Состояние гипофизарно-гонадальной системы у самцов крыс при диабете (экспериментальное исследование)

Известно, что при диабете нарушается нейроэндокринная регуляция репродуктивной функции у самцов крыс, однако единого мнения относительно уровня, на котором происходят эти изменения, до сих пор нет. Данные литературы, касающиеся секреции гонадотропинов, весьма противоречивы: показан сниженный [20] или неменяю- щийся [8] уровень циркулирующих гонадотропинов в крови. Большинство исследователей единодушны в том, что у больных диабетом наблюдается сниженный уровень андрогенов [9, 20], что свидетельствуете нарушении механизма отрицательной обратной связи. Локусом для сниженной чувствительности к андрогенам у таких животных может быть как гипоталамус, так и гипофиз.

В своей предыдущей работе мы изучали нарушение отрицательной обратной связи на уровне медиобазального гипоталамуса (МБГ) и не обнаружили изменений в концентрации ядерных рецепторов андрогенов в этой области. Поскольку действие половых стероидов на секрецию гонадотропинов опосредуется через специфические рецепторы, то на уровне гипоталамуса этот механизм, по-видимому, остается неповрежденным.

В связи с этим в настоящей работе было изучено состояние гипофизарно-гонадальной системы у самцов крыс с экспериментальным диабетом. Для этого проводили анализ чувствительности гипофиза к люлиберину (ЛГ-РГ) и определяли концентрацию ядерных рецепторов половых гормонов в аденогипофизе, участвующих в регуляции

Рис. 1. Концентрация рецепторов Т (а) и Э₂ (б) в гипофизе контрольных самцов крыс (светлые столбики), самцов, получавших СТЗ (заштрихованные столбики) или СТЗ-)-инсу- лин (темные столбики).

flo вертикали — связанный ’Н-гормон в ядерной фракции (в фмоль на I мг ДНК) Звездочка — р<0,001 при сравнении с контрольной группой секреции гонадотропинов по механизму отрицательной обратной связи, у самцов крыс с экспериментальным диабетом, вызванным введением стрептозотоцина (СТЗ).

Материалы и методы

Использовали беспородных половозрелых самцов крыс массой тела 160—190 г, которых содержали в условиях контролируемого температурного режима (22—25 °C) и освещенности (свет с 7 до 19 ч). Интактные животные, получавшие СТЗ, и самцы с экспериментальным диабетом, которым была проведена заместительная терапия инсулином, содержались на стандартной диете, без ограничения потребления пищи и воды.

Диабет вызывали однократным введением внутрибрюшинно СТЗ в дозе 60 мг на 1 кг массы тела в 0,2 мл цитратного буфера pH 4,5. В опыт брали животных, у которых концентрация глюкозы в цельной крови составляла не менее 12 ммоль/л (при уровне у контрольных самцов 3 ммоль/л). Животных забивали и брали материал для исследования на 14-й день эксперимента. У части животных, получавших СТЗ, проводили заместительную терапию инсулином. Пролонгированный препарат инсулина (цинк-инсулин,суспензия) вводили внутримышечно 1 раз в сутки начиная с 14-го дня после введения СТЗ в течение 14 дней. Дозу инсулина подбирали индивидуально до нормализации содержания глюкозы в крови и моче. Концентрацию глюкозы определяли ежедневно глюкозоокси- дазным методом на глюкозиметре «Эксан» и выражали в миллимолях на 1 л. В среднем доза инсулина для 1 животного составляла 16 ЕД на 1 инъекцию.

Животных декапитировали в 9 ч. В одной серии опытов извлеченные гипофизы делили на 2 половинки и по 2 половинки разных гипофизов после взвешивания помещали в инкубационные флаконы с 1 мл среды 199, насыщенной в атмосфере 95% О₂-1-5 % СО₂ (16]. Инкубацию проводили при 37 °C при постоянном встряхивании. После 30 мин среду меняли на свежую и добавляли ЛГ-РГ в дозе 50 нг/мл. Аликвоты по 25 мкл брали каждый час, замораживали до определения ЛГ и ФСГ.

В другой серии опытов аденогипофизы от 45 животных обрабатывали, как описано ранее [1], для получения ядерной фракции. В качестве меченых гормонов использовали 1,2,6,7- ³Н-тестостерон (³Н-Т) и 2,4,6,7- Н-эстрадиол (³Н-Э₂) с высокой удельной активностью (85—104 Ки/мМ). Условия инкубирования меченых стероидов и методика расчета числа специфических связывающих мест были такими же, как в ранее опубликованной работе [3]. Количество связывающих мест в ядрах рассчитывали в фемтомолях на 1 мг ДНК.

В сыворотке крови измеряли содержание ЛГ и ФСГ радио- иммунологическим методом с использованием наборов NIDDK (США). Концентрацию гормонов выражали в нанограммах NIDDK-rLH-RP-З и NIDDK-rFSH-RP-2 соответственно на 1 мл сыворотки крови. У всех групп животных в крови определяли содержание тестостерона (Т) и эстрадиола (Э) наборами для радиоиммунологичсского анализа стерон-Т-1 ²⁵ (Минск) и ESTR-Direct («Сеа-Sorin», Франция). Концентрацию гормонов выражали в нанограммах и пикограммах на 1 мл сыворотки крови соответственно.

