, что повреждающему действию NO наиболее подвержены клетки островков Лангерганса, деструкция которых является ключевым звеном развития СД1. Источником образования NO являются макрофаги и собственно р-клетки [48, 54], при этом усиление цитотоксического эффекта наблюдается при индукции синтеза NO и экспрессии iNOS данными клетками под действием цитокинов (особенно лимфоцитарного ИЛ-1) через активацию G-белков [31, 32, 54, 63]. Общим же корнем всех диабетических микроангиопатий является изменение работы клеток эндотелия сосудов - эндотелиальная дисфункция [1, 7, 111. Данные о роли NO в патогенезе диабетических ангиопатий достаточно противоречивы. В ряде исследований обнаружено снижение продукции NO тромбоцитами при СД: предполагают, что дефицит NO имеет значение в развитии гиперагрегации тромбоцитов [26, 49, 56, 60, 61]. В других исследованиях выявлено повышение активности тромбоцитарной NOS у больных СД1 с нефропатией [23]. V. Bremer и соавт. [25] обнаружили, что диабетическая сыворотка содержит фактор, вызывающий повышение выработки NO нормальными нейтрофилами. Вместе с тем содержание метаболитов NO в плазме крови при СД может иметь как повышенные значения, так и быть снижено [27, 36]. Кислородные радикалы, такие как анион супероксида О2, способны инактивировать NO и тем самым снижать эндотелийзависимую релаксацию [41, 51]. Экспериментальные данные свидетельствуют о зависимости NO от активности ренин-ангиотензи- новой системы (РАС), определяя релаксацию сосудов и регуляцию функции эндотелия [37]. Высвобождение NO происходит под действием брадикинина, опосредованного действием ангиотензин- превращающего фермента (АПФ) [44]. АПФ блокирует этот механизм и снижает содержание NO и простагландинов. Кроме того, установлена зависимость ангиотензина II, эндотелина и вазопрессина от NO с патологией сосудов при диабете [50]. Работы последних лет продемонстрировали увеличение продолжительности жизни больных диабетом при коррекции нарушенной функции РАС [37, 58]. В связи с этим совместное изучение генов РАС и eNOS, детерминирующих в определенной степени эндотелиальную функцию сосудов, является актуальным. Одним из ранних сосудистых осложнений СД является диабетическая ретинопатия, конечным результатом которой может быть потеря зрения. В эксперименте на животных показано, что сетчатки животных с экспериментальным диабетом содер- жали увеличенное количество NO по сравнению с таковым в сетчатках крыс без диабета [34, 42]. Показана роль nNOS в патогенезе диабетической нейропатии в эксперименте (в спинном нервном ганглии крыс с диабетом) [59]. Показатели системы nNOS-cGMP были снижены при диабете и корригировались инсулином. Авторами сделан вывод о том, что данные нарушения могут играть важную роль в патогенезе диабетической сенсорной нейропатии. В целом в клетках нервной системы обнаружено 3 вида NOS, обсуждается их вклад в различную патологию данной системы. Среди генетических маркеров был изучен ди- нуклеотидный полиморфизм в гене NOS2 и NOS3 у 93 больных ретинопатией с СД типов 1 и 2, жителей Северной Ирландии [681. Было показано, что 14 повторов маркера NOS2 имели достоверную ассоциацию с отсутствием ретинопатии у больных СД, а полиморфизм гена NOS3, по всей видимости, не имеет решающего значения для определения восприимчивости или устойчивости к диабетической ретинопатии. Наиболее тяжелое осложнение СД - это диабетическая нефропатия, являющаяся причиной ранней инвалидизации больных и основной причиной смерти при данном заболевании [9]. В экспериментальных и клинических научных работах в последние годы активно изучается роль NOS и вырабатываемого ими NO в развитии почечной патологии [39, 53, 64, 66]. В нормальных почках выявлено преобладание eNOS; iNOS выделена в минимальных количествах, a nNOS не обнаружена [38]. Необходимо отметить, что NO участвует в регуляции почками водно-солевого обмена [18]. Результаты ряда исследований свидетельствуют о том, что избыточное образование NO может играть патогенетическую роль и при ряде аутоиммунных болезней (например, системный липоидный эритематоз, хронический гломерулонефрит и др.), характеризующихся поражением почек: индукция iNOS и, таким образом, азотное окисное производство играют роль в возникновении апоптоза при липоидном гломерулонефрите, а подавление iNOS может предотвращать повреждение гломерул в ранней стадии нефрита [25, 39, 43, 46]. Терапия производными а-аргинина, такими как L-NAME (Nw- нитро-а-аргинин), вызывает супрессию iNOS макрофагами и увеличивает синтез eNOS [72]. В клиническом исследовании [64] подтверждено, что у детей с первичным нефротическим синдромом был увеличен синтез NO. Авторы делают вывод о том, что данные о синтезе NO могут быть диагностическим критерием между минимальными изменениями у больных с нефротическим синдромом и гломерулонефритом. Исследователи приходят к выводу, что каждый вид NOS может играть свою роль в патогенетических механизмах поражения гломерул, а в целом V. Cattell [28] считает, что при аутоиммунном поражении почек NO может быть как потенциально ядовит, так и играть защитную роль. Это может зависеть от генетического контроля, производства других радикалов и деятельности аргиназ. Таким образом, при СД в условиях выраженных гормонально-метаболических изменений, сопровождающихся активацией перекисных процессов и нарушением цикла NO, одним из наиболее точных и ранних маркеров могут являться гены NOS. Анализ генотипов при СД позволит выявить "генетические ансамбли", которые помогут идентифицировать группы "высокого риска" по развитию данного заболевания и его осложнений. Задача установления причинно-следственных связей между генами и различными патологическими фенотипами при СД, представляется весьма актуальной. Такой подход имеет практическое значение для профилактической медицины и фармакогенетики.