Влияние мерказолила и тиреопаратиреоидэктомии на свойства Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума скелетной мышцы

Нарушение тиреоидной функции занимает одно из ведущих мест среди эндокринных заболеваний [4]. Существенное влияние на клиническое проявление тиреоидной патологии оказывают кальцитропные гормоны [7,12]. Кальцитонин

(КТ) и паратгормон не только дают кальцийрегулирующий эффект, но и модифицируют реактивность тиреоцитов, воздействуя на различные метаболические процессы [8].

С другой стороны, нарушение функции щитовидной железы (ЩЖ) приводит к изменению гормональной регуляции обмена кальция на уровне как периферических тканей, так и внутриклеточных образований [1, 5—7, 9].

Известно, что содержание ионизированного кальция внутри клетки находится в пределах 10^-7—10“⁸ М, тогда как во внеклеточной среде и крови уровень его составляет 10"³ М [18]. Низкий уровень внутриклеточного кальция поддерживается сложной системой регуляции, включающей специфические ионные каналы плазматической мембраны клетки и внутриклеточных образований, где саркоплазматическому (эндоплазматическому) ретикулуму (СР) отводится важнейшая роль в пусковом механизме секвестрации ионов кальция в цитозоль с последующим развитием физиологического действия [2, И].

Са²⁺-ДТФаза (КФ 3.6.1.38) в этом процессе является важнейшим элементом. Активность этого фермента регулируется сложной системой, включающей как внеклеточные, так и внутриклеточные элементы. Среди них гормональная регуляция обмена кальция является важнейшим фактором поддержания метаболизма иона как в физиологических условиях, так и при развитии различных патологических состояний [16].

Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования было выяснение влияния гипофункции ЩЖ, вызванной мерказолилом, или тиреопаратиреоидэктомии (ТПТЭ) на уровень КТ и тироксина (Т₄) в сыворотке крови и изучение структурно-функциональных свойств Са²⁺-АТФазы СР скелетной мышцы в этих условиях.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах-самцах стадного разведения массой тела 140—180 г. Материал брали через 3, 10 и 30 сут после ТПТЭ либо гипофункции ЩЖ, вызванной мерказолилом (см. ниже).

Препараты мембран СР получали из бедренной мышцы по Д. С. Боневоленскому [3]. С этой целью предварительно выделенную ткань измельчали механически на льду и затем гомогенизировали в буфере: 0,3 М сахарозы, 5 мМ азида натрия и 10 мМ гистидина при отношении сырой массы к объему среды 1:4 при pH 7,0. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 4300 g. Осадок выбрасывали, а супернатант центрифугировали повторно в тех же условиях. Надосадочную жидкость центрифугировали 30 мин при 48 300 g. Осадок суспендировали в среде, содержащей 0,6 М КС1, 0,3 М сахарозы и 10 мМ гистидина (pH 7,0), и затем вновь центрифугировали 30 мин при 48 300 g. Получившийся осадок суспендировали в среде 0,3 М сахарозы и 10 мМ гистидина (pH 7,0) и помещали для хранения в жидкий азот. Выход белка при этих условиях составлял до 3 мг/мл.

При дальнейшей работе с мембранами белок количественно определяли по Лоури с 1% дезоксихолатом натрия [17]. Чистоту выделенного СР определяли по активности маркерных ферментов: сукцинатдегидрогеназы, Са²⁺-АТФазы и 5-нуклеотидазы.

Концентрацию ионизированных магния и кальция в ЭГТА-буфере рассчитывали с помощью компьютерной программы по Робертсону [19].

Определение активности Са²⁺-АТФазы. Для исследования кинетических параметров фермента готовили буферную смесь, содержащую 50 мМ имидазола, 100 мМ КС1, 3,5 мМ MgCl, 20 мМ ЭГТА. 2 мМ оксалата натрия (калия) и 4 мМ АТФ-Na-coли, а также ряд возрастающей концентрации Са: 0, 0,3, 0,8, 1,58, 3,16, 6,31 и 10 мкМ при pH 7,1. К буферной смеси добавляли 0,1 мл раствора везикул СР. Инкубацию проводили при 37°С в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 1 мл холодной 1,5% трихлоруксусной кислоты. Наработанный неорганический фосфор определяли методом Боданского при 680 нм. Кинетические параметры фермента — скорость реакции (И_тах) и константу активности (К_а) — рассчитывали согласно [20].

