Определение концентрации тироксина в крови крыс с помощью радиоиммунологических наборов, предназначенных для определения уровня гормона в крови человека

При исследовании концентрации гормонов в крови животных часто возникают методические проблемы использования радиоиммунологических наборов (обычно предназначенных для работы с кровью людей), которые обусловлены видовой специфичностью антигенов. Если гормоны не обладают видовой специфичностью, то коммерческие наборы, например для определения уровня тироксина (Т₄), широко используют при работе с образцами крови животных, в том числе крыс [1,2, 5—8]. При этом предполагается, что возможные неопределенности радиоиммунологического анализа, возникающие из-за различий состава стандартных и определяемых проб, так называемого "матрикс-эффекта", невелики [9]. Это предположение, однако, является в значительной мере интуитивным. Дело в том, что литература, относящаяся к вопросу влияния "матрикс-эффекта” на определение концентрации Т₄, крайне скудна, и за последние 20 лет была опубликована только одна работа [10].

В связи со сказанным целью настоящего исследования явилось изучение влияния "матрикс-эффекта" на определение уровня Т₄ в крови крыс и установление возможности использования коммерческих наборов для определения концентрации гормона в крови человека для работы с образцами крови крыс.

Материалы и методы

Животные. В работе использовали самцов белых беспородных крыс стадного разведения. Животных содержали по 5—8 голов в клетках, расположенных на стеллажах, в отапливаемых вентилируемых помещениях. Корм, состоящий из комбикормов, зерна, овощей, творога, зелени, витаминных и минеральных добавок, они получали 1 раз в день до 11 ч по установленным нормам. Воду давали без ограничений.

Наборы и их модификация. Для определения уровня Т₄ применяли наборы производства ХОП ИБОХ НАН Республики Беларусь (Минск): РИОТ₄-ПГ и РИА-Т₄-СТ. В первом наборе для разделения свободной и связанной с антителами форм лиганда используется раствор полиэтиленгликоля, а во втором — иммобилизованные на стенках пробирки антитела к Т₄. Использовали исходные (в обычной комплектации) и модифицированные наборы. Модифицированные наборы содержали все компоненты исходных наборов, за исключением калибровочных проб, которые заменяли стандартными разведениями (0, 25, 50, 100, 200, 400 нмоль-л^-1) Т₄ ("Sigma”, США) в лишенной Т₄ "нулевой" сыворотке крови крыс.

Для удаления эндогенного Т₄ из сыворотки ее обрабатывали активированным углем Norit A ("Serva", Германия) (конечная концентрация угля 3%) в течение 3 ч при 37°С и постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Затем, чтобы отделить сыворотку крови от активированного угля, ее центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин. Всю процедуру повторяли 2 раза. Для полного удаления самых мелких частиц активированного угля сыворотку центрифугировали еще 2 раза по 20 мин при 14 000 g. Степень очистки сыворотки от Т₄ контролировали с помощью добавленного ¹²⁵1-Т₄. В результате описанной процедуры сыворотка освобождается от Т₄ более чем на 99%. В качестве консерванта к ней добавляли №N3 до конечной концентрации 0,1%. Аликвоты приготовленных таким образом калибровочных проб хранили до использования при —20°С.

Результаты определения концентрации Т₄ исходными и модифицированными наборами РИОТ₄-ПГ и РИА-Т₄-СТ в одних и тех же пробах сыворотки крови крыс подвергали математическому анализу, используя компьютерную программу "Stadia”.

Результаты и их обсуждение

Для изучения влияния "матрикс-эффекта" на определение уровня Т₄ в крови крыс с помощью наборов для его определения в крови людей было предпринято сравнительное исследование концентрации гормона в крови 59 крыс. Концентрацию Т₄ в каждой из 59 проб измеряли 4 раза: первый раз — исходным, второй — модифицированным набором с ПГ-системой разделения, третий и четвертый — соответственно исходным и модифицированным наборами с СТ-системой разделения.

