Полиморфизм микросателлитных маркеров генов альдозоредуктазы и каталазы и генетическая предрасположенность к нефропатии при инсулинзависимом сахарном диабете

Гипергликемия при сахарном диабете является одной из главных причин многочисленных метаболических нарушений, накопление которых приводит к развитию диабетической нефропатии (ДН) и других тяжелых сосудистых осложнений. Клетки эндотелия микрососудов, включая капилляры фильтрующего аппарата почек, являются одними из первичных мишеней пагубного влияния повышенных концентраций глюкозы (глюкозотоксичности). В условиях гипергликемии происходит неферментативное гликозилирование белков [5], носящее необратимый характер и сопряженное с перекисным окислением глюкозы, липидов и гликозилированных белков [12, 16, 21, 38, 39], включая коллаген сосудистой стенки [8, 37]. Это приводит организм в состояние окислительного стресса, выражающегося в повышении уровня крайне реакционноспособных свободных радикалов, нарушении баланса окислительно-восстановительных процессов и усилении неконтролируемых свободнорадикальных реакций с участием перекисей [41, 43].

Свободные радикалы кислорода и перекиси резко снижают выработку и содержание в крови вазодилататора окиси азота, что приводит к нарушению тонуса сосудов, вазомоторики и гемодинамики [34]. Ионы металлов (Cu²⁺, Fe³⁴*) усиливают окислительный стресс при диабете, внося дисбаланс в содержание метаболитов, витаминов и коферментов (НАДН, НАДФН, глутатион, аскорбиновая кислота, липоевая кислота и др.), участвующих в окислительно-восстановительных реакциях, способствуя окислению SH-групп ферментов и сократительных белков гладкой мускулатуры сосудов [23] и ускоряя повреждение хромосомной и митохондриальной ДНК [29]. При гипергликемии отдельные звенья системы антиоксидантной защиты испытывают повышенную нагрузку, что приводит к изменению содержания и экспрессии ферментов данной системы (супероксиддисмутазы, каталазы — CAT, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы) и к ее ослаблению [25, 26, 44]. Во всяком случае в опытах in vitro описан феномен неферментативного гликозилирования CAT и супероксиддисмутазы при повышенном содержании глюкозы с последующей потерей модифицированными белками антигенных свойств [45].

Повышенные концентрации глюкозы активируют в эпителиальных клетках кровеносных сосудов синтез мРНК ряда структурных белков и ферментов, включая фибринектин, коллаген IV, ламинин, альдозоредуктазу, CAT, глутатионпероксидазу и Си-, Zn-зависимую супероксиддисмутазу [6, 7, 28, 33]. Это приводит к утолщению (гипертрофии) сосудистой стенки, увеличению массы межклеточного матрикса и структурной перестройке базальной мембраны в почечных клубочках, ведущей к нарушению селективности осуществляемой почками ультрафильтрации белков плазмы крови и протеинурии [18, 24]. Усиление экспрессии альдозоредуктазы активирует полиоловый путь глюкозного обмена, что приводит к накоплению в клетках эпителия сорбитола и патологическим изменениям внутриклеточного осмотического давления, ионного состава, структуры клеточных мембран и в конечном итоге может вызвать гибель клеток и разрушение капилляров 1191.

В многочисленных опытах на животных моделях с искусственно индуцированным диабетом показаны изменения в уровне мРНК и содержании ферментов антиоксидантной защиты в почках, заключающиеся, как правило, в увеличении активности глутатионпероксидазы на фоне снижения активности Мп-зависимой супероксиддисмутазы и CAT [3, 17, 35, 40, 44]. При диабете в почках крыс отмечено усиленное образование перекисей липидов и снижение содержания глутатиона — процессы, свидетельствующие о развитии окислительного стресса [3, 22, 27, 35]. Инсулинотерапия возвращает данные изменения к норме [3, 40, 44]. Введение CAT наряду с использованием других антиоксидантов типа маннитола, бензоата, витамина Е, аскорбиновой кислоты и иминогуанидина (противогликозилирующий агент) в значительной мере ослабляет окислительный стресс при диабете [2, 37].

ДН, как и прочие диабетические ангиопатии, является многофакторным и полигенным заболеванием. Гены антиоксидантной защиты и полиолового пути обмена глюкозы можно по праву рассматривать в числе кандидатов на участие в развитии ДН. В настоящей работе мы предприняли попытку оценить возможный вклад генов CAT и альдозоредуктазы в генетическую предрасположенность к раннему развитию нефропатии при инсулинзависимом сахарном диабете (ИЗСД).