Исследование термодинамических свойств Са²⁺-АТФазы. Готовили ряд пробирок (каждую пробу в дублях) с инкубационной смесью, как описано выше. Инкубацию проводили в бане в диапазоне температур от 10 до 44°С. Остановку реакции и последующие стадии проводили, как описано выше. Полученные результаты выражали в координатах Аррениуса (lg>4 от 1/Г). Определяли также точку излома на кривой температурной зависимости с расчетом энергии активации:

2,303 7?(lg/4_r lg/4-г ) £ = 12   _L

^а              \/1\-\/Т₂

где Е_а — кажущаяся энергия активации; А — удельная активность фермента при температурах Т\ и Т₂; R — универсальная газовая постоянная.

Определяли отдельно Е_а для прямой, лежащей ниже 1-го излома, срединной прямой и отрезка выше 2-го излома.

Кинетические характеристики и энергию активации Са²⁺-АТФазы рассчитывали с помощью компьютерных программ [10].

Тиреопаратиреоидэктомия. Операцию выполняли под общим наркозом (1,5 г/кг у-оксибутирата натрия). Животное закрепляли на препаративном столе. После операции очищали от волосяного покрова и смазывали 5% раствором настойки йода, послойно рассекали кожу, подкожную клетчатку и фасцию грудинощитовидной мышцы. Саму мышцу расслаивали тупым путем с использованием концов ножниц. Рану длиной 3,5—4 см расширяли специально сделанными держателями, разводя мышцы в разные стороны. Открывалась область ЩЖ с хорошо контурируемым перешейком и ЩЖ. Операцию по удалению комплекса ЩЖ — околощитовидные железы начинали с перевязки нижней тиреоидной артерии и ее пересечения. Затем перевязывали верхнюю a.thyroidea. Последний этап операции — иссечение с последующим вылущиванием тиреоидно-паратиреоидного комплекса сначала с одной стороны, а затем (в той же последовательности) — с другой. Рану ушивали послойно. Шов на коже обрабатывали йодом и присыпали стрептоцидом.

Во избежание гипокальциемической тетании после операции животному вводили по 0,5 мл на 100 г массы 5% раствора СаС1₂.

В последующем оперированных животных содержали в обычных условиях вивария с обеспечением их водой с содержанием в ней СаС1₂ в количестве 0,1 %.

Гипотиреоз, вызванный введением мерказолила. Мерказолил (1 -метил-2-меркантоимидазол) животные получали per os в количестве 10 мг на 1 кг массы тела. Экспериментально установлено, что через 3 нед после применения препарата у крыс развивался гипотиреоз.

Результаты и их обсуждение

Как следует из табл. 1, воздействие гипофункции ЩЖ, вызванной введением мерказолила (10 мг/кг), либо удаление ЩЖ приводят к изменению каталитических и термодинамических (табл. 2) свойств Са²⁺-АТФазы СР скелетной мышцы. При этом под влиянием мерказолила через 3 сут от начала опыта происходит резкое повышение скорости ферментативной реакции (И_тах) Д° 168% по отношению к контролю. К_а в этот период хотя и имеет тенденцию к возрастанию, но статистически достоверных значений не достигает. Через 10 сут не установлено достоверных изменений кинетических параметров Са²⁺-АТФазы СР скелетной мышцы. Однако к концу опыта (через 30 сут) отмечено резкое снижение К_а у подопытных животных (22%) по сравнению с таковой у контрольных крыс. И_тах в этот период не претерпевает существенных изменений.

