Состояние АТФ-зависимых К+-каналов ß-клеток поджелудочной железы под влиянием ряда сульфонилмочевинных препаратов

Успешное применение препаратов сульфонил- мочевины на протяжении более чем трех десятилетий для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета не- прояснило окончательно всех вопросов, касающихся механизма их действия. С одной стороны, эти препараты способствуют процессу утилизации глюкозы тканями за счет увеличения количества рецепторов к инсулину, повышения их аффинности и улучшения инсу- лин-рецепторного взаимодействия, что усиливает биологический эффект инсулина на периферии. С другой стороны, известно и непосредственное действие сульфонилмочевинных препаратов на 0-клетки поджелудочной железы, способствующее повышению секреции инсулина в кровь. Наряду с обнаружением высокоспецифических рецепторов к сульфонилмочевинным препаратам на мембране р-клеток и их включением в процесс экзоцитоза инсулина много внимания исследователи уделяют анализу роли ионных каналов в этом процессе [1, 3, 5]. Особое место среди них занимают калиевые АТФ-зависимые каналы. Препараты сульфонилмочевины опосредуют свое действие на стимуляцию секреции инсулина аналогично естественным секретогенным веществам - глюкозе и ряду аминокислот. Они блокируют активность АТф-чувствительных К+-каналов, вызывая деполяризацию клеточной мембраны и открытие Са2+-каналов, что способствует поступлению экзогенного кальция внутрь клетки. Повышенный уровень цитоплазматического кальция способствует возникновению потенциала действия и началу экзоцитоза инсулина. Целью настоящего исследования являлось изучение взаимосвязи электрофизиологических процессов, происходящих на мембране клетки под Влияние глибенкламида, гликлазида и глипизида на некоторые электрофизиологические показатели К+-АТФ-зависимых каналов р-клеток (в мс) Глюкоза Глибенкламид Гликлазид Глипизид 0 3 мМ 0 3.2 мМ отмывание 0 10 мМ отмывание 0 10 мМ 0 10 мм Показатель Средняя продолжительность разряда (пачки) 212 16,4 43,0 13,0 164 320 105 280 345 139 270 117 Средняя продолжительность интервала между пачками 29,1 221 78,0 520 60,0 30,8 860 1(6) 46,0 570 35,3 713 Время открытия 1,90 1,50 1,60 1,50 1,60 1,80 1,55 160 1,88 1,63 1,75 1,45 Средняя продолжительность интервала в разряде 0,470 0,400 0,450 0,413 0,440 0,467 0,420 0,390 0,500 0,500 0,451 0,403 влиянием сульфонилмочевинных препаратов второй генерации, и стимулирующего действия ряда секретогенов на выделение инсулина и сопоставление эффекта действия трех препаратов сульфонилмочевины - гликлазида, глибенкламида и глипизида на состояние АТФ-зависимых К+-каналов. Материалы и методы Работы проводились на культивируемых островковых клетках поджелудочной железы. Выделение и культивирование р-клеток проводились по ранее описанному методу. S. Misler и соавт. [9|. Для электрофизиологических опытов клетки высевали в чашки Петри. Основным методом в работе был метод пэтч-кламп, позволяющий регистрировать потенциалзависимые токи от целой клетки [6, 9]. Экстраклеточный раствор содержал 140 мМ NaCl, 1 мМ СаС12, 2 мМ MgC12, 2,8 мМ КС1, 10 мМ HEPES (Na), pH 7,4. Стеклянные микропипетки заполняли изотоническим раствором, близким по ионному составу цитоплазме: 140 мМ KC1, 10 мМ HEPES(K), 3 мМ ЭГТА, концентрация свободного кальция - 0,5 мкМ, 2 мМ MgCl2, 3 мМ MgATF, pH 7,4. Пипетки изготавливались из боросиликатного стекла и имели сопротивление 1-5 МОм. Для регистрации интегральных токов использовали усилитель, имеющий цепи компенсации емкостных переходных процессов. Ионные токи регистрировали на запоминающем осциллографе и магнитографе. Во всех опытах потенциалзависимый ток определялся как отрицательный потенциал содержимого микроэлектрода по отношению к земле. В ходе опыта проводился подсчет среднего числа каналов, открытых в фиксированной части клеточной мембраны. Анализ кинетики каналов проводился начиная с момента регистрации, когда был активен только один канал (2]. Ток отдельного канала фильтровался при частоте 3 кГ и регистрировался со скоростью 20 000 кадров в течение 3-5 мин. Гистограммы составлялись из полученных данных и отражали суммарный эффект действия того или иного препарата на функционирование