Экспрессия гена тиреоглобулина при врожденном зобе

Тиреоглобулин (ТГ) — основной белок, синтезируемый щитовидной железой. Нативный ТГ состоит из двух идентичных 128-субъединиц мол. массой по 330 кД, кодируемых 33S мРНК. мРНК — одна из самых больших матричных РНК, описанных у млекопитающих, ее мол. масса равна 2,8* 10⁶ Д. В норме содержание ТГ составляет 50—60% от общей массы белков тиреоидной ткани. При ряде заболеваний щитовидной железы содержание ТГ в тиреоидной ткани значительно уменьшается, отмечаются изменения и в структуре ТГ [6].

Врожденный зоб является редкой клинической аномалией, приводящей к задержке роста и умственного развития. Эта форма тиреоидной патологии часто сопровождается явлениями кретинизма. Зоб развивается вследствие хронически увеличенного уровня тиреоидстимулирующего гормона, когда причиной заболевания является метаболический дефект одного или нескольких этапов биосинтеза ТГ — предшественника тиреоидных гормонов. При врожденном зобе экстракты щитовидной железы практически не содержат ТГ [7].

Низкий уровень ТГ при зобах a priori можно объяснить нарушениями, происходящими на одном из этапов регуляции биосинтеза белка: 1) транскрипция гена ТГ; 2) созревание мРНК_тг в ядре; 3) транспорт мРНК_тг из ядра и вхождение в полисомы; 4) трансляция мРНКрр.

Представленные в настоящей работе результаты свидетельствуют о возможном нарушении экспрессии гена ТГ на уровне трансляции при врожденном зобе.

Материалы и методы

Для выделения мРНКур использовали щитовидные железы, удаленные во время операции по поводу врожденного зоба. Контролем служили щитовидные железы людей, погибших в результате несчастных случаев (трупный судебно-медицинский материал), взятые при аутопсии не позднее 6—12 ч после смерти.

Суммарные полирибосомы выделяли магниевым методом [5], суммарную полисомальную РНК — SDS-фенол-хлороформным методом. Полисодержащую мРНК исследовали хроматографией суммарной полисомальной РНК на колонке с поли-У-сефарозой 4В при 30°С в буфере, содержащем 0,1 М NaCl, 0,01 М ЭДТА, 0,01 М трис-НС1 pH 7,5 и 0,2% SDS. Ультрацентрифугирование мРНК проводили в 5—20% сахарозном линейном градиенте при 49 000 об/мин в течение 3 ч (Spinco 2, ротор SW 65). В качестве маркера использовали цитоплазматическую РНК из клеток печени мыши.

Инкубационная смесь для синтеза кДНК содержала: 0,05М трис-НС1 pH 8,3, 0,05М КС1, 0,005 М MgCl₂, меркаптоэтанол; 2 мкг/мл мРНКур, 4 мкг/мл олиго-(с!Т)|о, 100 мкг/мл актиномицина D, 24% ед/мл РНК -зависимой ДНК-полимеразы, по 0,5 мМ dATP, dCTP, dTTP, dTTP, 0,1 мМ (³H) dCTP (1719 мкКи/мл) 100 мкг ингибитора рибонуклеазной активности из плаценты человека [9].

Рекомбинантные плазмиды Ph Tg 68, штамм Е. Coli С600, содержали последовательности хромосомного гена ТГ (7,9 т. п. н.), полученные в лаборатории Vassart (Бельгия) и любезно предоставленные нам для исследований. Введение радиоактивной метки в ДНК проводили методом нуклеотидного замещения по R. Rigby и соавт. [11]. Гибридизацию поли-А-мРНК с ³Н-ТГ кДНК проводили по методу, описанному ранее [8].

Результаты и их обсуждение

Данные, характеризующие выход поли-А-содержащей мРНК в зависимости от вида тиреоидной патологии, представлены в таблице.

Наибольшим был выход поли-А-содержащей мРНК из клеток нормальной щитовидной железы; из клеток диффузного токсического зоба он выше, чем из клеток узлового эутиреоидного зоба. Это согласуется с нашими предыдущими данными, полученными при определении размера популяции ТГ-синтезирующих полирибосом в норме и при тиреоидной патологии [1]. Выход поли-А-содержащей мРНК из клеток врожденного зоба не отличается от нормы.