ТПТЭ также приводит к изменению ряда изучаемых показателей. Как видно из табл. 1, через 3 сут после операции имеет место резкое снижение активности фермента (45% от контроля), тогда как К_а имеет лишь тенденцию к снижению. К 10-м суткам после операции не выявлено изменения кинетических характеристик Са²⁺-АТФазы. Однако к 30-м суткам после удаления щитовиднопаращитовидного комплекса отмечается значительное снижение К_а (27% от уровня контроля).

На ранней стадии наблюдения (3-и сутки) имеет место разнонаправленность действия мерказолила и ТПТЭ на скорость ферментативной реакции, что, вероятно, связано с различной степенью нарушения гормональной регуляции внутриклеточного обмена кальция. Об этом может свидетельствовать значительное изменение гормонального фона при изучаемых воздействиях. Мерказолил угнетает тироксинсинтезирующий аппарат, блокируя ферментную систему, участвующую в окислении йодидов в йод. В данном случае препарат снижает содержание в крови Т₄ до 49%

Таблица 1

Влияние мерказолила и ТПТЭ на каталитические свойства Са²⁺-АТФазы СР скелетной мышцы крысы (М ± /и; п = 6)

Примечание. 1-й ряд цифр — К_а, 2-й — И_1Пах. Здесь и в табл. 2: звездочка — статистически достоверные изменения (р < 0,05).

Таблица 2

Состояние термодинамических параметров Са²⁺-АТФазы СР скелетной мышцы крысы после воздействия мерказолила либо ТПТЭ (М ± т; п = 6)

Показатель

Контроль

Мерказолил

ТПТЭ

ккал/м оль:

ниже 1-го излома 0,05 ±

выше 1-го излома 0,67 ±

выше 2-го излома 4,29 ± Точка 1-го излома, °C 22,0 ± Точка 2-го излома, °C 40,0 ±

0,01 0,04 ± 0,007 0,05 ± 0,01

0,12 2,33 ± 0,21* 0,57 ± 0,09

0,07 7,19 ± 0,09* 7,69 ± 0,36*

0,51 20,0 ± 0,08* 20,0 ± 0,32

0,62 27,0 ± 0,08* 38,0 ± 0,71

Примечание. Е_а рассчитана через 10 сут после воздействия.

от уровня контроля. Однако и кальцитонинпродуцирующая функция С-клеток ЩЖ также снижена, и уровень КТ составляет лишь 47% от контрольного (рис. 1). Очевидно, здесь имеет место взаимодействие метаболизма тиреоидных и кальцийрегулирующих гормонов [4, 5, 7, 12]. При этом гипофункция вследствие применения мерказолила вызывает резкое увеличение скорости ферментативной реакции, а ТПТЭ, наоборот, значительно снижает К_тах, что, вероятно, связано со степенью нарушения синтеза и метаболизма Т₄, КТ и, очевидно, других гормонов, приводящего к разбалансированности гормональной регуляции внутриклеточного обмена кальция [16]. В обоих случаях в конце эксперимента наблюдается статистически достоверное снижение К_а, что свидетельствует о повышении сродства фермента к субстрату, которое обусловлено изменением каталитического процесса на этапах дефосфорилирования АТФ при энергообеспечении функционирования кальциевого насоса мембран СР скелетной мышцы.

Результаты проведенных термодинамических исследований Са²⁺-АТФазы свидетельствуют о том, что кривая зависимости активности фермента мембран СР, анализируемая в координатах Аррениуса (рис. 2), имеет 2 излома: в области 22 и 40°С у контрольных животных (а). Первый излом характерен для событий, происходящих в липидной фазе мембран СР, и связан с реорганизацией метильных групп в липид-алкильной области, результатом чего является формирование липидных квазикристаллических кластеров в мембранном

Рис. 1. Влияние мерказолила или ТПТЭ на содержание КТ (а) и Т₄ (б) в сыворотке крови крыс (содержание Т₄ определено И. И. Крыловой).

М — мерказолил; * — статистически достоверные изменения (р < 0,05), 7, 5 — сутки.

 Рис. 2. Кривые зависимости в координатах Аррениуса активности Са²⁺-АТФазы СР скелетной мышцы контрольной группы крыс (а), получавших мерказолил (б) или после ТПТЭ (в).

