Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Экспрессия гена тиреоглобулина при врожденном зобе

https://doi.org/10.14341/probl11823

Полный текст:

Аннотация

Из клеток щитовидной железы человека в норме и при врожденном зобе выделена и охарактеризована поли-А-содержащая тиреоглобулиновая мРНК (мРНЕТГ). На матрице поли-А-содержащей мРНКТГ путем обратной транскрипции в присутствии ингибитора РНКазы из плаценты человека синтезирована однонитевая комплементарная ДНК (кДНК), которая была использована в экспериментах по гибридизации для количественного определения мРНК. Показано, что в данном случае врожденного зоба отмечается нормальное количество мРНК^р при дефиците ТГ, что свидетельствует о нарушении экспрессии гена ТГ на уровне трансляции.

Для цитирования:


Кадырова Д.А., Атаханова Б.А., Туракулов Я.Х. Экспрессия гена тиреоглобулина при врожденном зобе. Проблемы Эндокринологии. 1999;45(6):34-36. https://doi.org/10.14341/probl11823

For citation:


Kadyrov D.A., Atakhanova B.A., Turakulov Y.K. Thyroglobulin gene expression in congenital goiter. Problems of Endocrinology. 1999;45(6):34-36. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11823

Тиреоглобулин (ТГ) — основной белок, синтезируемый щитовидной железой. Нативный ТГ состоит из двух идентичных 128-субъединиц мол. массой по 330 кД, кодируемых 33S мРНК. мРНК — одна из самых больших матричных РНК, описанных у млекопитающих, ее мол. масса равна 2,8* 106 Д. В норме содержание ТГ составляет 50—60% от общей массы белков тиреоидной ткани. При ряде заболеваний щитовидной железы содержание ТГ в тиреоидной ткани значительно уменьшается, отмечаются изменения и в структуре ТГ [6].

Врожденный зоб является редкой клинической аномалией, приводящей к задержке роста и умственного развития. Эта форма тиреоидной патологии часто сопровождается явлениями кретинизма. Зоб развивается вследствие хронически увеличенного уровня тиреоидстимулирующего гормона, когда причиной заболевания является метаболический дефект одного или нескольких этапов биосинтеза ТГ — предшественника тиреоидных гормонов. При врожденном зобе экстракты щитовидной железы практически не содержат ТГ [7].

Низкий уровень ТГ при зобах a priori можно объяснить нарушениями, происходящими на одном из этапов регуляции биосинтеза белка: 1) транскрипция гена ТГ; 2) созревание мРНКтг в ядре; 3) транспорт мРНКтг из ядра и вхождение в полисомы; 4) трансляция мРНКрр.

Представленные в настоящей работе результаты свидетельствуют о возможном нарушении экспрессии гена ТГ на уровне трансляции при врожденном зобе.

Материалы и методы

Для выделения мРНКур использовали щитовидные железы, удаленные во время операции по поводу врожденного зоба. Контролем служили щитовидные железы людей, погибших в результате несчастных случаев (трупный судебно-медицинский материал), взятые при аутопсии не позднее 6—12 ч после смерти.

Суммарные полирибосомы выделяли магниевым методом [5], суммарную полисомальную РНК — SDS-фенол-хлороформным методом. Полисодержащую мРНК исследовали хроматографией суммарной полисомальной РНК на колонке с поли-У-сефарозой 4В при 30°С в буфере, содержащем 0,1 М NaCl, 0,01 М ЭДТА, 0,01 М трис-НС1 pH 7,5 и 0,2% SDS. Ультрацентрифугирование мРНК проводили в 5—20% сахарозном линейном градиенте при 49 000 об/мин в течение 3 ч (Spinco 2, ротор SW 65). В качестве маркера использовали цитоплазматическую РНК из клеток печени мыши.

Инкубационная смесь для синтеза кДНК содержала: 0,05М трис-НС1 pH 8,3, 0,05М КС1, 0,005 М MgCl2, меркаптоэтанол; 2 мкг/мл мРНКур, 4 мкг/мл олиго-(с!Т)|о, 100 мкг/мл актиномицина D, 24% ед/мл РНК -зависимой ДНК-полимеразы, по 0,5 мМ dATP, dCTP, dTTP, dTTP, 0,1 мМ (3H) dCTP (1719 мкКи/мл) 100 мкг ингибитора рибонуклеазной активности из плаценты человека [9].