отдельно анализируемого ионного канала. Испытуемые вещества подавали в камеру с помощью локальной микроперфузии, используя пневматический микро- инъектор. Кончик микропипетки располагался в 50 мкм от клетки. Препараты сульфонилмочевины: гликлазид, глибен- кламид и глипизид были любезно предоставлены фирмами «Servier», «Boehringer Mannheim», «Farmitalia, Carlo Erba» соответственно. Результаты и их обсуждение Проанализирована избирательная эффективность действия ряда сульфониламидов на ход. и кинетику К+-АТФ-чувствительных каналов р-клеток островковой ткани поджелудочной железы интактных крыс. Концентрация препаратов соответствовала терапевтическому уровню, обычно наблюдаемому у больных. Полученные нами данные представлены на рисунке и в таблице, из которых можно видеть, что аппликация глюкозы, глибенкламида, гликлазида и глипизида в перфузат, омывающий (-клетки, в концентрациях от 1 до 20 мМ вызывает полное закрытие К+-АТФ-зависимых каналов, локализованных на мембране этих клеток. Процесс закрытия канала наступает очень быстро, достигая устойчивого состояния в течение 30 с. Сохраняется такой эффект до 10 мин. После отмывания активность этих каналов быстро восстанавливается до исходного уровня. Следует отметить более медленное начало действия глибенкламида на процесс снижения активности одиночных каналов, а также более медленное восстановление ее после отмывания препарата, что в итоге обеспечивает более сильное влияние его как гипогликемического препарата по сравнению с гликлазидом или глипизидом. Обращает на себя внимание также тот факт, что проводимость отдельных каналов не изменялась под влиянием применяемых нами препаратов. При добавлении любого из испытуемых препаратов величина потенциала снижалась на 10-25 мВ, что способствовало наступлению деполяризации мембраны, закрытию канала и возникновения потенциала действия. Проведенный нами сравнительный анализ эффекта глюкозы и сульфониламидов показал их сходное влияние на процессы закрытия К+-АТФ-чувствительных каналов (см. рисунок). В наших исследованиях было показано весьма специфическое действие сульфониламидных препаратов на характер биоэлектрической активности К+-АТФ-чувствительных каналов, а именно, на временной характер ее распределения. Обычно активность этих каналов проявляется пачковыми разрядами стандартной амплитуды, чередующимися с паузами, которые длятся несколько секунд. Добавление любого из исследуемых препаратов вызывало сокращение длительности разрядов одновременно с увеличением интервала между пачками (см. рисунок). Аналогичный эффект наблюдался и после добавления глюкозы. Одним из наиболее информативных показателей при оценке действия сульфониламидных препаратов на состояние ионного канала является динамика протекающих в нем процессов. Мы провели сравнительное исследование действия глюкозы, глибенкламида, гликлазида и глипизи- да на кинетику отдельных ^-АТФ-зависимых каналов, подсчитывая среднюю продолжительность разрядов, время открытия канала, сред- Влияние глюкозы (а), глибенкламида (б), гликлазида (в), глипизида (г) на состояние К+-АТФ-чув- ствительных каналов р-клеток поджелудочной железы. Представлены суммарные гистограммы ответной реакции К -АТФ-чувствительных каналов мембраны р-клеток н калибровка величины потенциала и длительности разряда. нюю продолжительность закрытия канала в пайковом разряде, а также среднюю продолжительность интервала в разряде (см. таблицу). Такой показатель, как распределение времени открытия, подчиняется обычным математическим правилам и развивается по экспоненте. Например, показано, что добавление 3,2 мМ глюкозы (дозы, наиболее часто встречающейся в экспериментах) сокращает время открытия канала более чем на 9 % от исходного, тогда как средняя продолжительность интервала в разряде (в пачке) уменьшается на 8 %. Средняя продолжительность разряда сокращалась в 3 раза, а интервал между пачками увеличивался в 7,5 раза. Эти данные свидетельствуют о том, что глюкоза снижает способность каналов к открытию за счет одновременного сокращения длительности разрядов и увеличения продолжительности паузы между ними. Аналогичные результаты получены нами и в случае применения глибенкламида. Аппликация