О возможном участии фосфатидилинозитол-з -киназы в активации инсулином и эпидермальным фактором роста фосфолипазы с, гидролизующей гликозилфосфатидилинозитол

Инсулин является одним из наиболее важных гормонов, регулирующих в тканях млекопитающих процессы внутриклеточного метаболизма, клеточного роста и дифференцировки [9, 32, 34]. Метаболические эффекты инсулина связаны с увеличением транспорта глюкозы через плазматическую мембрану, накоплением углеводов, липидов и белков в адипоцитах и мышцах, снижением скорости глюконеогенеза и гликогенолиза, ускорением гликолиза и синтеза гликогена в печени [32]. Гидролиз мембранных инозитолсодержащих гликофосфолипидов под действием фосфолипазы С, специфичной в отношении гликозилфосфатидилинозитола (ГФИ-ФЛС), является неотъемлемой частью инсулиновой сигнализации [23, 24]. По субстратной специфичности эта фосфолипаза отличается от фосфолипаз Ср и Су, активируемых гормонами и факторами роста [5, 6, 28]. ГФИ-ФЛС гидролизует мембранные гликофосфолипиды с образованием диацилглицерина, активирующего протеинкиназу С, и инозитолфосфогликана. Предполагается, что инозитолфосфогли- кан выполняет функции вторичного посредника инсулина [14, 27], влияет на уровень цАМФ, регулирует активность фосфодиэстеразы, цАМФ-за- висимой протеинкиназы, пируватдегидрогеназы, ключевых ферментов глюконеогенеза и некоторых других ферментов углеводного обмена [23, 25]. Об-

¹ Выражаем благодарность М. Ю. Меньшикову за участие в обсуждении результатов и помощь в подготовке этой статьи.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Соро- совской образовательной программы грантом А-98-1739 аспиранту А. В. Кривцову и грантом РФФИ 96-04-50714. разование инозитолфосфогликана положительно коррелирует с дефосфорилированием белков по серин-треониновым остаткам [12, 15, 20, 24, 26].

Связывание инсулина рецептором стимулирует его тирозинкиназную активность, что приводит к аутофосфорилированию рецептора и фосфорилированию внутриклеточных субстратов She, ИРС-1 и ИРС-2 [1, 30, 31]. Основным субстратом инсулинового рецептора является ИРС-1 [33]. Фосфорилированный ИРС-1 выполняет функции адаптера и взаимодействует с другими сигнальными белками, содержащими 5Н2-домены (Src Homology 2) — SHP-2, Nek, Grb, фосфатидилинози- тол-3-киназой (ФИ₃-киназой) и др. [33]. ФИ₃-ки- наза представляет собой гетеродимер, состоящий из регуляторной (р85) и каталитической (рНО) субъединиц. Взаимодействие ИРС-1 с р85 вызывает активацию каталитической субъединицы киназы [18, 21]. Точная роль ФИ₃-киназы в передаче метаболического сигнала инсулина до сих пор точно не установлена. Существуют данные о том, что фосфорилирование ИРС-1 и последующая активация ФИ₃-киназы связаны со стимуляцией транспорта глюкозы [3, 10, 19]. Показано, что активация ФИ₃-киназы инсулином вызывает транслокацию ГТ₄ в плазматическую мембрану [8]. Об участии ФИ₃-киназы в транспортных процессах может свидетельствовать и тот факт, что ее каталитическая субъединица гомологична дрожжевому белку Vps34p, который обладает ФИ₃-киназ- ной активностью и участвует в везикулярном транспорте белков [7].

Подавление каталитической активности ФИ₃-ки- назы специфическим ингибитором вортманни- ном [22] приводит к снижению синтеза гликогена. Эти данные свидетельствуют об участии ФИ₃-ки- назы в передаче инсулинового сигнала на глико- генсинтазу. В то же время активация ФИ₃-киназы в Ьб-миоцитах такими агентами, как интерлейкин-4 и фактор роста из тромбоцитов (ТФР), не приводит к транслокации ГТ₄ в мембрану [7]. В 3T3-L1-адипоцитах действие ТФР на транспорт глюкозы, синтез липидов и гликогена выражено значительно слабее, чем действие инсулина [35]. Это свидетельствует о том, что для реализации метаболических эффектов инсулина, по-видимому, необходимо включение специфических компонентов инсулиновой сигнализации. Одним из таких компонентов может служить инозитолфос- фогликан, который влияет на активность глико- генсинтазы [15].

Образование инозитолфосфогликана стимулируют также факторы роста [4], поэтому в этой работе мы сравнивали действие эпидермального фактора роста (ЭФР) с действием инсулина на активность ГФИ-ФЛС. Полученные данные позволяют предположить, что в проведении сигнала от рецептора инсулина и ЭФР на ГФИ-ФЛС участвует ФИ₃-киназа, цитоплазматический фермент, который фосфорилирует фосфоинозитиды и некоторые белки, тем самым изменяя их активность [13, 29].