Результаты и их обсуждение

Введение СТЗ вызывало достоверное снижение концентрации ядерных рецепторов Т в гипофизе самцов крыс (рис. I). При этом не было различий в числе ядерных Эг-связывающих мест в аденогипофизе контрольных и получавших СТЗ животных. У СТЗ-индуцированных самцов крыс, получавших инсулин, концентрация ядерных рецепторов андрогенов в гипофизе приближалась к таковой у контрольных животных.

Уровень ЛГ и ФСГ в крови крыс, больных диабетом, не отличался от такового у интактных животных (см. таблицу). В экспериментальной группе концентрация Т была снижена, а Э2 — повышена. При компенсаторной терапии инсулином уровень половых гормонов в крови приближался к норме.

В опытах in vitro по .определению чувствительности гонадотрофов аденогипофиза к ЛГ-РГ было показано, что развитие диабета у крыс не влияет на уровень базальной секреции ЛГ в течение всего периода инкубации (рис. 2). Однако ответная реакция на ЛГ-РГ в группе экспериментальных животных наступала в более ранние сроки: увеличение концентрации ЛГ после добавления ЛГ-РГ наблюдали через 1 ч инкубации, хотя по абсолютным значениям это увеличение незначительно отличалось от такового в контрольной группе. Максимальный ответ на ЛГ-РГ был зарегистрирован у контрольных крыс через 3 ч инкубации, тогда как скорость секреции ЛГ у экспериментальных животных не отличалась от базальной.

Таким образом, уровень Т в сыворотке крови снижен у самцов, получавших СТЗ, что согласуется с результатами других авторов [9, 20]. В отношении базального уровня гонадотропинов в крови данные литературы весьма противоречивы. В большинстве работ показано, что уровень ЛГ и ФСГ в крови снижался [9, 20, 21], не изменялся [8, 12], как и в нашем исследовании, или даже повышался [5]. Такое противоречие могло быть обусловлено различиями в линиях крыс и в продолжительности влияния диабета на гипоталамо- гипофизарную систему.

Следовательно, независимо от изменений секреции гонадотропинов уровень циркулирующего Т был снижен у животных с экспериментально вызванным диабетом так же, как у крыс со спонтанным диабетом [17], что предполагает нарушение в отрицательном действии Т на гипоталамо- гипофизарном уровне. В работе [8] показано, что у самцов крыс, получавших СТЗ, изменяется

Рис. 2. Концентрация ЛГ в среде при инкубации аденогипофизов интактных и получавших СТЗ (а) самцов крыс (базальная — 1, 1а и при нагрузке ЛГ-РГ — 2, 2а).

По оси ординат — содержание ЛГ в среде (в нг на I мг гипофиза); по оси абсцисс — время инкубации (в ч). Одна звездочка — р<0,05 при сравнении групп 1а и 2а; две звездочки — р<0,001 при сравнении групп I и 2.

механизм обратной связи, что выражается в ограниченной способности этих животных отвечать на гонадэктомию. После кастрации у таких самцов не наблюдалось увеличения уровня ЛГ в крови. По данным F. Jackson и J. Hutson [14], Т эффективно снижал уровень ЛГ и ФСГ у контрольных животных, а самцы, получавшие СТЗ, не отвечали на введение Т снижением секреции гонадотропинов или поддержанием нормальной массы добавочных половых желез. Неспособность Т ингибировать освобождение гонадотропинов или стимулировать рост половых акцессорных органов у крыс, получавших СТЗ, может указывать на то, что первичная причина дисфункции репродуктивной системы у самцов крыс с экспериментальным диабетом связана с изменением действия или доступностью андрогенов на уровне тканей-мишеней.

Результаты наших экспериментов показали, что уровень ЛГ и ФСГ в крови оставался неизмененным на фоне сниженной концентрации рецепторов андрогенов в гипофизе, что свидетельствует о нарушении механизма отрицательной обратной связи между гонадами и гипофизом. J. Calvo и соавт. [8] также отмечали снижение, но только уровня цитоплазматических рецепторов Т в гипофизе самцов крыс, получавших СТЗ.

Имеющиеся в литературе данные о том, что андрогены действуют специфически в МБГ, модифицируя содержание ЛГ-РГ и секрецию гонадотропинов у самцов крыс [15], позволяют говорить о взаимосвязи измененного ответа гипофиза (снижение его чувствительности к действию ЛГ-РГ) у самцов крыс, получавших СТЗ, и числа андрогенсвязывающих мест. Приведенные выше данные литературы о неспособности Т снижать уровень гонадотропинов у животных, получавших СТЗ, свидетельствуют о влиянии дефицита инсулина на уровне либо гипофиза, либо гипоталамуса. Действительно, в разных работах у интактных самцов крыс с экспериментальным диабетом отмечался и сниженный [7, 8, 19], и неизмененный [18] выброс гонадотропинов после введения гонадотропин-рилизинг-гормона (Гн-РГ). А в работе [13] чувствительность гипофиза к экзогенному Гн-РГ была даже выше у самцов крыс с экспериментальным диабетом по сравнению с контрольными животными. Следует отметить, что повышенную или нормальную чувствительность гипофиза определяли в опытах либо in vivo, либо in vitro, в которых продолжительность воздействия экзогенного Гн-РГ была кратковременной.

