Состояние вазопрессин-, окситоцин- и кортиколиберинсинтезирующих структур гипоталамуса при экспериментальном сахарном диабете у крыс различного пола

Применение современных методов исследования позволило установить, что основным местом синтеза кортикотропин-рилизинг-гормона (КРГ) является медиальное мелкоклеточное (ММ) субъядро паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ПВЯГ), на долю которого приходится более 80 % всей продукции гормона [5]. Вазопрессинсинтезирую- щие структуры представлены прежде всего супраоптическим ядром гипоталамуса (СОЯГ) и латеральным крупноклеточным (ЛК) субъядром ПВЯГ, а окситоцинсинтезирующие — передним и медиальным крупноклеточными (ПК и МК соответственно) субъядрами ПВЯГ, а также нейросекреторными клетками СОЯГ [18, 19]. В последнее время появляется все больше работ, показывающих важную роль вазопрессина, окситоцина и КРГ в регуляции углеводного обмена, секреции инсулина, глюкагона и соматостатина [2, 8, 13, 21], пищевого поведения [6, 17], а следовательно, в патогенезе сахарного диабета. Исходя из этого, целью настоящего исследования было комплексное изучение состояния вазопрессин-, окситоцин- и КРГ-синтезирующих структур гипоталамуса и эндокринной части поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете.

Материалы и методы

Исследование проведено на 60 крысах линии Вистар обоего пола, находившихся на стандартном пищевом рационе в условиях естественной оснащенности. Все животные были разделены на 2 экспериментальные группы: 1-я — интактные животные (контроль), 2-я — животные, у которых сахарный диабет моделировали внутрибрюшинным введением стреп- тозотоцина в дозе 50 мг/кг или подкожным введением суспензии букарбана в дозе 6 г/кг (решение о выдаче авторского свидетельства от 23.10.91 по заявке № 4910365/14 от 12.02.91).

Для характеристики состояния эндокринной части поджелудочной железы в крови радиоиммунологическим методом определяли инсулин (РИО-ИНС-^|3|1, СССР), глюкагон (Biodata, Италия) и соматостатин (Incstar, США), а на гистологических срезах толщиной 4 мкм проводили количественное иммуноцитохимическое определение этих же гормонов наборами фирмы «Amersham» (Англия) в (3, а и А-клетках островков Лангерганса методом непрямой иммунофлюоресценции. Концентрацию глюкозы в периферической крови определяли ортотолуидиновым методом и кроме того проводили тест на толерантность к глюкозе (глюкоза 4 г/кг внутрибрюшинно).

О состоянии КРГ- и вазопрессинсинтезирующих нейронов гипоталамуса судили по морфометрическим (объемы клеток, их цитоплазмы, ядер и ядрышек), гистохимическим (содержание РНК, определяемое цитофотометрически на срезах, окрашенных по Эйнарсону галлоцианин-хромо- выми квасцами) показателям, а также по концентрации этих гормонов в периферической крови, определяемой радиоиммунологическим методом с помощью наборов «Peninsula laboratories Inc.» (США) и «Buhlmann laboratories» (Швейцария). Кроме того, в периферической крови определяли концентрацию АКТГ (CIS International», Франция) и кортизола («Стерон-К-^|3|1-М», СССР). Для характеристики оксито- цинсинтезирующих нейронов дополнительно проводили иммуноцитохимическое выявление окситоцина в нейронах ПВЯГ и СОЯГ, а также в срединном возвышении гипоталамуса на срезах толщиной 10 мкм методом непрямой иммунофлюоресценции. Для взятия крови, извлечения мозга и поджелудочных желез животных через 2 и 5 нед после введения диабетогенных препаратов декапитировали, после чего органы

Концентрация глюкозы и гормонов поджелудочной железы крыс в периферической крови и эндокринных клетках островков Лангерганса (М±т)

Примечание. В числителе — показатели у самцов, в знаменателе — у самок. Концентрация соматостатина у самок не определялась. Одна звездочка — р<0,05, две — р<0,01, три —‘ р<0,001.

фиксировали в жидкости Буэна или Карнуа. Перед забоем животные на протяжении 16 ч не получали пищу.

Концентрацию гормонов в крови определяли на бета-счетчике, их содержание в клетках и срединном возвышении на цитофлюориметре «Люмам-И2» (объектив Х40, фотометрируе- мая площадь 125 мкм, длина волны 490 нм, характерная для FITC). РНК в нейронах и их ядрышках на срезах толщиной 4 мкм определяли на микроскопе «Люмам-И2» фотометрической колонкой ФМЭЛ-1А в монохроматическом свете (длина волны 550 нм, объектив Х40, фотометрируемая площадь 125 мкм для клетки и 5 мкм для ядрышка). Содержание гормонов и РНК выражали в условных микроединицах. Все данные подвергали статистической обработке на ПЭВМ «Atari 130 ХЕ» с использованием /-критерия Стью- дента.

