Влияние нейропептидов на функциональное состояние эндокринной функции поджелудочной железы. Эффекты хронического введения [Arg8]-вазопрессина

В последние годы опубликован ряд исследований, результаты которых позволяют рассматривать вазопрессинергическую нейросекреторную систему гипоталамуса как одно из возможных звеньев в центральной регуляции функциональной активности р-клеток поджелудочной железы. Показано, что при стрептозотоциновом сахарном диабете у крыс [3, 11], а также у мышей линии C57BL/KsJ с наследственным диабетом [2] наблюдается увеличение морфофункциональной активности вазопрессинсинтезирующих крупноклеточных субъядер паравентрикулярного и супраоптического ядер гипоталамуса. Это сопровождается повышением концентрации вазопрессина в периферической крови как у диабетических животных [3, 9], так и у больных сахарным диабетом [15]. В экспериментах in vitro показано, что в условиях гипергликемии вазопрессин стимулирует секрецию инсулина р-клетками [12, 13, 21].

Целью настоящего исследования было изучение влияния хронического центрального и периферического введения [Arg⁸]-вазопрессина интактным и диабетическим крысам на функциональное состояние р- и ос-клеток поджелудочной железы.

Материалы и методы

Исследование проведено на 84 крысах-самцах линии Вистар массой 250—270 г. Сахарный диабет у крыс моделировали однократным введением стрептозотоцина фирмы ’’SIGMA Chemical” (США) в дозе 50 мг/кг в 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (pH 4,5) внутрибрюшинно. Для центрального (интрацеребровентрикулярного) введения вазопрессина экспериментальным животным предварительно имплантировали стальную канюлю (калибр G27) в правый латеральный желудочек мозга по координатам АР = 9,5 мм, L = 1,5 мм, Н = 4,5 мм [20]. На 8-й день после операции животным опытной группы вводили стрептозотоцин. Начиная с 33-го дня интрацеребровентрикулярно ежедневно в течение 10 дней вводили синтетический [Arg⁸]-вазопрессин ("Peninsula Laboratories Inc.”, США) в дозе 24 фМ группам диабетических и нормальных крыс. Контрольным группам нормальных и диабетических животных по аналогичной схеме вводили 3 мкл 0,9% NaCl. Периферическое введение [Arg⁸]-вазопрессина в дозе 240 пМ в 0,5 мл 0,9% NaCl осуществляли интраперитонеально в аналогичные временные сроки в течение 10 дней. Контрольной группе диабетических крыс интраперитонеально вводили 0,5 мл 0,9% NaCl. Через 24 ч после последнего введения пептида (на фоне 16-часового голодания) животных декапитировали под этаминаловым наркозом (40 мг/кг), брали кровь для определения содержания глюкозы, извлекали поджелудочную железу, которую фиксировали в жидкости Буэна и после стандартной гистологической обработки заливали в парафин. Гормоны в эндокринных клетках поджелудочной железы выявляли методом непрямой иммунофлюоресценции: инсулин — с помощью иммуноцитохимического набора фирмы ’’Peninsula Laboratories Inc.” (США), глюкагон — с помощью мышиных моноклональных антител (первичные антитела в разведении 1:2000) и кроличьих антител к IgG мыши (вторичные антитела в разведении 1:64) производства фирмы ’’SIGMA Chemical” (США). Количественное денситометрическое определение содержания инсулина в р-клетках и глюкагона в ос-клетках проводили в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390—420 нм с помощью автоматизированной компьютерной цитоф- люориметрической системы ЛЮМАМ-И2 (ЛО- МО, Россия) по ранее описанной методике [4]. В каждой экспериментальной группе исследовали 80—100 островков Лангерганса в серийных срезах различных отделов поджелудочной железы, регистрировали количество клеток в каждом островке и содержание гормона в каждой клетке (в условных микроединицах — мкЕ). Концентрацию инсулина в сыворотке крови определяли радиоиммунным методом с помощью набора РИО-ИНС- ПГ-¹²⁵1 (ИБОХ АН Республики Беларусь). Концентрацию глюкозы в крови определяли глюкозо- оксидазным методом с помощью набора ’’ДИАКОМ Глюкоза ГО” (ДИАКОМ-СИНТЭКО, Россия). При статистической оценке экспериментальных данных и определении достоверности различий в группах использовали /-критерий Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Развитие стрептозотоцинового сахарного диабета на протяжении 5 нед приводило к деструкции р-клеток, достоверному снижению их количества в островах Лангерганса и уменьшению содержания в них инсулина, а также увеличению количества ос-клеток без изменения содеражния в них глюкагона (см. таблицу). При этом в периферической крови отмечалось закономерное снижение концентрации инсулина и развитие гипергликемии.

