Влияние азатиоприна на иммунологические показатели у больных с впервые выявленным инсулинзависимым сахарным диабетом

Гипотеза аутоиммунной природы разрушения р-клеток поджелудочной железы при инсулинзависимом сахарном диабете (ИЗСД) предполагает возможность проведения иммуносупрессивной терапии [7, 10]. Нельзя исключить также вероятность того, что развитие поздних осложнений, приводящих к снижению качества и продолжительности жизни больных, в определенной степени обусловлено аутоиммунными процессами. В этой связи необходимо изучение вопроса о целесообразности включения в комплексную терапию больных ИЗСД различных иммуносупрессивных препаратов. Наш интерес к азатиоприну обусловлен его воздействием на ранних стадиях заболевания на инсулиновую секрецию, улучшение метаболического контроля, повышение секреции С-пептида, что создает предпосылки для дальнейшего клинического изучения этого препарата при ИЗСД. Привлекает внимание сообщение об успешном применении азатиоприна в комбинации с тимическим экстрактом (соответственно 2 мг/кг в сутки и 100 мг 1 раз в неделю) при лечении больных ИЗСД в течение 6-16 мес [11]. Полная ремиссия развилась у 6 из 7 больных при проведении иммунотерапии через 25±9 дней после начала инсулинотерапии и только у 1 из 9 больных при начале иммунотерапии через 20±13 мес после постановки диагноза. Ремиссия сопровождалась повышением секреции С-пептида в ответ на оральную нагрузку глюкозой. У 3 больных из второй группы наблюдалась частичная ремиссия с небольшим повышением содержания С-пептида в сыворотке крови. Результаты показывают, что патологический процесс разрушения р-клеток может быть остановлен применением азатиоприна, только если лечение назначено в самый ранний период после начала заболевания. При лечении азатиоприном детей с впервые выявленным ИЗСД [8] уровень С-пептида в плазме натощак был существенно выше через 3 и 6 мес, а частичная ремиссия наблюдалась более длительный период по сравнению с контрольной группой, получавшей плацебо. Иммуносупрессивная терапия азатиоприном в комбинации с преднизолоном в течение 1 года дала хорошие результаты метаболического контроля (снижение уровня гликозилированного гемоглобина НЬАк, повышение содержания стимулированного С-пептида, снижение дозы инсулина) у 50 % получавших эту терапию по сравнению с 15 % в контрольной группе. Иммуносупрессивный эффект зависел от исходного метаболического статуса (при лучших начальных показателях эффект выше) [13]. Кроме того, азатиоприн в представленных исследованиях не вызвал существенное изменение гематологических и биохимических показателей. Мы изучали влияние терапии азатиоприном больных с впервые выявленным ИЗСД на показатели клеточного и гуморального иммунитета, состояние углеводного обмена, секрецию С-пептида, частоту клинической ремиссии. Кроме того, ставилась задача проследить возможную связь ремиссии с полом, возрастом, длительностью диабета, исходным метаболическим и иммунным статусом. Материалы и методы У 20 пациентов (12 мужчин и 8 женщин) в возрасте от 16 до 32 дет с клиническим диагнозом впервые выявленного ИЗСД была проведена терапия азатиоприном через 15,6±4,2 нед после установления диагноза и 18,2±4,9 нед после начала классических симптомов. Исключающими фак- Таблица 1 Показатели гематологического и биохимического контроля на фоне терапии азатиоприном у больных ИЗСД (М±т) Показатель Срок после начала лечения азатиоприном 0-3 мес 3 мес 6 мес Лейкоциты, -109/л 6,4=± 1,1 6,51 ±0,74 6,38±0,83 Тромбоциты, • 109/л 230,8+ 12,7 253±18,4 250± 17,0 Гемоглобин, г/л 162,0±5,6 159,5±6,00 ^^(^,0^5,9 Креатинин, мкМОЛЬ/л 73,1 ±4,5 74,1 ±4,27 74,0±3,9 Билирубин (общий), ммоль/л 14,5± 1,03 17,8±0,85 17,9+0,93 Аспартатаминотрансфераза, ME 15,3±0,95 16,8 + 1,16 17,0 ± 1,02 Аланинаминотрансфераза, ME 15,6± 180 Г7,(^=±2,38 17,2=± 1,3 торами для проведения этой терапии были заболевания печени, почек, наличие инфекции, неудовлетворительные показатели картины периферической крови, выраженное снижение функциональной активности компонентов комплемента, снижение общего числа Т- и В-лимфоцитов и любые другие условия, при которых это могло бы нанести какой-либо вред (беременность, отсутствие возможности контроля и т. д.). Контрольную группу составили 18 больных, сходных