По оси ординат — логарифм активности Са²⁺-АТФазы (в мкмоль Рн/мгмин^-1); по оси абсцисс — величина, обратная температуре (К^-1). ’’жидком" бислое [15, 22]. Излом на кривой, имеющий место при температуре 40°С, является результатом температурно-зависимых конформационных изменений третичной структуры белка и последующего нарушения липид-белковых взаимоотношений [14].

Под влиянием мерказолила (6) 1-й излом наблюдается при температуре 20°С. Энергия активации (£J начального отрезка кривой зависимости активности Са²⁺-АТФазы не отличается от таковой у контрольных животных. Однако расчет Е_а 2-го отрезка выше 1-го излома кривой выявил резкое возрастание показателя (348% от контроля); 2-й излом на кривой имеет место при температуре 27°С, т. е. изменение белковой фазы мембран происходит значительно раньше контрольных значений. Е_а 3-го отрезка (выше 2-го излома) резко снижена и составляет лишь 28% от такового у контрольных животных. В целом Е_а претерпевает существенные колебания в зависимости от температуры, и суммарное ее значение составляет 71% от контроля. Следовательно, в результате действия мерказолила происходит изменение как липидной, так и белковой фазы мембран с последующим нарушением их взаимоотношений с изменением кинетических и термодинамических свойств Са²⁺-АТФазы СР скелетных мышц.

После операции удаления тиреоид-паратиреоидного комплекса не выявлено изменения Е_а (в) до и после 1-го излома; 1-й излом происходит при 20°С, 2-й — при 38°С. Однако после 2-го излома отмечено резкое увеличение Е_а (179% от контроля). Очевидно, события развертываются в белковой фазе мембран и приводят в конечном итоге к изменению кинетических и термодинамических характеристик Са^2_ь-АТФазы. В целом суммарная Е_а составляет 166% от таковой у контрольных животных.

Исходя из полученных данных, следует, что по мере увеличения температуры реакции в препаратах мембран СР скелетных мышц оперированных и получавших мерказолил животных происходит изменение структурно-функциональных характеристик мембран. При этом подвержены влиянию как липидная, так и белковая составляющие "жидкого" бислоя. Поскольку формирование квазикристалл ических доменов наблюдается при температуре до 30°С, то можно полагать, что активность Са²⁺-АТФазы регулируется липидным микроокружением фермента, и 1-й излом кривой Аррениуса и Е_а выше излома обусловлены фазовыми переходами мембранных липидов [13, 15]; 2-й излом кривой Аррениуса, очевидно, обусловлен изменением белковой фазы мембран и влияет на белково-липидные взаимоотношения и функцию мембран. Вероятно, на этот процесс существенное влияние оказывает нарушение гормональной регуляции внутриклеточного обмена кальция, связанное с изменением тиреоид-паратиреоидной функции [13, 21]. Различия в реакции мембран СР и кинетических и термодинамических свойств Са²⁺-АТФазы при введении мерказолила и ТПТЭ связаны, вероятно, с различной степенью поражения гормональных механизмов регуляции обмена кальция и, возможно, обусловлены модификацией специфического фосфолипидного микроокружения фермента. Для выяснения этих процессов необходимы дальнейшие исследования.

Выводы

1. Мерказолил (10 мг/кг), вызывая гипофункцию ЩЖ, приводит к снижению содержания в сыворотке Т₄, КТ и нарушает кинетические и термодинамические свойства Са²⁺-АТФазы СР скелетной мышцы крысы, снижая энергию активации фермента.
2. ТПТЭ резко повышает энергию активации Са²⁺-АТФазы и приводит к нарушению кинетических параметров фермента: снижение И_тах на 3-и и К_а на 30-е сутки.
3. Выявленные изменения кинетических и термодинамических свойств Са²⁺-АТФазы под влиянием гипофункции ЩЖ и после ТПТЭ могут свидетельствовать о влиянии тиреоидных и кальцитропных гормонов на функционально-структурную организацию мембран СР скелетной мышцы.