На рис. 1 представлены результаты математической обработки данных определения концентрации Т₄ исходным и модифицированным наборами РИО-Т₄-ПГ. На нем изображена система прямоугольных координат, по осям которой отложены значения (в нмоль-л^_|) концентрации Т₄ в сыворотке крови крыс: по оси абсцисс — результаты измерений с помощью модифицированного, а по оси ординат — исходного набора. Прямая 7 — теоретическая. Она получалась бы в том случае, если бы концентрации Т₄ в каждой пробе, определяемые исходным и модифицированным наборами, полностью совпадали, т. е. у = х. Следовательно, урав-

70      20      00 40          50 60          70 80 90 700

Рис. 1. Сравнение результатов определения концентрации Т₄ (в нмоль-л^-1) в крови крыс модифицированными (по оси абсцисс) и исходными (по оси ординат) наборами РИО-Т₄-ПГ.

Здесь и на рис. 2: / — теоретическая прямая; 2, 3 — прямые, ограничивающие область 90—110% "открытия", добавленного в аналитическую систему Т₄; 4 — линия регрессии; 5, 6 — доверительные границы линии регрессии. нение этой прямой имеет вид у — 1х + 0. Заштрихованное пространство, ограниченное прямыми 2 и 3, представляет собой область значений 90—110% "открытия" добавленного в аналитическую систему Т₄. По существу — это область ± 10% ошибки метода. Такая ошибка считается приемлемой для медико-биологических методов исследований [3|. Точки, изображенные на рис. 1, получены пересечением значений концентрации Т₄ каждой пробы, определенных исходным и модифицированным наборами. Они не составляют прямой линии, а рассеяны на плоскости. Это указывает на наличие между величинами не функциональной, а статистической или корреляционной связи. Эта связь, однако, довольно тесная, о чем свидетельствует большой коэффициент корреляции (г), равный 0,9809. Для малых выборок, очень больших или очень малых значений г [4] ошибка коэффициента

корреляции ^определяется по формуле S,. = ^г

Jn-1 и в настоящем случае составляет ± 0,0256619, а

нормированное отклонение z= ^г                                  — 38,1.

л/1 Г²

Учитывая эти данные, есть основание с вероятностью более 99,9% утверждать, что между величинами концентрации Т₄ в крови крыс, определяемыми

с помощью исходных и модифицированных наборов РИО-Т₄-ПГ, существует прямая корреляционная зависимость. Имеется прямая (4 на рис. 1) — геометрическое место точек — сумма квадратов отклонений которых от эмпирически найденных будет наименьшей. Эта прямая — линия регрессии. Ее коэффициенты: А = 5,085 ± 0,547 и В 0,640 ± 0,0098, а уравнение у = 0,640х + 5,087. Гиперболы 5 и 6 представляют собой границы доверительного интервала линии регрессии.

Из приведенных данных следует, что определение концентрации Т₄ в крови крыс с помощью исходных наборов РИО-Т₄-ПГ в области "малых" концентраций (менее 10 нмоль • л^_|) будет давать завышенный результат, а в области "больших" (более 20 нмоль •л^-1) — заниженный. Поскольку в крови "интактных" [2, 5] или даже тиреоидэктомированных [1,7, 8] крыс концентрации Т₄ менее 10 нмоль-л^_| не наблюдается, то можно считать, что в области реальных уровней содержания Т₄ наборы РИО-Т₄ПГ производства ХОП ИБОХ НАН Республики Беларусь для определения концентрации гормона в крови крыс будут давать несколько заниженный результат.

Описанная система рассуждений вполне приемлема и для сравнения результатов, полученных исходным и модифицированным наборами РИА-Т₄СТ (рис. 2). Коэффициент корреляции г = 0,9802, ошибка коэффициента корреляции = ± 0,026277, нормированное отклонение t = 37,4. Таким образом, и в этом случае с вероятностью, превышающей 99,9%, можно утверждать, что связь между величинами концентрации Т₄ в крови крыс, определенными исходным и модифицированным наборами РИА-Т₄-СТ, не случайна. Математическая обработка результатов дала возможность определить коэффициенты линии регрессии: А = 1,712 ± 1,056 и

Рис. 2. Сравнение результатов определения концентрации Т₄ (в нмоль-л^-1) в крови крыс модифицированными (по оси абсцисс) и исходными (по оси ординат) наборами РИА-Т₄-СТ.

