Атерогенный потенциал сыворотки крови больных сахарным диабетом 1 типа

Для сахарного диабета (СД) характерно преждевременное развитие атеросклеротических поражений сосудов, что обусловливает высокую степень инвалидизации и смертности больных [5]. Причина ускоренного развития атеросклероза при СД не установлена. Ряд авторов придерживаются так называемой «инсулиновой» гипотезы, считая, что гиперинсулинемия является основным фактором, способствующим развитию атеросклероза [12, 13]. В многочисленных эпидемиологических исследованиях продемонстрировано, что повышенный уровень эндогенного инсулина является независимым фактором риска атеросклероза [3]. Выявлено атерогеноподобное действие инсулина на артерии экспериментальных животных [11]. В то же время в других исследованиях атерогенного действия инсулина не обнаружено [6, 7]. Таким образом, роль инсулина в атерогенезе не выяснена окончательно. Особый интерес представляет изучение влияния экзогенного инсулина на развитие атеросклероза у больных СД I типа, постоянно полу-, чающих инъекции инсулина.

Основным проявлением ранних атеросклеротических изменений является накопление липидов в клетках сосудистой стенки. В 1985 г. A.Orechov и соавт. ]9] предложили в качестве экспериментальной модели атеросклероза первичную культуру гладкомышечных клеток интимы аорты человека. На этой модели было показано, что сыворотка крови больных коронарным атеросклерозом в отличие от сыворотки крови здоровых лиц обладает атерогенностью, т. е. способностью вызывать накопление липидов в культивируемых клетках [2]. Позднее в исследовании на культуре мышиных перитонеальных макрофагов было установлено, что у больных СД I и II типа сыворотка крови также вызывает накопление внутриклеточных липидов, даже если отсутствует сопутствующий коронарный атеросклероз [10].

Цель данной работы — изучение влияния экзогенного инсулина на атерогенный потенциал сыворотки крови больных СД I типа. Исследованы зависимость атерогенного потенциала сыворотки крови больных СД I типа от суточной дозы инсулина и длительности его применения и влияние экзогенного инсулина на основные атеросклеротические проявления в тканевых культурах — содержание внутриклеточного холестерина (ХС) в культивируемых клетках и их пролиферативную активность.

Материалы и методы

Обследованы больные СД 1 типа. Диагноз был подтвержден данными анамнеза заболевания, клинического обследования, при необходимости результатами исследования базальной и стимулированной секреции С-пептида. Больные находились в состоянии удовлетворительной компенсации, о чем судили по содержанию гликозилированного гемоглобина HbAlc в крови.

Атерогенность сывороток крови в зависимости от дозы инсулина исследовали у 41 больного СД 1 типа в возрасте 16—50 лет (20 женского, 21 мужского пола) и у 34 детей с СД I типа в возрасте 5—15 лет (15 девочек, 19 мальчиков).

Длительность заболевания у взрослых больных в среднем составила 9,7±1,2 года. Средний уровень HbAlc был равен

Содержание сахара в крови и атерогенность сыворотки крови больных с вновь выявленным СД I типа в первый день назначения инсулина.

По оси абсцисс — время, ч; по осям ординат: слева — атерогенность сыворотки крови. % от контроля (а), справа — содержание сахара в крови, ммоль/л (б). Стрелки — введение инсулина. Звездочка —достоверное отличие показателя от контроля.

Таблица 1

Таблица 3

Отсутствие влияния инсулина на содержание внутриклеточного ХС в перитонеальных макрофагах и гладкомышечных клетках аорты человека и на включение меченого тимидина в ДНК ядер гладкомышечных клеток

Отсутствие влияния инсулина на атерогенный эффект сыворотки в гладкомышечных клетках аорты человека (М±т)

Концентрация инсулина в МПМ. мкед/мл

Содержание внутриклеточного ХС в МПМ, мкг/мг клеточного белка

Концентрация инсулина в ГК. мкед/мл

Содержание внутриклеточного ХС в ГК. мкг/мл клеточного . белка

DPM/мкг клеточного белка

1

2

3

4

105±4

105±5

100±9

102±8

160±9*     160± 15*

190±11* 189±12*

108 ±9

109+4

164±16* 200±13*

103±5

110±5

171 ±12*

199± 12*

110 ±6

108+9

172± 11*

189+ 10*

Примечание. МИМ — мышиные перитонеальные макрофаги; ГК — гладкомышечные клетки.

7,0±0,5 % (норма 5,2±0,1 %), ХС — 4,6±0,2 ммоль/л (норма 4,4±0,2 ммоль/л), триглицеридов — 1.3±0.1 ммоль/л (норма 1,2 ±0,9 ммоль/л). В группе взрослых было 3 человека с впервые выявленным СД I типа (длительность диабета не более 2 мес).

Среди больных детей по длительности заболевания были выделены 2 группы: 1-я — заболевшие недавно (20 больных с длительностью заболевания 1,8±0,2 года); 2-я — длительно болеющие (14 детей с длительностью заболевания 7,5±0,6 года). Средний возраст составил в 1-й группе 9,9± ±0,6 года, во2-й — 12±0,7 года. Средний уровень фруктозами- на был равен в этих группах соответственно 21 ±0,7 и 18± ±0,4 нмоль/л (норма 17,2±0,5 нмоль/л).