Рекомбинантные плазмиды Ph Tg 68, штамм Е. Coli С600, содержали последовательности хромосомного гена ТГ (7,9 т. п. н.), полученные в лаборатории Vassart (Бельгия) и любезно предоставленные нам для исследований. Введение радиоактивной метки в ДНК проводили методом нуклеотидного замещения по R. Rigby и соавт. [11]. Гибридизацию поли-А-мРНК с 3Н-ТГ кДНК проводили по методу, описанному ранее [8].

Результаты и их обсуждение

Данные, характеризующие выход поли-А-содержащей мРНК в зависимости от вида тиреоидной патологии, представлены в таблице.

Наибольшим был выход поли-А-содержащей мРНК из клеток нормальной щитовидной железы; из клеток диффузного токсического зоба он выше, чем из клеток узлового эутиреоидного зоба. Это согласуется с нашими предыдущими данными, полученными при определении размера популяции ТГ-синтезирующих полирибосом в норме и при тиреоидной патологии [1]. Выход поли-А-содержащей мРНК из клеток врожденного зоба не отличается от нормы.

Выход поли-А-содсржащей мРНК из клеток щитовидной железы человека

Объект выделения

Выход поли-

А-содержащей мРНК, мкг/г

Количество ТГ-синтезирующих полисом, %

Содержание ТГ в ткани щитовидной железы, мкг/г

Нормальная щитовидная железа

20,0 ±0,11

16,2 ± 0,40

86,6 ± 0,71

Врожденный зоб

19,5

Не исследовали

0

Узловой эутиреоидный зоб

12,0 ± 0,60

7,6 ± 0,20

70,2 ± 1,40

Диффузный токсический зоб

17,0 ± 0,80

12,6 ± 0,14

87,7 ± 2,00

При ультрацентрифугировании в 5—20% градиенте плотности сахарозы поли-А-содержащая мРНК из клеток врожденного зоба выходила в трех пиках: 33S, 28S, 18S (рис. 1, кривая 2), также как и мРНКтг из клеток нормальной щитовидной железы (рис. 1, кривая 7).

Нативность поли-А-содержащей мРНК из клеток щитовидной железы при врожденном зобе определяли электроферезом в 1,5% агарозе в присутствии 7 М мочевины (рис. 2). Различий в размере мРНК из клеток нормальной щитовидной железы и при врожденном зобе не обнаружено. Для того, чтобы измерить количество мРНКтг при врожденном зобе и в клетках нормальной тиреоидной ткани, более точно были построены Rot кривые (рис. 3). В нормальной тиреоидной ткани (кривая 7) гибридизуемость достигала 85%, при врожденном зобе (кривая 2) — 82%. Как видно из представленных данных, и этот анализ не выявил разницы в концентрациях мРНКтг в норме и в исследованном нами случае врожденного зоба.

Согласно современным представлениям, первичные механизмы, лежащие в основе недостаточности белков — генных продуктов при ряде наследственных заболеваний, могут быть обусловлены разнообразными внутриили внегенными мутациями, вызывающими полные либо частичные блоки экспрессии генов на различных уровнях этого сложного и многоступенчатого процесса (нарушение информационной специфичности кодирующих после-

Рис. 2. Электрофорез в 1,5% агарозе в присутствии 7 М мочевины.

/ — поли-А-содержащая мРНК из клеток нормальной щитовидной железы; 2 — поли-А-содержащая мРНК из клеток щитовидной железы при врожденном зобе; 3 — цитоплазматическая РНК из печени мыши.

довательностей гена, недостаточность транскрипции, блоки созревания мРНК, трансляционная недостаточность [3].

Ранее нами было показано, что при врожденном зобе наблюдается резкое уменьшение способности образования гибридов: она составляла всего 12%, что указывало на уменьшение содержания мРНКтг в 4,8 раза, нарушение экспрессии гена ТГ происходило на уровне транскрипции [2].

Представленные результаты свидетельствуют о недостаточной экспресии гена ТГ в клетках щитовидной железы при врожденном зобе. В данном случае врожденного зоба значительных изменений в структуре или транскрипции гена ТГ не происходит. Воможно, в этом случае наблюдаются толковая мутация или неправильное соединение, которые ведут к блоку трансляции и к аномальному переносу продуктов трансляции через эндоплазматический ретикулум.

Рис. 1. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности 5— 20% сахарозы (Spinco L2, SW 65; 3 ч).

