Взаимоотношения гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и пептидергической систем гипоталамуса у животных с экспериментальным сахарным диабетом

Известно, что кортикотропин-рилизинг-фактор (КРФ) синтезируется в основном в медиальном мелкоклеточном субъядре паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ММ ПВЯ) [7]. По классическим представлениям, состояние синтетической и секреторной активности этих нейронов прежде всего зависит от уровня в крови глюкокортикоидов и АКТГ, а также ряда метаболитов, в частности глюкозы [24]. Известно также, что КРФ сам по себе является мощным регулятором аппетита [8] и секреции инсулина [20]. В последние годы показана важная роль в регуляции состояния гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС), ее центрального звена, группы регуляторных нейропептидов, синтезирующихся в нейронах ММ ПВЯ, тем более, что именно эти пептидергические нейроны содержат рецепторы к глюкокортикоидам [12]. Кроме того, установлено [10], что КРФ и ряд нейропептидов синтезируются в одних и тех же нейронах. Учитывая эти сведения, мы решили изучить взаимоотношения ГГНС и группы регуляторных нейропептидов, синтезирующихся в зоне ММ ПВЯ, при сахарном диабете у крыс линии Вистар для выяснения их возможной роли в патогенезе данного заболевания и регуляции эндокринной функции поджелудочной железы.

Материалы и методы

Исследования проведены на 36 крысах-самцах линии Вистар массой 230—250 г в осенне-зимний период. Животные находились в условиях естественного освещения, на стандартном рационе питания и были разделены на три экспериментальные группы (по 10—12 крыс в каждой): 1-я группа — контрольная, 2-я группа — животные с сахарным диабетом продолжительностью 15 дней, 3-я группа — животные с продолжительностью заболевания 36 дней. Сахарный диабет (легкое течение) моделировали при помощи введения стрептозотоцина (50 мг/кг в 0,5 мл цитратного буфера внутрибрюшинно) |1|. Контрольным животным вводили 0,5 мл нитратного буфера внутрибрюшинно. Определение глюкозы и тест толерантности, а также забой животных для извлечения органов и взятия крови проводили в 10 ч после 16часового голодания животных. Концентрацию глюкозы в крови определяли ортотолуидиновым методом. Состояние ГГНС оценивали с помощью радиоиммунологического определения в периферической крови концентраций КРФ, АКТг, кортикостерона и кортизола наборами RENINSULA LABORATORIES INC (США), CIS INTERNATIONAL (Франция), РИН-В-³Н (СНГ) и СТЕРОН-К-¹²⁵1 (Беларусь) соответственно, а также по данным морфогистохимических (площади нейронов и их ядрышек и содержание в них нуклеиновых кислот) исследований нейронов ММ ПВЯ.

Для изучения системы регуляторных нейропептидов использовали метод непрямой иммунофлюоресценцин. Для идентификации иммуноположительных нейронов животным (не менее 4 из каждой экспериментальной группы) вводили 120 мкг колмшина в 20 мкл физиологического раствора на 100 г массы тела под эфирным наркозом за 48 ч до забоя с целью блокирования аксоплазматического транспорта нейропептидов в левый латеральный желудочек микроинъектором с помощью стереотаксического прибора. Контролем служили интактные животные и крысы с различными сроками заболевания сахарным диабетом, которым вместо колхицина вводили физиологический раствор в том же объеме или же проводили такую же операцию, но без введения объема жидкости. В качестве первичных антител применяли кроличьи антисыворотки к холенистокннину (ХЦК), вазоактивному интестинальному пептиду (ВИП), бомбезину (Б), нейротензину (HT), кальцитонин-ген-родственному пептиду (КГРП), лей- и мет-энкефалшу (л- и м-ЭНК) производства фирмы "Атег- sham" (Англия), а вторичных — козьи IgG, конъюгированные с FITC ("Amersham", Англия). Время инкубации серийных срезов гипоталамуса толщиной 12 мкм с первичными антителами составляло 48 ч на холоду, а со вторичными — 45 мин, после чего срезы изучали под микроскопом. Для исследования каждого пептида использовали по 5—6 срезов из различных отделов ММ ПВЯ.

Изучение распределения иммуноположительных нейронов в зоне ММ ПВЯ и их количества, определение содержания в них нейропептидов проводили на компьютерной цитофлюориметрической системе на базе микроскопа ЛЮМАМ- И2 по описанной ранее методике [1]. Содержание пептидов в нейронах, прямо пропорциональное интенсивности флюоресценции, выражали в условных микроединицах (уел. мкед).