При проведении экспериментальной части работы использовали кровь 16 больных СД I типа в возрасте 40—50 лет (8 мужчин, 8 женщин).

Для исследования влияния экзогенного инсулина на рост и пролиферацию клеток применили культуры перитонеальных макрофагов мышей и гладкомышечных клеток интимы аорты человека.

С целью выделения перитонеальных макрофагов использовали мышей линии BalB/С [I]. Перитонеальный смыв центрифугировали, клеточный осадок ресуспендировали в ростовой среде 199, содержащей 10 % бычьей фетальной сыворотки (БФС) и антибиотики. Клетки помещали в стерильную тест-систему в концентрации 200 000/см², затем инкубировали при 37 °С в течение 3 ч в СОг-инкубаторе с влажностью 100 %. После смены среды к клеткам добавляли бычий кристаллический инсулин («Sigma», США) в концентрациях 10, 10^г, 10³ и 10⁴ мкед/мл и клетки инкубировали 4 ч. Атерогенность сывороток крови определяли по накоплению внутриклеточного ХС при инкубации перитонеальных макрофагов в среде 199, содержащей 10 % сыворотку и инсу-

Таблица 2

Отсутствие влияния инсулина на атерогенный эффект сыворотки в мышиных перитонеальных макрофагах (М±ш)

* Достоверное накопление внутриклеточного ХС (р<0,05).

* Достоверное отличие от контроля (р<0,05).

лин в концентрациях 10, 10® I0³ и 10⁴ мкед/мл, в течение 4 ч. Контрольные клетки культивировали в среде 199 с 10 % БФС без инсулина.

Гладкомышечные клетки интимы аорты человека выделяли из не пораженной атеросклерозом аорты человека с помощью коллагеназы и культивировали в среде 199 с 10 % БФС. На 7-й день культивирования добавляли ³Н-тимидин в концентрации 0,015 мкСи/йл и инсулин в концентрациях 10³, 10⁴, 10⁵ и 10⁶ мкед/мл. Атерогенный эффект сывороток определяли по накоплению внутриклеточного ХС при инкубации клеток в среде 199, содержащей 10% сыворотку больных, ³Н-тимидин и инсулин в указанных выше концентрациях. Контрольные клетки культивировали в среде 199 с 10 % БФС, ³Н-тимидином без добавления инсулина.

Содержание внутриклеточного ХС определяли с помощью наборов «Boehringer Mannheim» (ФРГ) [4|. Клеточный белок исследовали по Lowry [8|.

Достоверность различий средних величин определяли с помощью параметрического метода (двусторонний /-тест Стью- дента).

Результаты и их обсуждение

Средний уровень атерогенности у взрослых составлял 167±10 % от контроля (р<0,05), средняя доза инсулина — 29,7+3,0 ед. в день, у детей — соответственно 160±11 % (р<0,05) и 29,9±3,0 ' ед. в день. Не выявлено корреляции атерогенности сыворотки крови с дозой инсулина (р>0,1) и с длительностью его применения (р>0,1).

Кроме того, исследовали влияние впервые назначенной инсулинотерапии на атерогенные свойства сыворотки крови у 3 больных с вновь выявленным СД I типа. Инсулинотерапия была интенсивной. Первое введение инсулина (6—8 ед.

Таблица 4

Влияние сыворотки крови и экзогенного инсулина на включение меченого тимидина ядрами гладкомышечных клеток аорты человека

Концентрация инсулина, мкед/мл

Контроль 16±3 actrapid НМ, Дания) было внутривенным капельным. Последующие подкожные инъекции инсулина короткого действия (8—12 ед.) проводили под контролем уровня сахара в крови каждые 3—4 ч (вторая инъекция была сделана через 10 мин после внутривенного введения инсулина). На следующий день больные были переведены на 4-разовый режим инсулинотерапии с введением инсулина короткого действия перед завтраком, обедом, ужином и инсулина пролонгированного действия (Humulin N, США) на ночь. Уровни атерогенности сыворотки крови.определяли в первый день инсулинотерапии через 5, 30 мин, 2, 6 и 12 ч после назначения инсулина, а также на 2, 7 и 21-й дни инсулинотерапии. У всех 3 больных до начала инсулинотерапии имелся выраженный атерогенный потенциал, что проявлялось в 1,6—2,2- кратном накоплении ХС в культивируемых макрофагах. В течение первых 12 ч инсулинотерапии (средняя доза 44±3 ед. в день) атерогенность сыворотки крови не изменялась, уровень сахара в крови снизился с 20,0±0,2 до 10,5± ±0,1 ммоль/л (см. рисунок). В последующие 3 нед инсулинотерапии (средняя доза 32± ±3 ед. в день) атерогенность сыворотки крови не изменялась.

Таким образом, атерогенность сыворотки крови больных СД I типа как у взрослых, так и у детей не коррелирует с дозой инсулина и длительностью его применения. Назначение инсулина больным с вновь выявленным СД 1 типа не влияет на атерогенный потенциал сыворотки крови.