Материалы и методы

Культивирование клеток. Клетки Rati культивировали в 6% СО₂-инкубаторе в среде DMEM с добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина. Клетки пассировали, обрабатывая 0,25% раствором трипсина и 1 мМ ЭДТА в PBS. Количество клеток подсчитывали с помощью цито-счетчика "Coulter". Перед стимуляцией клетки инкубировали 10—18 ч в среде DM ЕМ без FCS с добавлением 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина. Плотность клеток перед стимуляцией составляла 80—90%.

Мечение клеток и выделение гликозилфосфати- дилинозитола (ГФИ). Клетки Rati метаболически метили [6-³Н]-гликозамином (5 мкКи/мл) в течение 24 ч в чашках Петри диаметром 82 мм в среде DM ЕМ. Перед стимуляцией лигандами клетки выдерживали без сыворотки 2 ч, после чего стимулировали инсулином (10^-8 М) и ЭФР (10“⁹ М). По окончании инкубации чашки Петри с клетками переносили на лед, среду культивирования удаляли и клетки фиксировали в 1 мл 10% ТХУ, соскабливали с чашек и собирали в центрифужные микропробирки вместимостью 1,7 мл, после чего чашки промывали еще раз с 0,5 мл 10% ТХУ и растворы объединяли. Клетки в ТХУ оставляли при комнатной температуре на 15 мин, затем центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. Осадок экстрагировали в 0,5 мл смеси хлороформ— метанол—НС1 (0,05 н.) в соотношении 1:2 в течение 15 мин, экстракцию повторяли в 0,25 мл смеси, затем экстракты объединяли и в пробирку добавляли 0,25 мл хлороформа и 0,25 мл 0,1 М КС1.

После сильного встряхивания фазы разделяли центрифугированием при 10 000 g в течение 5 мин, водную фазу отбирали и промывали в 0,25 мл хлороформа, после чего фазы разделяли и органические экстракты объединяли, промывали в 0,25 мл 0,1 М КС1 в 50% метаноле, после 30-минутной инкубации при —20°С фазы разделяли центрифугированием, органическую фазу упаривали в вакуумной сушке. Сухое вещество перерас- творяли в 50 мкл смеси хлороформ—метанол (2:1) и образец наносили на пластину для тонкослойной хроматографии (Silicia Gel 60; фирма "Merck").

Хроматографию проводили дважды в системе хлороформ—метанол—ацетон—уксусная кислота-вода (10:4:2:2:1) до прохождения фронтом 18 см. В качестве стандартов использовали нейтральные липиды, фосфатидилинозитол, фосфати- дилхолин. После окончания хроматографии пятно ГФИ вырезали и элюировали метанолом в течение 2 ч, затем раствор упаривали, сухое вещество пере- растворяли в 50 мкл смеси хлороформ—метанол (2:1) и проводили вторую хроматографию в системе хлороформ—метанол—NH₄OH—вода (45:45:4:10), в качестве стандартов использовали фосфатидную кислоту, фосфатидилинозитолфосфат, фос- фатидилхолин, фосфатидилинозитол и нейтральные липиды. После прохождения фронтом растворителя 18 см хроматографию прекращали, пластину высушивали, область с R_f 0,5—0,56 [4] вырезали и количество включенного [³Н]-гликоза- мина измеряли в сцинтилляционном счетчике.

Обработка клеток вортманнином, конканавали- ном А и гентамицином. Клетки обрабатывали вортманнином (50 нМ), конканавалином А (10 мкг/мл) или гентамицином (50 мкМ) в течение 30 мин перед стимуляцией факторами роста в культуральной среде без сыворотки.

Материалы. В работе использовали: [6-³Н]-гли- козамин (фирма "Amersham"), вортманнин (фирма "Sigma"), конканавалин А (фирма "Sigma"), гентамицин (фирма "Flow Laboratories"), FCS, DMEM, пенициллин и стрептомицин (фирма "Gibco BRL"), инсулин (фирма "Eli Lilly & Со."), EGF (фирма "Toyobo Corp."). Остальные реактивы получены от фирм "Sigma", "Fluka" и "Merck".