Для морфогистохимических исследований гипоталамус крыс фиксировал! в жидкости Карнуа, а затем после стандартной гистологической обработки готовили срезы толщиной 4 мкм и окрашивали их для выявления нуклеиновых кислот галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону [4]. Изучение препаратов как в видимом спектре, так и спектре флюоресценции проводили также на компьютерной системе анализа изображения VIDAS-2.5 ("Zeiss-kontron-elektronik", Германия), связанной посредством высокочувствительной телекамеры COHU 4722 (США) с микроскопом AXIOSKOP ("Zeiss”, Германия). Все полученные данные обрабатывали статистически с применением /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

После введения животным стрептозотоцина отмечались характерные для сахарного диабета изменения в виде гипергликемии, нарушения теста толерантности к глюкозе, деструкции островков Лангерганса, гипоинсулинемии, гипер- глюкагон-гиперсоматостатинемии, описанные нами в предыдущих работах [1—3].

В ММ ПВЯ отмечалось увеличение площади нейронов и увеличение содержания в них нуклеиновых кислот (табл. 1). В плазме крови возрастала концентрация КРФ (21,51 ± 0.49 пг/мл против 19,81 ± 0,62 пг/мл в контроле; р < 0,05), АКТГ (144,6 ± 32,7 пг/мл против 58,9 ± 7,69 пг/мл в контроле; р < 0,05), кортикостерона (271,4 ± 34,0 Пг/мл против 72,8 ± 4,56 пг/мл в контроле; р < 0,001) и кортизола (14,86 ± 0,88 нг/мл против 9,95 ± 1,17 нг/мл в контроле; р < 0,001). Таким образом, при развитии сахарного диабета повышалась активность ГГНС, что отмечено и другими авторами в условиях как эксперимента, так и клиники [15, 22].

Таблица 1

Морфогистохимические показатели состояния нейросекреторных клеток ММ ПВЯ при сахарном диабете (М ± т)

Примечание. В числителе — морфометрические показатели, в знаменателе — содержание нуклеиновых кислот. Здесь и в табл. 2 достоверность различий к контролю: одна звездочка — р < 0,005, две — р < 0,001.

Вместе с тем обращали на себя внимание особенности состояния ГГНС в этих условиях, которые проявлялись в том, что, несмотря на высокий уровень глюкокортикоидов и АКТУ. торможения активности КРФ-синтези- рующих нейронов не наблюдалось. Не влияло на состояние ГГНС и развитие гипергликемии, которая, как известно, также тормозит секрецию КРФ в гипоталамусе [24]. Особенности состояния ГГНС при сахарном диабете у экспериментальных животных и людей в виде нарушения чувствительности центральных звеньев этой системы как к стимулирующим, так и к угнетающим влияниям отмечены и другими авторами [9, 17]. Вместе с тем, при данной патологии, как показано рядом исследователей, возрастает чувствительность ГГНС к другим стимулирующим влияниям, например, к окситоцину [25]. Анализ наших собственных данных и литературных сведений о состоянии ГГНС при сахарном диабете позволяет предположить, что в условиях сахарного диабета изменяется принцип функционирования ГГНС и в регуляцию ее состояния включаются новые факторы, например, катехоламины и пептидергическая система. Подтверждением этого предположения стали результаты наших исследований нейропептидов в зоне ММ ПВЯ.

Без предварительного введения колхицина пептидсодержащие нейроны не идентифицировались. На этот процесс не влияли также операция или введение в латеральный желудочек физиологического раствора. После введения колхицина у интактных животных в зоне ММ ПВЯ в количественном отношении преобладали ХЦК-иммуноположительные нейроны (табл. 2), а максимальное содержание в клетке нейропептида было характерно для НТ.

У животных 2-й экспериментальной группы с длительностью заболевания 15 дней реакция пептидергической системы в зоне ММ ПВЯ была неоднозначной. Значительно возрастало количество идентифицированных НТ и КГРП-им- муноположительных нейронов, хотя содержание в них самих нейропептидов достоверно уменьшалось (см. табл. 2). В то же время концентрация этих нейропептидов в срединном возвышении гипоталамуса, так же как и количество иммунореактивных волокон, значительно возрастало, отражая процесс активной их секреции из нейронов. Количество идентифицированных ХЦК-, л-ЭНК и Б-иммуноположительных нейронов в этот период уменьшалось, а м-ЭНК и ВИП-иммуноположительных нейронов практически не изменялось. При этом содержание в клетках этих нейропептидов достоверно увеличивалось, так же как количество иммунореактивных волокон в срединном возвышении и концентрация в них нейропептидов.

Дальнейшее развитие сахарного диабета вызывало к 36-му дню значительное (в несколько раз) увеличение количества идентифицированных иммуноположительных нейронов, содержащих изучаемые нейропептиды, по сравнению как с контролем, так и с предыдущим сроком (см. табл. 2). Однако содержание в клетках нейропептидов в основном снижалось, за исключением уровня л-ЭНК и Б, который был достоверно увеличен по сравнению с контролем, но не с предыдущим сроком развития диабета. В срединном возвышении снижалась концентрация НТ, КГРП и ХЦК, по сравнению с предыдущим сроком, оставаясь достоверно выше, чем в контроле. Концентрация же л-, м-ЭНК и Б в срединном возвышении увеличивалась еще в большей степени, отражая процесс активной секреции этих пептидов.