Содержание ЛГ, ФСГ, Т и Э₂ в сыворотке крови у контрольных (К) животных, самцов, получавших СТЗ, и СТЗ-индуцированных животных, получавших инсулин (СТЗ+ИНС) (Af+m)

Примечание. В скобках - число животных. Достоверность различий с контрольной группой: одна звездочка — р<0,01, две — р<0,001.

Так как Т посредством своих специфических рецепторов оказывает влияние по механизму отрицательной обратной связи на уровне как гипоталамуса, так и гипофиза, то нарушение этого механизма у самцов крыс, получавших СТЗ, может осуществляться на обоих уровнях. Однако в своей предыдущей работе мы не обнаружили у самцов крыс с экспериментальным диабетом изменений в числе ядерных Т-связывающих мест в МБГ, ответственном за функционирование данного механизма, по сравнению с контрольными животными.

Наши эксперименты in vitro, в которых были использованы гипофизы самцов крыс, получавших СТЗ, представляют прямое доказательство, что ответ гипофиза на физиологическую концентрацию ЛГ-РГ снижен у этих животных. Это может быть связано с нарушением down регуляции рецепторов ЛГ-РГ в гипофизе как процесса, зависимого от повышенной секреции ЛГ-РГ. Например, в работе [6] выявлено снижение уровня рецепторов Гн-РГ и белкового синтеза при нарушении углеводного обмена у крыс, голодавших в течение 4—6 дней.

Следовательно, полученные данные о снижении уровня ядерных рецепторов андрогенов в аденогипофизе и снижении его чувствительности к ЛГ-РГ дают основание предположить, что дисфункция гипофиза может быть основной причиной, изменяющей нейроэндокринную регуляцию репродуктивной функции у самцов крыс с экспериментальным диабетом.

Еще одним доказательством непосредственного влияния инсулина на регуляцию освобождения гонадотропинов из гипофиза могут служить данные Е. Adashi и соавт. [4]. Авторы показали, что обработка инсулином первичной культуры аденогипофизарных клеток проводила к дозозависимому увеличению освобождения ЛГ и ФСГ, стимулированного Гн-РГ. При этом влияние инсулина не зависело от концентрации глюкозы и было специфическим: эпидермальный фактор роста или фактор роста фибробластов не повышал выброс ЛГ.

В настоящей работе концентрация ядерных рецепторов эстрогенов в гипофизе самцов крыс с экспериментально индуцированным диабетом не отличалась от таковой в гипофизе контрольных животных. Ранее [2] мы обнаружили, что ингибирующее действие Э₂ на секрецию ЛГ у самцов крыс не опосредуется через эстрогенные рецепторы аденогипофиза и они, по-видимому, не играют физиологической роли в процессах регуляции.

Хотя и маловероятна, но не исключена возможность, что наблюдаемые различия в концентрации Т в крови и ядерных рецепторов андрогенов в гипофизе между контрольными и получавшими СТЗ крысами могли быть следствием прямого повреждающего действия СТЗ, а не диабета, вызванного введением этого препарата. Однако против такого предположения свидетельствуют данные, что после заместительной терапии инсулином уровень Т в крови и число Т-связывающих мест в гипофизе достигали контрольных значений.

Возможно, что снижение числа связывающих мест для гормонов репродуктивной системы может быть общим явлением, так как некоторые авторы показали подобное снижение ЛГ-связы- вающих мест в клетках Лейдига у получавших СТЗ крыс [10], Т-связывающих мест в предстательной железе [21] и Э₂-связывающих мест в аденогипофизе и гипоталамусе самок крыс [11].

В заключение можно констатировать, что изменение механизма регуляции функции гипоталамо- гипофизарно-гонадальной системы при экспериментальном диабете связано с нарушениями гипофизарного звена, включающими снижение ЛГ-РГ- стимулированного освобождения гонадотропинов и уровня рецепторов Т, что приводит к ослаблению контроля репродуктивной функции по принципу отрицательной обратной связи.

Выводы

1. Уровень ЛГ и ФСГ в крови самцов крыс не изменялся при развитии экспериментального диабета, концентрация Т снижалась.
2. Чувствительность гипофиза к ЛГ-РГ у крыс, получавших СТЗ, резко снижалась при его инкубации более 1 ч.
3. При развитии экспериментального диабета наблюдали снижение концентрации ядерных рецепторов Т в аденогипофизе.
4. Изменения концентрации гормонов в крови и уровня андрогенных рецепторов в гипофизе крыс, получавших СТЗ, восстанавливались при заместительной инсулинотерапии.