CAT является одним из основных ферментов системы антиоксидантной защиты, осуществляющим разложение перекиси водорода (продукта супероксиддисмутазной реакции) на воду и свободный кислород. Ген CAT находится на хромосоме 11 р 13 [15]. Для ассоциативного анализа мы использовали 2 полиморфных микросателлитных маркера (DI 1S907 и DI 1S2008), сцепленных с геном CAT и расположенных соответственно в 2,2 и 2 сМ от него в направлении к p-концу хромосомы. Микросателлит D11S907 включает множественные копии повтора СА. Во французской популяции найдено 6 аллелей данного локуса с числом повторов от 15 до 20 длиной от 163 до 173 пар нуклеотидов (п.н.) и гетерозиготностыо 0,753 [9]. Тетрануклеотидный микросателлит локуса DI 1S2008 состоит из тандемно повторяющихся мотивов СТАТ. У британских европеоидов обнаружено 5 аллелей размером от 128 до 144 п. н., включающих от 17 до 21 повтора [30].

Альдозоредуктаза — ключевой фермент полиолового пути обмена глюкозы — катализирует реакцию зависимого от НАДФН восстановления гексоз в соответствующие шестиатомные спирты, превращая D-глюкозу в сорбитол, а галактозу — в галактитол. Альдозоредуктаза относится к "суперсемейству” ферментов с альдо/кеторедуктазной активностью, гены которых картированы на различных хромосомах [4]. Экспрессия данного белка обнаружена во многих тканях и органах, в том числе в почках [31]. В 5-концевой части гена альдозоредуктазы (AR2), примерно в 2,1 тыс. п.н. от участка начала репликации локализован динуклеотидный микросателлит, состоящий из тандемных повторов (СА),₂ [20]. Впервые полиморфизм этого микросателлита исследован в китайской популяции Гонконга: найдено 7 аллелей от 132 до 144 п.н., содержащих от 21 до 27 ди нуклеотидных повторов [20]. У японцев обнаружена корреляция между данным полиморфизмом и содержанием альдозоредуктазы, заключающаяся в наличии максимальных уровней фермента у носителей аллелей с 23 и 28 повторами [13, 32]. Показана ассоциация данного полиморфного маркера с такими сосудистыми осложнениями, как диабетическая ретинопатия [13, 20, 32], ДН [10] и диабетическая нейропатия [11].

Материалы и методы

Обследовано 68 больных ИЗСД с возрастом манифестации до 20 лет. В зависимости от длительности диабета и наличия клинической протеинурии (альбуминурия > 300 мг/сут) больные были разделены на 2 группы: ”ДН+” (л = 27; длительность ИЗСД <15 лет, протеинурия) и "ДН—” (/7 = 41; длительность ИЗСД > 20 лет, альбуминурия < 200 мг/сут). Для оценки текущего нарушения углеводного обмена как метаболического фактора риска ДН у всех больных определяли уровень (в %) неферментативно гликированного гемоглобина (фракцию А|) с помощью ионообменной хроматографии на биохимическом анализаторе ("Abbott Laboratories", США). Общая характеристика групп больных приведена в табл. 1.

Термостабильная ДНК-полимераза Tag получена от НПО "Биотех" (Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы НПО "Синтол" (Москва). Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции 114]. Полиморфные участки геномной ДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплифика-

Таблица 1

Общая характеристика обследованных групп больных ИЗСД с наличием (ДН+) и отсутствием (ДН—) ДН

Примечание. SD — стандартное отклонение.

цию полиморфного участка гена AR2 проводили, как описано ранее [1]. Микросателлитные повторы рядом с геном CAT амплифицировали на термоциклере РНС-2 ("Techne", Великобритания) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ трис-НС1 pH 8,8, 16,7 мМ сульфат аммония, 0,2 мМ каждого dNTP, 1 мМ хлорид магния, по 5 пмоль каждого из праймеров, 0,1% твин-20, 50-100 нг геномной ДНК и 2,5 ед. полимеразы Tag. ПЦР проводили по следующей программе: начальная стадия (1 цикл) — 94°С/4 мин, основная стадия (35 циклов) — 94°С/ 1 мин, 50°С (D11S907) или 55°С (D11S2OO8)/1 мин, 72°С/1 мин: конечная стадия (1 цикл) — 72°С/ 6 мин. Амплификацию микросателлитного повтора D11S907 проводили в присутствии праймеров DI 1S907-1 (5 -GCT TATTGTCCCATACCCAAA-3') и DI 1S907-2 (5 -AAAGCACCTTAATTTCAGGC-3'). Полиморфный участок локуса DI 1S2008 амплифицировали с использованием праймеров D11S2008R (5-САТС САТСТСАТСССАТСАТ-3') и DI 1S2OO8L(5-ТТСАС CCTACTGCCAATTC-3'). Продукты ПЦР элекгрофоретически разделяли в 12% полиакриламидном геле, который затем окрашивали серебром [36].