Таблица 2

Содержание нейропептидов в нейронах ММ ПВЯ (1) и срединном возвышении (2) гипоталамуса крыс (М ± т)

Примечание. В числителе — содержание нейропептидов (в усл. мкед), в знаменателе — количество идентифицированных нейронов и иммунореактивных волокон.

Проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что развитие сахарного диабета характеризуется повышением активности ГГНС на всех уровнях. При этом в процесс регуляции ее центрального звена — КРФ-синтсзируюших нейронов, а также передней доли гипофиза — активно вовлекается пептидергическая система гипоталамуса, о чем свидетельствуют приведенные выше данные.

Возникает естественный вопрос о значении выявленных нами изменений ГГНС и пептидергической системы гипоталамуса.

В работах S. СессаТеШ и соавт. |10] показано, что изучаемые нами нейропептиды локализованы преимущественно в КРФ-синтезирующих нейронах ММ ПВЯ, что уже само по себе предполагает их участие в регуляции состояния ГГНС. Кроме того, установлено [14, 18, 19], что нейроны ММ ПВЯ, в которых идентифицируются л- и м-ЭНК, ВИП, КГРП, нейротензин, направляют свои аксоны в наружную и в меньшей мере во внутреннюю зоны срединного возвышения, откуда пептиды попадают в переднюю долю гипофиза, принимая участие в регуляции его гормональной функции. В частности, волокна, содержащие энкефалины и КГРП, имеют тесные контакты с кортикотропоцитами гипофиза |14, 19], что свидетельствует об их роли в регуляции секреции АКТГ. С другой стороны, эти факторы могут самостоятельно или опосредовано оказывать влияние на процессы, имеющие отношение к регуляции углеводного обмена и эндокринной функции поджелудочной железы.

Известно, что в условиях нормы основными регулятором функции В-клеток являются глюкоза и некоторые аминокислоты. Влияние же других факторов, таких, как нервная и эндокринная система, нейропептиды и медиаторы, невелико. Однако в условиях патологии (сахарный диабет) и действия чрезвычайных факторов (стресс) их эффекты значительно возрастают, что подчеркиваю!' в своих обзорах В. П. Федотов и соавт. [5], Е. Widmaier |26], а также показано в наших работах |4, 5]. При этом они могут действовать на процессы синтеза и секреции инсулина, на его взаимодействие с рецепторами, на метаболизм глюкозы и липидов, а также синтез и секрецию контринсулярных гормонов. О возможной роли нейропептидов в регуляции ГГНС мы уже говорили выше. Однако эффекты КРФ не ограничиваются его влиянием на переднюю долю гипофиза. ' Данные литературы показывают [8, 20], что этот нейрогормон является мощным регулятором аппетита и обладает способностью стимулировать секрецию инсулина. Установлено [11], что КГРП, синтезируясь в ММ ПВЯ, оказывает влияние на синтез АКТГ и СТГ в аденогипофизе. При этом данный нейропептид вызывает развитие инеулинорезистентности, а также ряд контринсулярных эффектов, характерных для глюкокортикоидов. Такие пептиды, как ВИП, ХЦК, м-ЭНК, могут оказывать прямое стимулирующее действие на секрецию инсулина [6, 11, 16], а НТ аналогичное действие может осуществлять через n. vagus [13], влияния которого на состояние В-клеток хорошо известны. В свою очередь Б оказывает защитное действие на В- клетки в ответ на влияние диабетогенных факторов как m vivo, так и in vitro [21].

Следовательно, реализация эффектов нейропептидов на уровне гипоталамуса и гипофиза, а также на уровне периферии может иметь своим следствием развитие как патологических, так и компенсаторных механизмов при сахарном диабете, знание которых в перспективе позволит использовать эти факторы с целью коррекции данного заболевания.

Выводы

1. Развитие экспериментального сахарного диабета характеризуется повышением активности ГГНС, что проявляется гипертрофией нейронов ММ ПВЯ и их ядрышек, а также увеличением в _г крови концентрации КРФ, АКТГ и глюкокортикоидов.
2. У животных с экспериментальным сахарным диабетом отмечаются выраженные изменения состояния пептидергической системы в зоне ММ ПВЯ и срединном возвышении гипоталамуса, что свидетельствует об ее участии в патогенезе данного заболевания.

*Изучение распределения нейропептидов у животных выполнено по гранту N UDE000 Международного научного фонда Дж. Сороса.