Рис. 3. Кривые гибридизации кДНКтг с поли-А-мРНКтг.

1 — нормальная щитовидная железа; 2 — врожденный зоб. а — прямые кривые; б — логарифмические кривые.

По оси ординат — гибридизация (в %).

/ — поли-А-содержащая мРНК из клеток нормальной щитовидной железы; 2 — поли-А-содержащая мРНК из клеток щитовидной железы при врожденном зобе; 3 — цитоплазматическая РНК из печени мыши.

Нормальный размер мРНКур был обнаружен и при изучении инбредной породы голландских коз с врожденным зобом, обусловленным дефицитом синтеза ТГ [4].

Наличие нормальных количеств мРНКтг при врожденном зобе исключает вероятность того, что дефект синтеза ТГ обусловлен отсутствием экзона 4 за счет мутации в положении С G на участке интрона 3 [12] или является результатом большой делении в гене ТГ либо существенных изменений скорости его транскрипции. Нормальный размер мРНК в данном случае врожденного зоба свидетельствует против дефекта сплайсинга, который был описан при врожденном дефекте сплайсинга ТГ у африканского крупного рогатого скота [10].

Таким образом, полученные данные указывают на отклонения, ведущие либо к блоку трансляции мРНКтг, либо к структурному дефекту молекулы ТГ, который влияет на ее нормальное прохождение через систему клеточной мембраны.

Выводы

  1. Из клеток щитовидной железы в норме и при врожденном зобе выделена и охарактеризована поли-А-содержащая мРНК.
  2. Показано, что при врожденном зобе не происходит снижения содержания мРНК, что свидетельствует о нарушении экспрессии гена ТГ на уровне трансляции.

Список литературы

1. Атаханова Б. А., Кадырова Д. А., Туракулов Я. X., Шипицына Г. И. // Биохимия. — 1989. — Т. 54, № 1. — С. 81—87.

2. Гайцхоки В. С. // Биополимеры и клетка. — 1990. — Т. 6, № 11. С. 31-46.

3. Кадырова Д. А., Атаханова Б. А., Туракулов Я. X. и др. // Биохимия. — 1979. — Т. 44, № 2. — С. 259—263.

4. Кадырова Д. А., Атаханова Б. А., Туракулов Я. X., Шипи цына Г. И. I/ Молекул, биол. — 1989. — Т. 23, № 4. — С. 1101-1106.

5. Лейтин В. Л., Лерман М. И. // Биохимия. — 1969. — Т. 34. — С. 839-850.

6. Туракулов Я. X., Бабаев Т. А., Сайтов Т. С. Йодпротеины щитовидной железы. — Ташкент, 1974.

7. Туракулов Я. X., Атаханова Б. А., Кадырова Д. А. // Пробл. эндокринол. — 1983. — Т. 29, № 5. — С. 38—41.

8. Kafatos F. С., James С. Н. // Nucl. Acids Res. — 1979. — Vol. 7. P. 1541-1551.

9. De Martinoff R. S. E., Vassart G. // Biochem. biophys. Res. Commun. — 1970. — Vol. 93. — P. 645—654.

10. Richets M. H., Pohl V., De Martinoff C. D. et al. // Eur. molec. Biol. Organ. 1985. Vol. 44, N 3. P. 731-737.

11. Rigby R. W. J., Dickman M., Ponder G. // J. molec. Biol. — 1977. Vol. 113. P. 237-251.

12. Sterk A., van Dijk J., Veenber J. M. et al. // Endocrinology. — 1989. Vol. 124, N 1. P. 477-483.


Об авторах

Д. А. Кадырова

Институт биохимии АН Республики Узбекистан


Узбекистан


Б. А. Атаханова

Институт биохимии АН Республики Узбекистан


Узбекистан


Я. Х. Туракулов

Институт биохимии АН Республики Узбекистан


Узбекистан


Рецензия

Для цитирования:


Кадырова Д.А., Атаханова Б.А., Туракулов Я.Х. Экспрессия гена тиреоглобулина при врожденном зобе. Проблемы Эндокринологии. 1999;45(6):34-36. https://doi.org/10.14341/probl11823

For citation:


Kadyrov D.A., Atakhanova B.A., Turakulov Y.K. Thyroglobulin gene expression in congenital goiter. Problems of Endocrinology. 1999;45(6):34-36. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl11823

Просмотров: 124


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)