Распределение аллелей и генотипов изученных локусов в группах больных сравнивали с использованием точного критерия Фишера. Достоверными считали различия при р < 0,05. Относительный риск (/?/?) рассчитывали по формуле [42]. RR = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации, RR > 1 свидетельствовало о наличии предрасположенности (фактор риска), RR < 1 — о предохраняющем действии (защитный фактор) генетического маркера (аллеля или генотипа) к раннему развитию патологии.

Результаты и их обсуждение

Для снижения маскирующего влияния негенетических факторов риска и выявления генетического компонента в этиопатогенезе ДН формировали группы больных с использованием метода "случай—контроль” ("патология—отсутствие патологии"). Для формирования групп с клиническими фенотипами нефропатии ("ДН+, "случай") и ее отсутствия ("ДН—", "контроль") использовали специальные, неперекрывающиеся критерии отбора больных. В группу "случай" ("ДН+") вошли пациенты с относительно короткой продолжительностью ИЗСД (< 15 лет) и четко выраженным фенотипом нефропатии (с клинической протеинурией), тогда как группу "контроль" ("ДН—") составили больные с гораздо большей длительностью ИЗСД (> 20 лет), но без выраженной нефропатии (с нормои микроальбуминурией).

В обеих группах обнаружили 7 аллелей гена AR2 размером от 132 до 144 п.н. Аллели нумеровали, исходя из числа содержащихся в них повторов. Так, аллель длиной 132 п.н. с 21 динуклеотидным повтором получил порядковый номер 21, аллель размером 134 п.н., содержащий 22 повтора, — номер 22 и т. д. В обеих группах с частотой свыше 10% встречались 4 аллеля (23—26). Наибольшие различия в распределении алеллей касались аллеля 23, содержание которого у больных нефропатией было в 1,57 раза ниже, чем в группе "ДН—" (RR = 0,60) (табл. 2).

У больных ДН наиболее распространены генотипы 23/24, 24/25, 24/26 и 26/26, а в группе "ДН—" —

Таблица 2

Сравнительный анализ распределения частот встречаемости (в %) аллелей и генотипов гена AR2 у больных с наличием (ДН+) и отсутствием (ДН-) ДН

генотипы 23/24, 24/24 и 25/26 (см. табл. 2). Наибольшие значения RR характерны для гетерозигот 24/27 (6,45), 22/23 (4,70), 25/27 (4,70) и 24/25 (3,86), тогда как 5 других генотипов обладали значениями RR меньше 0,3 (наименьший относительный риск (0,20) у генотипов 23/23 и 23/27, не встречавшихся в группе "ДН+". Однако наблюдаемые различия в частотах встречаемости аллелей и генотипов недостоверны, что свидетельствует об отсутствии связи между геном AR2 и ДН при ИЗСД в московской популяции. Ранее мы не обнаружили ассоциации между данным геном и нефропатией на значительно менее представительных выборках (19 больных с наличием ДН и 31 пациент с отсутствием ДН) [1]. Таким образом, увеличение объема групп обследованных почти в 1,5 раза по-прежнему не указало на наличие ассоциации.

Наши данные не соответствуют результатам исследований, проведенных в Великобритании и показавших четкую связь между геном альдозоредуктазы и предрасположенностью к ДН у больных ИЗСД [10]. У британцев с ДН наблюдали существенное увеличение встречаемости аллеля 23 (35,5% против 12,2%) генотипа 23/24 (44,2% против 8,9%) на фоне снижения доли аллеля 25 (8,6% против 38,9%) и гетерозигот 24/25 (46,7% против 8,9%) по сравнению с контрольной группой [10]. Тем не менее, на наш взгляд, для гена AR2 более характерно участие в развитии диабетической ретинопатии, чем ДН. Патологическая активация экспрессии данного гена и сорбитолового пути метаболизма

Таблица 3

Сравнительный анализ распределения частот встречаемости (в %) аллелей и генотипов локуса D11S2008 у больных с наличием (ДН+) и отсутствием (ДН-) ДН

Таблица 4

Сравнительный анализ распределения частот встречаемости (в %) аллелей и генотипов локуса D11S907 у больных с наличием (ДН+) и отсутствием (ДН-) ДН

глюкозы и накопление сорбитола в клетках микрососудов вызывают более сильное и быстрое разрушительное действие на капилляры глазной сетчатки, чем на мелкие кровеносные сосуды фильтрующего аппарата почек.