по возрасту, полу, длительности заболевания. Все пациенты получали инсулинотерапию в среднесуточной дозе 0,47+0,05 и 0,53+0.14 ЕД/кг в сутки (соответственно обследуемая и контрольная группы). После предварительного обследования, включавшего оценку показателей углеводного обмена, С-пептида, антител к инсулину, системы комплемента, параметров клеточного иммунитета, назначался азатиоприн в дозе 2 мг/кг в сутки в течение 6 мес. В 3-месячные интервалы секреция инсулина контролировалась по уровню С-пептида. Содержание С-пептида определяли радиоиммунологическим методом с использованием стандартного тест-набора фирмы «Ново» (Дания). Гемолитическую активность компонентов классического пути Cl, Clq, С2, СЗ, С4, С5 и СН50 в сыворотке крови измеряли по стандартной методике [3] с использованием микропанелей для титрования и реагентов для определения индивидуальных компонентов комплемента по их гемолитической активности производства «Реаком» Кировского НИИ гематологии и переливания крови. Определяемый титр (Т) каждого компонента комплемента численно соответствует номеру лунки половинного лизиса сенсибилизированных эритроцитов барана и соотносится с разбавлением сыворотки и с числом эффективных молекул на 1 мл исходной сыворотки соответственно как 1:2т+1 и 3-107-2т+2. Дробные значения титров получались при определении средних арифметических значений. Активность СЬингибитора определяли методом иммуноферментного анализа, основанного на способности С1-ингибитора специфически взаимодействовать с Cls- субкомпонентом Cl-компонента системы комплемента. Уровень С1-ингибитора определяли методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием моноспецифиче- ской антисыворотки к С 1-ингибитору, уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) - методом иммуноферментного Clq-связывающего анализа, основанного на способности Clq- субкомпонента С1-компонента комплемента неспецифически связывать ЦИК, содержащиеся в сыворотке крови. Антитела к инсулину выявляли иммуноферментным методом. Субпопуляции лимфоцитов (LT1, LT4, LT8, DR, CD21) определяли методом проточной цитометрии (FCM), в основе которого лежит выявление на поверхности иммунокомпетентных клеток специфических рецепторов (класстеров дифференцировки) с помощью моноклональных антител, меченных флюорохромом, FCM-анализ проводили на проточном цитометре EP1CS-C (фирма «Coulter* Франция). Результаты и их обсуждение Лечение азатиоприном проводили наряду с ин- сулинотерапией 20 больным с впервые выявленным ИЗСД. Контрольная группа состояла из 18 больных с тем же диагнозом, получавших лишь терапию инсулином. Никаких существенных различий до лечения между пациентами двух групп не было. Введение азатиоприна в экспериментальной группе прерывалось эпизодически при инфекции, которая не была более частой, чем в группе контроля. У всех обследуемых пациентов отмечалась хорошая переносимость препарата. Гематологический контроль проводился не реже 1 раза в 10 дней; он выявил лишь однократно снижение количества лейкоцитов до 3,0- 109/л у 2 пациентов, нивелированное уменьшение дозы азатиоприна. Наблюдения относительно других потенциально неблагоприятных действий азатиоприна показаны в табл. 1. При проведении терапии азатиоприном среднесуточная гликемия через 3 мес достоверно (р< <0,05) снижалась и продолжала снижаться к 6 мес. В контрольной группе за этот период изменения среднесуточной гликемии не происходило (рис. 1). В экспериментальной группе несколько больше снижалась потребность в инсулине к 3- 6 мес по сравнению с контрольной группой. Клиническое определение ремиссии предусматривало проведение контроля гликемии только на фоне диетотерапии или при назначении минимальных доз инсулина (0,1-0,2 ЕД/кг в сутки). Через 3 мес частота клинической ремиссии в экспериментальной (лечение азатиоприном) группе статистически не отличалась от таковой в контрольной группе (р<0,2) и сохранялась на том же уровне и через 6 мес. В контрольной группе этот показатель снизился с 33 до 25 % и стад достоверно ниже, чем в экспериментальной группе, через 6 мес. Различия в содержании С-пептида (3 мес р<0,01, 6 мес р<0,01), потребности в инсулине в обеих группах в эти же сроки были достоверными и соответствовали критериям ремиссии (6 мес р<0,01). Таким