Данные, полученные в клинике, были подтверждены в эксперименте. На этом этапе работы исследовали влияние инсулина на рост и пролиферацию клеток в тканевых культурах. Изучали также влияние экзогенного инсулина на атерогенный потенциал сыворотки крови больных СД

• типа.

Добавление инсулина в культуральную среду в концентрациях, указанных в табл. 1, не влияло на содержание общего ХС в перитонеальных макрофагах и гладкомышечных клетках интимы аорты человека. Не отмечено и влияния на включение меченого тимидина в ДНК ядер клеток (см. табл. 1).

Было исследовано влияние сыворотки крови 12 больных СД 1 типа на содержание внутриклеточного ХС в перитонеальных макрофагах. 6 сывороток влияли на содержание внутриклеточного ХС, т. е. увеличивали на 50—80 % содержание общего ХС в клетках, остальные оказались неатерогенными. Добавление в культуральную среду одновременно с исследуемыми сыворотками экзогенного инсулина (бычий кристаллический, «Sigma», США) ни в одном случае не влияло на атерогенный эффект сыворотки (табл. 2).

Было исследовано влияние 4 сывороток крови больных СД I типа на содержание ХС в гладкомышечных клетках аорты человека и на включение ³Н-тимидина клетками. 2 сыворотки не влияли на содержание внутриклеточного ХС,

• другие повышали на 50—80 % общий ХС в клетках, т. е. оказались атерогенными. Добавление инсулина одновременно с исследуемыми сыворотками ни в одном случае не влияло на атерогенный эффект (табл. 3). Неатерогенные сыворотки не увеличивали включение меченого тимидина в гладкомышечные клетки. Из 2 атерогенных сывороток одна вызывала увеличение включения ³Н-тимидина (ДРМ/мкг клеточного белка), другая не вызывала (табл. 4). Добавление инсулина не влияло на включение ^-тимидина.

Таким образом, инсулин не влиял на содержание внутриклеточного ХС в культивируемых клетках и их пролиферативную активность (на включение меченого тимидина в ДНК ядер клеток). Половина сывороток вызывала накопление ХС в перитонеальных макрофагах мышей и гладкомышечных клетках непораженной интимы аорты человека. Добавление экзогенного инсулина как в физиологических, так и в значительно более высоких концентрациях не влияло на атерогенный эффект сывороток.

Итак, было установлено, что инсулин не влияет на основные атеросклеротические проявления на клеточном уровне — содержание внутриклеточного ХС в культивируемых клетках и их пролиферативную активность. Не влияет он и на атерогенный потенциал сыворотки крови больных СД 1 типа.

Ранее были проведены экспериментальные исследования на животных по изучению влияния инсулина на развитие атерогеноподобных изменений сосудов. В ряде работ отмечается стимулирующее действие инсулина на рост и пролиферацию культивируемых клеток [11 —13). В то же время мы нашли 2 работы, в которых не выявлено атерогенного действия инсулина [6, 7].

1. R. Stout [11 —13] показал ростстимулирую- щее действие инсулина на культивируемые гладкомышечные клетки аорты обезьян. Т. Ledet [7J объяснил этот эффект нефизиологическими дозами инсулина (10 , 10³, 10⁴ мкед/мл). В других экспериментах R. Stout и соавт. исследовали действие инсулина на рост клеток в культуре содержащей 1 % сыворотку крови больного диабетом. Можно предположить, что инсулин был эффективен в этом случае потому, что до добавления его клетки культивировались в среде с очень низким содержанием сыворотки. Т. Ledet, использовав более близкие к физиологическим дозы инсулина (2,5—100 mU/мл), не обнаружил усиления роста клеток из медии артерий. G. King и соавт. [6] отметили минимальное стимулирующее влияние инсулина на рост культивируемых эндотелиальных и гладкомышечных клеток аорты и незначительное включение ³Н-тимидина в ДНК ядер эндотелиальных и гладкомышечных клеток аорты, но при этом потребовалась весьма вы- - сокая доза инсулина.

Результаты настоящего исследования позволяют заключить, что инсулин не оказывает непосредственного атерогенного действия на уровне артериальных клеток, т. е. не влияет на содержание внутриклеточных липидов, а также на включение ³Н-тимидина в ДНК ядер клеток. Полученные данные не подтверждают прямую роль экзогенного инсулина в ускоренном формировании атеросклеротических поражений при СД.

По клиническим и экспериментальным данным, экзогенный инсулин не влияет на атерогенность сыворотки крови больных СД I типа. Вопрос о роли эндогенного инсулина в атерогенезе остается открытым.

Выводы

1. Атерогенность сыворотки крови больных сахарным диабетом (СД) I типа не связана с дозой экзогенного инсулина и длительностью его применения. Назначение инсулина больным с вновь выявленным СД I типа не влияет на атерогенный потенциал сыворотки крови.

Инсулин не влияет на рост и пролиферацию клеток в тканевых культурах.

[*] Достоверное повышение включения меченого тимидина ядрами клеток (р<0,05).