Результаты и их обсуждение

Для изучения реакции расщепления ГФИ клетки Rati (2- 10⁶) метаболически метили [6-³Н]-гли- козамином, который включается в ГФИ [24]. После стимуляции факторами роста из клеток экстрагировали фракцию заряженных липидов, из которой с помощью двух последовательных тонкослойных хроматографий (сначала в кислых, а затем в щелочных условиях) выделяли фракцию ГФИ, количество которого определяли по [³Н]-радиоак- тивности образцов. На рис. 1 показано изменение количества выделяемого ГФИ при стимуляции клеток Rati ЭФР и инсулином. Через 30 мин после начала стимуляции клеток ЭФР количество ГФИ в мембране сокращалось на 40% (р < 0,001), тогда как стимуляция клеток инсулином вызывала меньший (до 20%) гидролиз ГФИ (р < 0,001). В отличие от других исследователей

Рис. 1. Временная зависимость гидролиза ГФИ при действии факторов роста.

Рис. 3. Ингибирование вортманнином активации ГФИ-ФЛС инсулином и ЭФР.

Клетки Rati (2 • 10⁶) преинкубировали с вортманнином 30 мин, после чего их стимулировали инсулином (10 нМ) или ФЭР (1 нМ) 30 мин. 1 — уровень ГФИ в отсутствие обработки клеток вортманнином, инсулином и ЭФР; 2— инсулин; 3 — ЭФР. По оси абсцисс — концентрация вортманнина (в нМ).

Клетки Rati (2- 10⁶) метаболически метили |6-³-Н|-глюкозамином 24 ч, инкубировали без сыворотки 2 ч, после чего стимулировали в течение указанного времени инсулином (10 нМ) и ЭФР (1 нМ). Здесь и на рис. 2, 3 по осям ординат — уровень ГФИ в клетке (в имп/мин). По оси абсцисс — время (в мин). Здесь и на рис. 2: / — без обработки; 2 — инсулин; 3 — ЭФР. [2, 4, 24], которые наблюдали влияние факторов роста на образование инозитолфосфогликана уже через 30 с, в наших экспериментах детектируемый гидролиз ГФИ начинался после 5-минутной стимуляции клеток. ЭФР стимулировал гидролиз ГФИ в значительно большей степени, чем инсулин, по-видимому, благодаря большей экспрессии рецептора ЭФР на поверхности клеток Rati, чем инсулинового рецептора [И]. В пользу того, что гидролиз ГФИ осуществляется фосфолипазой С, специфичной в отношении ГФИ [26], свидетельствуют данные двух независимых экспериментов, из которых видно (рис. 2), что этот процесс чувствителен к ингибитору ГФИ-ФЛС конканавали- ну А [16] и активатору ГФИ-ФЛС гентамицину [17]. При добавлении конканавалина А к клеткам Rati за 30 мин до стимуляции факторами роста гидролиз ГФИ практически полностью подавлялся, при 30-минутной обработке клеток гентамицином наблюдалось снижение количества выделяемого ГФИ на 31%, одновременная 30-минут- ная стимуляция клеток ЭФР и обработка гентамицином вызывали снижение количества ГФИ на 56%, а инсулином и гентамицином — на 37% (р < 0,001).

Известно, что активация инсулинового рецептора и рецептора ЭФР приводит к активации ФИ₃-киназы, которая играет ключевую роль в активации многочисленных внутриклеточных фермента-

Рис. 2. Чувствительность гидролиза ГФИ к действию гентамицина и конканавалина А.

Клетки Rati (2- 10⁶) преинкубировали 30 мин с конканавалином А (10 мкг/мл) или гентамицином (50 мкМ), а затем стимулировали 30 мин инсулином (10 нМ) или ЭФР (1 нМ). а — контроль; б — конканавалин А; в — гентамицин. тивных систем [13, 29]. Для выяснения возможной роли ФИ₃-киназы в активации ГФИ-ФЛС перед стимуляцией клеток инсулином и ЭФР мы преинкубировали клетки в течение 30 мин с вортманнином, специфическим ингибитором ФИ₃-киназы. Как видно на рис. 3, вортманнин подавляет активацию ГФИ-ФЛС инсулином и ЭФР, причем до- зовые зависимости ингибирования ФИ₃-киназы и гидролиза ГФИ совпадали (10—50 нМ), что свидетельствует о возможном участии ФИ₃-кина- зы в процессе передачи сигнала от рецепторов инсулина на ГФИ-ФЛС.

Выводы

1. В клетках Rati инсулин и ЭФР стимулируют гидролиз ГФИ.
2. Ингибиторный и активаторный анализ свидетельствует о том, что данные эффекты инсулина и ЭФР опосредуются ГФИ-ФЛС.
3. Влияние инсулина и ЭФР на гидролиз ГФИ подавлялось вортманнином в диапазоне концентраций 10—50 нМ, при которых он ингибирует ФИ₃-киназу, что указывает на возможное участие этого фермента в передаче регуляторного сигнала от рецепторов инсулина и ЭФР на ГФИ-ФЛС.