образом, спонтанная ремиссия у больных, получавших монотерапию инсулином, имела кратковременный характер и не сопровождалась стимуляцией секреции С-пептида, тогда как у пациентов, получавших, кроме инсулина, иммуносупрессивную терапию азатиоприном, она была более продолжительной и стабильной. До начала лечения антитела к инсулину присутствовали со сходной частотой во всех группах обследуемых. У больных, получавших преимущественно полусинтетические человеческие инсулины, обнаружено снижение в сыворотке титра антител к инсулину. В экспериментальной группе это снижение носило четкий и направленный во времени характер. В контрольной же группе наметившееся снижение титра антител через 3 мес сменилось его повышением, хотя он и не превысил исходные значения. К сожалению, действие азатиоприна на образование антител к инсулину не могло быть изучено у больных, не получавших инъекций инсулина до момента госпитализации. Однако не следует думать, что снижение титра антител к инсулину в экспериментальной группе происходит более выраженно из-за снижения суточной дозы инсулина по следующим соображениям: 1) разница в продукции антител к инсулину была уже установлена в 3 мес, хотя больные, которым назначали азатиоприн, получали довольно большие дозы инсулина; 2) 3 пациента из экспериментальной группы получали инсулин в дозе более 0,5 ЕД/кг массы тела в сутки в течение всего периода лечения; средний уровень антител к инсулину у них составлял только 9,00± ±0,39 нг/мл в 3 мес и 5,00±0,39 нг/мл в 6 мес (рис. 2). В ходе исследования выявлено, что азатиоприн подавляет продукцию инсулиновых антител, выявляемых до терапии и возникающих в ответ на инсулинотерапию. Блокада продукции антител к инсулину не была неожиданной, так как известно, что азатиоприн тормозит продукцию антител вследствие нарушения передачи информации иммунокомпетентным клеткам путем образования антисмысловой мРНК [5]. Система комплемента чувствительнейшим образом реагирует на введение иммуносупрессоров, что позволяет осуществлять строго дозированное индивидуальное назначение препаратов. Следует подчеркнуть, что отсутствие выраженного дефицита компонентов комплемента и снижение общей активности было принято в качестве необходимого критерия для проведения терапии азатиоприном. Пациенты контрольной группы имели близкие с пациентами экспериментальной группы значения активности компонентов комплемента. В экспериментальной группе к снижению активности С1, СЗ, СН50 через 3 мес присоединилось снижение активности и остальных компонентов через 6 мес наблюдения (рис. 3). В контрольной группе никаких достоверных различий ни по одному из компонентов комплемента в эти сроки от- Т а б л и ц а 2 Влияние иммуносупрессивной терапии азатиоприном в дозе 2 мг/кг в сутки на показатели клеточного иммунитета у больных с впервые выявленным ИЗСД (М+т) Показатель клеточного иммунитета До лечения Срок после начала лечения азатиоприном 2 мес 3 мес 4 мес 5 мес 6 мес LT1: о/ /О » Х109/л 74,58±1,83 2,8875±0,1605* 71,08±2,04 2,6750±0,1458* 68,83±1,85 2,4375± 0,1296** 68,50±1,76 2,1458±0,1083** 67,58±1,66 1,9500±0,0657** 65,83±1,40 1,7708±0,0415 LT4: о/ /о „  109/л LT8: О/ /о „  109/л DR: °/о ,  109/л CD21: % .  Ю’/л 47,00±2,80 1,9408±0,1347** 27,58±1,03 0,7025±0,0338 12,58±1,31 0,4583±0,0312* 15,92± 1,37 0,5750±0,0273* 40,83±2,71 1,7608±0,1302** 29,58±0,90 0,9508±0,0490 10,41 ±0,72 0,4333±0,0278* 13,58±0,75 0,5433± 0,0205* 39,17±2,67 1,6008±0,1164** 28,91±0,81 0,9125±0,0452 9,41 ±0,65 0,4042±0,0261** 12,75±0,92 0,4983±0,0205* 38,00±2,74 1,3683±0,1100** 28,33±0,92 0,8500±0,0469 8,33±0,51 0,3833±0,0252** 12,00±0,86 0,4633±0,0204**' 35,58±2,68 1,2308±0,0770** 28,66±1,19 0,7675±0,0356 8,25±0,60 0,3492±0,0252** 11,08 ±0,80 0,4475±0,0172** 36,00±2,75 1,0608 ±0,0634 29,17 ±0,83 0,7108±0,0356 7,76±0,58 0,3293±0,0264 10,50±0,69 0,4392±0,0149 Примечание. Звездочками отмечена достоверность в сравнении с показателями до лечения: одна - р<0,05, две - р<0,01. Таблица 3 мечено не было. Как было показано нами ранее [4], высокий уровень комплемента в крови больных ИЗСД является фактором риска развития ангиопатии. Характерно, что подавление продукции и активности С1-ингибитора на фоне иммуносупрессивной терапии не зафиксировано, хотя особенности метаболических