Результаты и их обсуждение

Следует отметить, что изменения изучаемых показателей имели примерно одинаковую направленность при обеих моделях сахарного диабета. В поджелудочной железе выявлялись изменения, характерные для заболевания. Концентрация глюкозы увеличивалась (табл. 1), изменялся тест толерантности по диабетическому типу (через 2 ч после введения глюкозы уровень гликемии был достоверно выше исходного, а в контроле — ниже). Концентрация инсулина в крови и его содержание в р-клетках снижались (см. табл. 1), отмечалась деструкция части островков, особенно к концу исследования. Концентрация глюкагона в плазме увеличивалась. Содержание же его в а-клет- ках вначале снижалось, что, по-видимому, связано с его усиленным выведением, а затем значительно нарастало, причем в большей степени у самок, отражая процесс активации биосинтеза и секреции глюкагона. Концентрация соматостатина в плазме увеличивалась, так же как и его содержание в Д-клетках.

В этих условиях наблюдалась выраженная реакция гипоталамических структур. В СОЯГ через 2 нед по данным морфогистохимических исследований наблюдалась значительная активация нейросекреторных клеток, однако через 5 нед происходило некоторое уменьшение морфометрических показателей при одновременном нарастании количества РНК по сравнению с первым сроком (табл. 2). В ЛК-субъядре ПВЯГ изучаемые показатели увеличивались, постигая максимума к концу исследования (см. табл. 2). Таким образом, в реакции вазопрессинсинтезирующих нейросекреторных клеток, представленных СОЯГ и ЛК-субъ- ядром ПВЯГ, отмечались определенные различия, связанные, по-видимому, с особенностями их афферентных и эфферентных проекций. Известно, что СОЯГ и ПВЯГ, развиваясь из единого преоп- тического ядра [3], сохраняют некоторую общность афферентной иннервации [19]. Эфферентные же проекции их различны. Так, нейросекрет из СОЯГ по аксонам поступает во внутреннюю зону срединного возвышения и далее через нейрогипофиз — в общий кровоток [19]. Нейросекрет же ПВЯГ поступает преимущественно в наружную зону, а далее через портальную капиллярную сеть в аденогипофиз [19], оказывая стимулирующее влияние на секрецию АКТГ и соответственно глюкокортикоидов [9]. В наших исследованиях максимальная активация ЛК происходила к концу исследования, когда отмечалось увеличение в крови концентрации АКТГ и кортизола, что соответствует данным литературы о ведущей роли вазопрессина ПВЯГ в контроле аденогипофизарного гормонопоэза [9]. Это предположение согласуется с данными о том, что разрушение ПВЯГ приводит лишь к 10 % снижению концентрации вазопрессина в портальном кровотоке [6], что подчеркивает различие вазопрессинсин- тезирующей системы ПВЯГ и СОЯГ. Следует отметить, что активация вазопрессинсинтезирующей системы гипоталамуса подтверждалась увеличением в периферической крови концентрации вазопрессина (8,80+1,28 пг/мл против 5,53+ +0,49 пг/мл в контроле; р<0,05). Таким образом, наблюдалась прямая корреляция между морфогистохимическими показателями и уровнем гормона в плазме.

Со стороны окситоцинсинтезирующих нейронов ПК и МК отмечены признаки их активации по данным морфогистохимических исследований (см. табл. 2). Концентрация иммунореактивного окситоцина в нейронах ПВЯГ и ОСЯГ у самцов вначале увеличивалась, а именно: 1006,0+23,3 мкЕД против 737,2+21,7 мкЕД в ПВЯГ (р<0,001) и 919,4+20,0 мкЕД против 706,8+27,2 мкЕД в СОЯГ (р<0,001), а затем несколько снижалась (860,1 ±33,9 мкЕД в ПВЯГ, 619,5+20,1 мкЕД в СОЯГ). При этом концентрация гормона в срединном возвышении вначале несколько снижалась (1194,0+23,8 мкЕД против 1300,8+27,8 мкЕД в контроле; р<0,001), а затем увеличивалась (1644,4+33,5 мкЕД против 1300,8+27,7 мкЕД в контроле; р<0,001), что свидетельствовало об активации биосинтеза и секреции гормона. У са-

Морфогистохимические показатели нейросекреторных клеток гипоталамуса крыс (М±т)

Примечание. В числителе — объемы клеток (К) и ядрышек (Я), в знаменателе — содержание РНК (в уел. мкЕД). Звездочка — р<0,01 по сравнению с контролем.