Хроническое интрацеребровентрикулярное введение 0,9% NaCl интактным и диабетическим крысам не влияло на изменение основных показателей функционального состояния р- и ос-клеток, концентрацию инсулина и глюкозы в крови у этих животных (р > 0,05). В то же время хроническое введение вазопрессина экспериментальным животным оказывало выраженное влияние на состояние синтеза и секреции инсулина р-клетками поджелудочной железы. Так, интрацеребровентрикулярное введение вазопрессина нормальным животным приводило к достоверному увеличению содержания инсулина в р-клетках, снижению содержания глюкагона в ос-клетках и уменьшению концентрации глюкозы в крови. При этом концентрация инсулина в периферической крови и среднее количество функционирующих клеток в островках не изменялись.

Аналогичные эффекты наблюдали и при хроническом введении вазопрессина диабетическим животным: содержание инсулина в р-клетках возрастало, достоверно превышая значение в контроле, а содержание глюкагона в ос-клетках достоверно уменьшалось. По сравнению с контрольной группой диабетических крыс введение вазопрессина повышало концентрацию инсулина в крови (р < 0,001) и снижало уровень гликемии (р < 0,0001). Характерно, что введение вазопрессина не влияло на процессы деструкции р-клеток при диабете и не приводило к изменению их среднего количества в островках Лангерганса. Вместе с тем количество ос-клеток в островках уменьшалось и в случае центрального введения вазопрессина не отличалось от данного показателя в группе интактных животных.

Обращают на себя внимание более выраженный эффект стимуляции синтеза инсулина в р- клетках в условиях диабетической гипергликемии по сравнению с нормогликемическими животными (р < 0,0001), а также то обстоятельство, что повышение содержания инсулина в р-клетках при хроническом интрацеребровентрикулярном

Концентрация глюкозы и инсулина в крови, количество р-клеток в островках Лангерганса и содержание в них инсулина у интактных и диабетических крыс при хроническом введении [Arg⁸]-вазопрессина (М ± т)

Группа животных

Концентрация глюкозы в крови, ммоль/л

Количество р-клеток в островках

Содержание инсулина в р-клетках, мкЕ

Концентрация инсулина в крови, пмоль/л

Количество а-клеток в островках

Содержание глюкагона в а-клетках, мкЕ

Интактные крысы

Нормальные крысы с интрацеребро- вентрикулярным введением 0,9% NaCl Нормальные крысы с интрацеребровен- трикулярным введением вазопрессина Диабетические крысы

Диабетические крысы с интрацеребро- вентрикулярным введением 0,9% NaCl 8,52 ± 0,47**

Диабетические крысы с интрацеребро- вентрикулярным введением вазопрессина 4,95 ± 0,34**

Диабетические крысы с интраперитонеальным введением вазопрессина 5,30 ± 0,39**

3,59 ± 0,06

3,64 ± 0,07

3,37 ± 0,06*

8,49 ± 0,41**

15,9 ± 1,2

16,6 ± 0,9

• ± 0,5
• ± 1,5***

22,8 ± 1,3***

• ± 0,9

20,0 ± 1,2*

• ± 12,5
• ± 15,3
• ± 13,0***
• ± 17,8

3137,3 ± 16,8

2587,2 ± 16,4***

± 19,6*** Примечание. Звездочки — достоверность различий с группой интактных животных: одна — при р < 0,05; две — при р < 0,001; три — при р < 0,0001. введении вазопрессина было более значимым, чем при интраперитонеальном ведении (р < 0,0001).

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о стимулирующем влиянии хронического введения [Arg⁸]-вазопрессина на синтез инсулина в р-клетках как в условиях гипергликемии при диабете, так и у нормогликемических контрольных крыс. Однако более выраженная интенсивность синтеза инсулина при введении вазопрессина диабетическим животным свидетельствует о глюкозозависимом характере инсулинстимулирующего действия данного нейропептида. Стимулирующее влияние вазопрессина на секрецию инсулина р-клетками проявлялось только в условиях гипергликемии при диабете, что согласуется с ранее проведенными исследованиями на изолированной поджелудочной железе [12] и в культуре р-клеток [13]. Несмотря на имеющиеся данные о возможности глюкозонезависимой стимуляции секреции инсулина вазопрессином in vitro [21], в наших исследованиях in vivo мы не зарегистрировали повышения концентрации инсулина в крови у контрольных нормогликемических крыс. Возможно, что в этих условиях усиление секреции инсулина под влиянием введения вазопрессина носит транзиторный характер.