У больных ДН найдено 6 аллелей локуса D6S2008 длиной от 128 до 148 п. н. В контрольной группе дополнительно обнаружен редкий аллель 15 размером 120 п.н.; аллель 16 длиной 124 п.н. отсутствует в обеих выборках. С частотой выше 10% встречались 3 аллеля, из которых в группе "ДН+" наиболее распространен аллель 19 (44,4%), тогда как в контрольной выборке максимальной частотой встречаемости (0,341) обладали 2 аллеля (18 и 19) (табл. 3). Наибольший риск связан с аллелем 19 (RR = 1,54), доля которого у больных ДН в 1,3 раза выше, чем у пациентов без нефропатии. Минимальный риск (RR = 0,40) характерен для относительно редкого аллеля 21, встречающегося у пациентов без ДН в 3,21 раза чаще.

У больных ДН наибольшими частотами встречаемости обладали генотипы 19/19 (0,148), 18/19 (0,222) и 19/20 (29,6) (см. табл. 3). В группе ”ДН—” с частотой выше 0,1 встречались сразу 5 генотипов, а максимальным распространением обладал генотип 19/19 (24,4%). Наивысшие значения RR наблюдали у генотипов 19/20 (2,89), 18/21, 19/22 и 20/20 (у всех трех RR = 4,70), а наименьшие — у гетерозигот 18/20 (0,38) и 19/21 (0,29). Однако анализ по Фишеру не выявил достоверных различий в распределении аллелей и генотипов локуса D11S2008 в сравниваемых группах. Лишь накопление генотипа 19/20 в группе "ДН+” носило характер, близкий к достоверному (р = 0,07). Расширение объема исследованных выборок позволит уточнить, достоверно ли связано носительство данного генотипа с риском развития нефропатии при ИЗСД.

У другого микросателлитного локуса (D11S907) рядом с геном CAT показано наличие 7 аллелей длиной 161 — 173 п.н. В группе "ДН+” наиболее распространены аллели 15, 16 и 18, а в группе сравнения — аллели с 16, 17 и 18 повторами. У больных нефропатией показано достоверное (р < 0,05) увеличение частоты встречаемости аллелей 15 (16,7% против 6,1%; RR = 2,94) и 18 (29,6% против 15,9%; RR = 2,21) на фоне существенного снижения содержания аллеля 17 (9,3% против 30,5%; RR = 0,25; р < 0,005) (табл. 4). Это свидетельствует об ассоциации полиморфизма локуса D1S907 с ДН, причем носительство аллелей 15 и 18 связано с повышенным риском развития данной патологии, тогда как наличие аллеля 17, напротив, предохраняет от раннего развития ДН.

Различия в распределении генотипов локуса DI 1S907 между группами "ДН+” и "ДН—" не столь выражены, как в частотах аллелей. Однако накопление генотипа 15/19 у больных с наличием ДН (у пациентов с отсутствием ДН не обнаружен) очень близко к достоверному (р = 0,058) и связано с максимальным риском (RR= 11,86). Наименьший относительный риск (0,12) характерен для гомозиготного носительства аллеля 17. Этот генотип не найден у больных нефропатией, и различия в его доле в группах "ДН+" и "ДН—" также близки к достоверным значениям (р = 0,071) (см. табл. 4). Сравнительный анализ расширенных групп больных позволит более точно определить достоверность наблюдаемых тенденций в перераспределении генотипов.

Таким образом, наличие достоверных различий в распределении аллелей одного локуса (D11S907) и отсутствие таковых у другого локуса (D11S2008) рядом с геном CAT не позволяет сделать однозначный вывод о наличии строгой ассоциации между геном CAT и ДН на фоне ИЗСД. Необходимо обследовать большее число больных, чтобы уточнить имеющиеся данные. Для более полной оценки вклада системы антиоксидантной защиты и отдельных ее звеньев в патогенез нефропатии и прочих диабетических ангиопатий необходим подобный ассоциативный анализ для генов, кодирующих другие компоненты данной системы (Си-, Znи Mn-зависимая супероксиддисмутазы, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, глутатионтрансфераза и др.).

Выводы

1. Не обнаружено ассоциации между полиформизмом ди нуклеотидного микросателлита в 5-концевой части гена альдозоредуктазы и ДН при ИЗСД.
2. Исследован полиморфизм двух микросателлитов (локусы DI 1S907 и D11S2008), сцепленных с геном CAT. Не выявлено достоверных различий в частотах встречаемости аллелей и генотипов тетрануклеотидного полиморфного микросателлита в локусе D11S2008 у больных с наличием и отсутствием ДН. В то же время показано достоверное увеличение доли аллелей 15 и 18 на фоне существенного снижения содержания аллеля 17 динуклеотидного микросателлита в локусе D11S Таким образом, существует предположение о наличии связи между геном CAT и развитием ДН при ИЗСД в московской популяции; уточнить выраженность этой тенденции позволит анализ расширенных групп больных.