процессов при ИЗСД способствуют инактивации некоторых протеинов, в том числе и С1-ингибитора [1]. Это существенно влияет на состояние системы комплемента и свертывающей системы крови, фибринолиза и кининогенеза и является одним из звеньев в патогенезе диабетической микроангиопатии ввиду того, что сосудистые поражения в значительной степени обусловлены нарушением в кининогеназной системе, активность которой также регулируется преимущественно С1-ингибитором (см. рис. 2). При изучении динамики содержания ЦИК было обнаружено его нарастание в ходе лечения в обеих группах, в особенности у больных, получавших иммуносупрессивную терапию (см. рис. 2). Любая иммуносупрессия, неантигенспецифиче- ская или антигенспецифическая, уменьшает продукцию антител и ведет к формированию малых иммунных комплексов при избытке антигена. Патологический потенциал таких иммунных комплексов мал по сравнению с таковым иммунных комплексов среднего и большого размеров [12]. Ряд авторов [6, 9] считают лечение, имеющее целью образование малых иммунных комплексов с избытком антигена, причиной регрессии болезней иммунных комплексов. Определенное значение имеет аффинность: с высокоаффинными антителами формируются большие комплексы. Более мелкие комплексы образуются с антителами меньшей аффинности [2]. Под влиянием иммуносупрессивной терапии возможен сдвиг в биосинтезе антител в сторону выработки антител с низкой аффинностью, формирование незавершенных иммунных комплексов, элиминируемых иммунокомпетентными клетками. В этой связи следует упомянуть незначительное прямое воздействие азатиоприна на макрофаги, моноциты, гранулоцитопоэз, что не влияет на элиминацию ЦИК этими клетками [5]. С учетом этого представляется не случайным нарастание уровня ЦИК на фоне иммуносупрессивной терапии через 3 и 6 мес у больных с впервые выявленным ИЗСД. Это может быть обусловлено увеличением продолжительности периода циркуляции образующихся малых комплексов с избытком антигена. Результаты исследования влияния иммуносупрессивной терапии на показатели клеточного иммунитета демонстрируют достоверное снижение в процессе лечения исходно повышенного в сравнении с нормой общего числа Т- и В-лимфо- цитов, Т-хелперов/индукторов, а также DR-несущих клеток (табл. 2). При изучении эффективности лечения азатиоприном в зависимости от пола и возраста пациентов выявлена группа больных мужского пола в возрасте старше 25 лет, у которых на фоне минимальной суточной дозы инсулина (не более 12 ЕД) отмечались нормальные метаболические показатели в течение всего периода наблюдения. Обнаружены значительная стимуляция секреции С-пептида на фоне приема азатиоприна и более низкие исходные значения показателя у этих пациентов. Следует отметить, что активность компонентов комплемента классического пути и СН50 у них была существенно выше даже в сравнении с остальными пациентами экспериментальной группы. Можно предполагать, что быстрая нормализация исходно повышенного уровня компонентов комплемента на фоне иммуносупрессивной терапии сыграла определенную роль в коррекции иммунопатологических нарушений. У этих же больных наблюдалась наиболее выраженная динамика уровня ЦИК (табл. 3). Ремиссия сохранялась и после отмены препарата. По всей видимости, лица мужского пола с дебютом ИЗСД в возрасте старше 25 лет являются наиболее восприимчивыми к иммуносупрессивной терапии азатиоприном. Выводы 1. Иммуносупрессивная терапия азатиоприном пролонгирует ремиссию и стимулирует остаточную функцию р-клеток, подавляет продукцию инсулиновых антител, снижает активность компонентов комплемента и СН50, снижает исходно повышенные показатели клеточного иммунитета (общее число Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов/индукторов, а также DR-несущих клеток) при впервые выявленном ИЗСД. 2. При отборе больных для проведения иммуносупрессивной терапии целесообразно предварительное исследование ряда иммунологических показателей: статуса комплемента, общего числа Т- и В-лимфоцитов, индекса иммунорегуляции Т-хелперы-индукторы/Т-супрессоры-цитотоксиче- ские, DR-несущих клеток. Противопоказанием к иммуносупрессии является снижение их уровня. 3. Лица мужского пола с дебютом ИЗСД в возрасте старше 25 лет наиболее восприимчивы к иммуносупрессивной терапии азатиоприном.