Анализируя возможные механизмы инсулинстимулирующего эффекта вазопрессина при его хроническом введении, следует обратить внимание на то, что развитие сахарного диабета у крыс сопровождается увеличением морфофункциональной активности вазопрессинергических нейронов паравентрикулярного и супраоптического ядер гипоталамуса [3], повышением в них синтеза вазопрессина [11] и увеличением его концентрации в периферической крови [3, 5, 9]. В этих условиях возможна реализация центральных и периферических эффектов вазопрессина. Наличие эфферентных проекций от мелкоклеточных вазопрессинергических нейронов паравентрикулярного ядра к вентромедиальному ядру гипоталамуса [23] и к дорсальному моторному ядру блуждающего нерва [1] обеспечивает проявление нейротрансмиттерных и нейромодуляторных эффектов вазопрессина в центральной нервной системе. Известно, что вазопрессининдуцируемая модуляция гипоталамических центров пищевой мотивации может давать анорексический эффект [18] и приводить к повышению функциональной активности дорсального моторного ядра блуждающего нерва [10, 18], который оказывает прямое стимулирующее влияние на синтез и секрецию инсулина в поджелудочной железе [1, 10, 22]. Возможно, что инсулинстимулирующий эффект вазопрессина при его хроническом введении в желудочки мозга опосредован нейрогенными механизмами регуляции функции р-клеток со стороны симпатического (вентромедиальное ядро гипоталамуса) и парасимпатического (дорсальное моторное ядро блуждающего нерва) центров.

Реализация периферических эффектов вазопрессина связана с тем, что основные проекции крупноклеточных вазопрессинсинтезирующих нейронов паравентрикулярного и супраоптического ядер направляются в нейрогипофиз [23]. Поэтому гиперфункция нейросекреторных клеток этих образований при сахарном диабете приводит к повышению концентрации вазопрессина в периферической крови у диабетических животных [3, 5, 9] и больных сахарным диабетом [15]. Метаболические эффекты вазопрессина хорошо изучены [6] и проявляются усилением гликогенолиза, глюконеогенеза и ослаблением кетогенеза в печени. Наряду с этим следует учесть способность вазопрессина взаимодействовать с Vlb-рецептора- ми кортикотропов [16] и активировать гипофизарно-адренокортикальную ось [7], что приводит к усилению секреции АКТГ и, следовательно, глюкокортикоидов. Взаимодействуя с Vla-рецеп- торами клеток коры надпочечников, вазопрессин способен самостоятельно стимулировать секрецию глюкокортикоидов [14]. Вероятно, в результате описанных механизмов при диабете концентрация кортикостероидов в крови увеличивается [5]. Очевидно, что характер подобных эффектов имеет гипергликемическую направленность и, с точки зрения углеводного гомеостаза, оправдан в условиях гипогликемической стимуляции синтеза [19] и секреции вазопрессина [8]. Вместе с тем полученные нами данные свидетельствуют о том, что хроническое периферическое введение вазопрессина диабетическим животным, напротив, снижает уровень гликемии за счет увеличения синтеза инсулина р-клетками и повышения его концентрации в крови. Механизм подобного явления, по-видимому, заключается в стимуляции вазопрессином Vlb-рецепторов р-клеток, что приводит к повышению секреции инсулина [13, 17]. Возможно, данный эффект более выражен в условиях гипергликемии и в меньшей степени проявляется при нормогликемии [12, 13, 21]. Следовательно, активация вазопрессинергической нейросекреторной системы гипоталамуса при сахарном диабете может иметь компенсаторное значение и направлена на стимуляцию синтеза и секреции инсулина.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что центральные и периферические эффекты вазопрессина при его хроническом введении способствуют снижению уровня гликемии при диабете и нормализации углеводного гомеостаза.

Выводы

1. Хроническое центральное и периферическое введение [А1^⁸]-вазопрессина нормальным крысам приводит к усилению синтеза инсулина в Р-клетках поджелудочной железы, но не влияет на уровень инсулина в крови.
2. Хроническое центральное и периферическое введение [Arg⁸]-вазопрессина крысам с сахарным диабетом стимулирует синтез инсулина в р-клетках, повышает концентрацию инсулина в крови, снижает уровень гликемии, но не влияет на процессы деструкции р-клеток.
3. Эффекты хронического центрального введения [Arg⁸]-вазопрессина выражены в большей степени, чем при его хроническом периферическом введении.