В = 0,875 ± 0,023. Исходя из этого, линия регрессии описывается следующим уравнением прямой: у = 0,875х — 1,712.

Следовательно, в области концентраций Т₄, обычных для сыворотки крови крыс, исходные наборы РИО-Т₄-ПГ и РИА-Т₄-СТ должны давать заниженные по сравнению с "истинными", определенными с помощью "крысиных" стандартов, результаты. Действительно, среднее значение концентрации гормона в крови 20 интактных крыс, определенное модифицированным набором РИО-Т₄-ПГ, составило 41,82 ± 6,06 нмоль • л^-1, эта же величина, полученная для исходного набора, равна 34,54 ± 4,28 нмоль*л^-1. Для наборов РИА-Т₄-СТ эти величины составили 47,69 ± 4,56 и 36,14 ± 4,34 нмоль*л^_| соответственно. Как и ожидалось, определяемые с помощью исходных ПГ-наборов уровни Т₄ оказались заниженными на 17%, а для СТ-наборов — на 24%, однако это занижение оказалось статистически недостоверным (/; > 0,05).

Таким образом, линейный характер регрессии между величинами концентрации Т₄ в крови крыс, а также отсутствие статистически значимой разницы в уровнях гормона у одних и тех же групп животных, определяемых исходными и модифицированными наборами, свидетельствуют в пользу того, что наборы РИО-Т₄-ПГ и РИА-Т₄-СТ можно применять для измерения уровней Т₄ в крови крыс. В пользу этого положения свидетельствуют и сведения о колебаниях концентрации Т₄ в крови интактных животных. Содержание Т₄ в сыворотке крови 9 групп самцов белых крыс, близких по возрасту, содержавшихся практически в одинаковых условиях, кровь у которых брали в одно время суток (до полудня) и года (в весенне-летний период), составило (в нмоль • л^-1): 64,5 ± 4,5 (л = 6); 47,2 ± 6,1 (л = 6); 29.0 ± 3,7 (л = 7); 22,5 ± 5,8 (л = 8); 36,7 ± 3,0 (л = 6); 36,8 ±1.4 (л = 8); 35,3 ± 3,8 (л = 7); 54,1 ± 3,7 (л = 7); 27,4 ± 1,5 (л = 6). Из этих данных видно, что размах колебаний этого показателя (отношения максимального значения к минимальному) равен 2,86, что существенно превосходит ошибки метода определения Т₄ у крыс, свойственные исходным наборам, причем разница между минимальной и максимальной величинами статистически высокодостоверна (р < 0,01). Все это подтверждает ранее высказанное мнение о том, что при проведении экспериментальных исследований, касающихся определения концентрации Т₄ в крови крыс, следует одновременно использовать и группы контрольных животных [7, 8]. При этом в случае относительного (в процентах) сравнения результатов неопределенности метода нивелируются.

Выводы

1. Между величинами концентрации Т₄ в крови одних и тех же крыс, определяемыми исходными (с "человеческими" стандартами) и модифицированными (с "крысиными" стандартами) наборами РИОТ₄-ПГ и РИА-Т₄-СТ, существует прямая корреляционная зависимость с коэффициентом корреляции, близким к 1 (0,9809 и 0,9802 соответственно).
2. Установлено, что в области реальных концентраций определение уровня Т₄ в крови крыс коммерческими наборами (РИО-Т₄-ПГ и РИА-Т₄-СТ) дает несколько заниженные результаты.
3. При проведении исследований, касающихся определения концентрации Т₄ в крови крыс с помощью коммерческих наборов, необходимо наличие одновременных контролей. При этом в случае относительного сравнения результатов неопределенности радиоиммунологического анализа, обусловленные "матрикс-эффектом", нивелируются.