Выход поли-А-содсржащей мРНК из клеток щитовидной железы человека

При ультрацентрифугировании в 5—20% градиенте плотности сахарозы поли-А-содержащая мРНК из клеток врожденного зоба выходила в трех пиках: 33S, 28S, 18S (рис. 1, кривая 2), также как и мРНК_тг из клеток нормальной щитовидной железы (рис. 1, кривая 7).

Нативность поли-А-содержащей мРНК из клеток щитовидной железы при врожденном зобе определяли электроферезом в 1,5% агарозе в присутствии 7 М мочевины (рис. 2). Различий в размере мРНК из клеток нормальной щитовидной железы и при врожденном зобе не обнаружено. Для того, чтобы измерить количество мРНК_тг при врожденном зобе и в клетках нормальной тиреоидной ткани, более точно были построены Rot кривые (рис. 3). В нормальной тиреоидной ткани (кривая 7) гибридизуемость достигала 85%, при врожденном зобе (кривая 2) — 82%. Как видно из представленных данных, и этот анализ не выявил разницы в концентрациях мРНК_тг в норме и в исследованном нами случае врожденного зоба.

Согласно современным представлениям, первичные механизмы, лежащие в основе недостаточности белков — генных продуктов при ряде наследственных заболеваний, могут быть обусловлены разнообразными внутриили внегенными мутациями, вызывающими полные либо частичные блоки экспрессии генов на различных уровнях этого сложного и многоступенчатого процесса (нарушение информационной специфичности кодирующих после-

Рис. 2. Электрофорез в 1,5% агарозе в присутствии 7 М мочевины.

/ — поли-А-содержащая мРНК из клеток нормальной щитовидной железы; 2 — поли-А-содержащая мРНК из клеток щитовидной железы при врожденном зобе; 3 — цитоплазматическая РНК из печени мыши.

довательностей гена, недостаточность транскрипции, блоки созревания мРНК, трансляционная недостаточность [3].

Ранее нами было показано, что при врожденном зобе наблюдается резкое уменьшение способности образования гибридов: она составляла всего 12%, что указывало на уменьшение содержания мРНК_тг в 4,8 раза, нарушение экспрессии гена ТГ происходило на уровне транскрипции [2].

Представленные результаты свидетельствуют о недостаточной экспресии гена ТГ в клетках щитовидной железы при врожденном зобе. В данном случае врожденного зоба значительных изменений в структуре или транскрипции гена ТГ не происходит. Воможно, в этом случае наблюдаются толковая мутация или неправильное соединение, которые ведут к блоку трансляции и к аномальному переносу продуктов трансляции через эндоплазматический ретикулум.

Рис. 1. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности 5— 20% сахарозы (Spinco L2, SW 65; 3 ч).

Рис. 3. Кривые гибридизации кДНК_тг с поли-А-мРНК_тг.

1 — нормальная щитовидная железа; 2 — врожденный зоб. а — прямые кривые; б — логарифмические кривые.

По оси ординат — гибридизация (в %).

/ — поли-А-содержащая мРНК из клеток нормальной щитовидной железы; 2 — поли-А-содержащая мРНК из клеток щитовидной железы при врожденном зобе; 3 — цитоплазматическая РНК из печени мыши.

Нормальный размер мРНКур был обнаружен и при изучении инбредной породы голландских коз с врожденным зобом, обусловленным дефицитом синтеза ТГ [4].

Наличие нормальных количеств мРНК_тг при врожденном зобе исключает вероятность того, что дефект синтеза ТГ обусловлен отсутствием экзона 4 за счет мутации в положении С G на участке интрона 3 [12] или является результатом большой делении в гене ТГ либо существенных изменений скорости его транскрипции. Нормальный размер мРНК в данном случае врожденного зоба свидетельствует против дефекта сплайсинга, который был описан при врожденном дефекте сплайсинга ТГ у африканского крупного рогатого скота [10].

Таким образом, полученные данные указывают на отклонения, ведущие либо к блоку трансляции мРНК_тг, либо к структурному дефекту молекулы ТГ, который влияет на ее нормальное прохождение через систему клеточной мембраны.

Выводы

1. Из клеток щитовидной железы в норме и при врожденном зобе выделена и охарактеризована поли-А-содержащая мРНК.
2. Показано, что при врожденном зобе не происходит снижения содержания мРНК, что свидетельствует о нарушении экспрессии гена ТГ на уровне трансляции.