мок изменения концентрации окситоцина имели следующую динамику: вначале происходило ее снижение в ПВЯГ (639,77+29,0 мкЕД против 765,2+23,1 мкЕД в контроле; р<0,01) и срединном возвышении (1559,9+23,1 мкЕД против 1699,9^+35,9 мкЕД в контроле; р<0,01), а затем увеличение (1091,6+22,56 мкЕД в ПВЯГ и 1^11,9^7+31,9 мкЕД в срединном возвышении). В СОЯГ концентрация окситоцина у самок была снижена (572,5+20,5 мкЕД через 2 нед и 656,5+ +25,0 мкЕД через 5 нед против 749,3+ + 17,2 мкЕД в контроле; р<00,001 и р<0,01 соответственно) . Следует также отметить более высокую концентрацию окситоцина в срединном возвышении у самок.

В ММ-субъядре ПВЯГ отмечалась гипертрофия нейронов и их ядрышек, а изменение содержания РНК, как и градиент увеличения морфометрических показателей, имели свою специфику в зависимости от пола животных (см. табл. 2). Концентрация КРГ в плазме возрастала (21,51 + +0,49 пг/мл против 19,81 ±0,62 пг/мл в контроле; р<0,05), прямо коррелируя с морфометрическими показателями, как и концентрация АКТГ (144,6+ +32,8 пг/мл против 58,9+7,6 пг/мл в контроле; р<0,05) и кортизола (14,86+0,88 пг/мл против 9,95+1,17 пг/мл в контроле; р<0,01). Следовательно, в условиях развития экспериментального сахарного диабета имела место активация гипота- ламо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС). Повышение уровня в крови глюкокортикоидов при диабете отмечено и другими авторами как в экспериментальных, так и в клинических условиях [10, 20].

Выявленные нами изменения в нейросекреторной системе гипоталамуса имеют определенное биологическое значение. Так, рядом авторов отмечено повышение концентрации вазопрессина в крови больных сахарным диабетом [16], усиление биосинтеза нонапептидных гормонов при экспериментальном диабете [7], что связывают с активацией гипоталамо-нейрогипофизарной системы в этих условиях [12]. Известно, что вазопрессия обладает способностью стимулировать синтез и секрецию инсулина при концентрации глюкозы более 7 ммоль/л [8], что наблюдалось и в наших исследованиях. Этот же эффект характерен и для окситоцина, который, помимо прочего, влияет на секреторную активность а-клеток и стимулирует гликолиз в печени [2, 21]. Кроме того, вазопрессин и окситоцин дают гипергликемический эффект [2], что имеет значение, так как в условиях дефицита инсулина клетки испытывают недостаток глюкозы. Но это лишь один патогенетический механизм, связанный с ГГНС. Известны и другие, не менее важные механизмы, связанные с КРГ, секреция которого зависит от концентрации глюкозы [15]. КРГ стимулирует секрецию гипоталамического соматостатина [14], тем самым способствуя снижению уровня СТГ, являющегося диабетогенным фактором, а также инсулина, опосредуя свое действие через п. vagus [11, 15]. Кроме того, активация ММ и соответственно усиление синтеза КРГ и повышение его концентрации в гипоталамусе оказывают влияние на пищевой центр, расположенный вблизи ПВЯГ, что приводит к снижению потребления пищи и уровня гли-

кемии [6, 17]. На важность этого механизма указывает И. Г. Акмаев [1]. Таким образом, КРГ в условиях экспериментального сахарного диабета, так же как и вазопрессин и окситоцин, дает ряд эффектов, реализуемых как на уровне гипоталамуса и гипофиза, так и на периферии, что подчеркивает его важное значение в патогенезе заболевания. Кроме того, выявленная специфика состояния изучаемых нами структур гипоталамуса у самцов и самок хорошо согласуется с данными литературы [1, 4] о том, что ПВЯГ принадлежит к сексзависимым структурам мозга, внося свою специфику в регуляцию углеводного обмена в зависимости от пола.

Выводы

1. При экспериментальном сахарном диабете наблюдается тесная взаимосвязь состояния эндокринной части поджелудочной железы и нейросекреторных ядер гипоталамуса, синтезирующих вазопрессин, окситоцин и кортиколиберин.
2. Активация вазопрессин-, кортиколиберин- и окситоцинсинтезирующих нейронов субъядер ПВЯГ и СОЯГ по данным морфогистохимических исследований сопровождается увеличением в крови концентрации вазопрессина, кортиколибе- рина, АКТГ и кортизола, а также окситоцина в срединном возвышении гипоталамуса.