Ю мМ препарата вызывала снижение вероятности открытия канала на 20 %, в то же время интервал между разрядами в пачке сокращался незначительно (на 1,5%), а время открытия уменьшалось на 12%. В то же время средняя продолжительность разряда сокращалась в 3 раза, а продолжительность межпачковых интервалов ■увеличивалась в 22 раза. Аналогичные результаты получены нами также при применении гликлазида и глипизида (см. таблицу). Представленные выше данные свидетельствуют о том, что все изученные нами препараты проявляют свое действие на К+-АТФ-чувстви- тельные каналы, меняя степень их закрытия. В связи с этим возникает вопрос, проявляют ли они свое действие непосредственно на эти каналы или их влияние осуществляется за счет изменения внутриклеточного метаболизма. Ограниченная серия исследований, проведенная нами на изолированной мембране (-клетки, показала, что аппликация глибенкламида в дозе от 50 до 100 мМ как на цитоплазматическую, так и на наружную поверхность мембраны снижала активность К+-АТФ-чувствительных каналов в несколько раз. Обращает на себя внимание, однако, тот факт, что добавление АТФ очень быстро способствовало восстановлению активности каналов. Эти исследования требуют своего продолжения. Исследование прямого действия ряда широко используемых в клинике гипогликемических сульфонилмочевинных препаратов на активность метаболически регулируемых К+-АТФ-чувстви- тельных ионных каналов плазменной мембраны (-клеток поджелудочной железы интактных взрослых крыс показало, что действие глибенкламида, гликлазида и глипизида является специфическим, дозозависимым и направлено главным образом на закрытие К+-АТФ-чувствительных каналов. Эти результаты подтверждают и дополняют полученные ранее данные [5, 12], в которых было показано ингибирующее действие толбутамида на активность К+-АТФ-чув- ствительных каналов. Более того, было показано, что этот эффект толбутамида и глюборида возрастает в присутствии АТФ [7, 13]. Аналогичное действие проявляют и другие нуклеотиды, например АДФ [12]. Особый интерес представляют данные литературы о том, что ни один из исследуемых сульфонилмочевинных препаратов не влияет на одиночные К+-АТФ-независимые каналы, которые также обнаружены в (-клетках островковой ткани поджелудочной железы [4]. Полученные нами данные, а также данные литературы доказывают специфическое влияние сульфонилмочевинных препаратов на уровне К+-АТФ-чувствительных каналов, которые являются стратегически важной точкой в реализации цепи стимул - секреция. Эти каналы ответственны за проявление прямого фармакологического действия на процессы электрогенеза, а также секрецию инсулина р-клетками. Эти данные вносят определенную ясность в вопрос о том, что секретогенный эффект сульфонилмочевинных препаратов нельзя объяснить только их гипогликемическим действием на уровне печени путем изменения обмена гликогена [10, 11]. Идея о ведущей роли К+-АТФ-чув- ствительных каналов в процессах секреции инсулина р-клетками подтверждается также данными о том, что такие препараты, как гидро- хлортиазид и фуросемид, будучи сульфониламидными диуретиками, не влияют на активность К+-АТФ-чувствительных каналов, проявляя гипергликемический эффект in vivo [8]. Следует обратить внимание также на тот факт, что действие исследуемых нами сульфонилмочевинных препаратов на К+-АТФ-чувствительные каналы подобно эффекту глюкозы. Эти препараты вызывают значительное и обратимое снижение длительности разрядов К+-АТФ-каналов за счет снижения продолжительности разряда каждого индивидуально открытого канала приблизительно на 20 %. Ни глюкоза, ни применяемые нами препараты не вызывали значительных изменений длительности разрядов закрытых каналов в пачке, однако они увеличивали среднее время между разрядами в несколько раз. При обсуждении вопроса о точке приложения действия гипогликемических сульфонил мочевинных препаратов в сопоставлении с аналогичными эффектами некоторых' нуклеотидов - типа АТФ или АДФ, возникает ряд проблем, касающихся наличия мест связывания на уровне ионных каналов, их качественной и количественной оценки. Неясен вопрос о гомологичности рецепторов данных соединений и возможности перекрестного связывания этих наиболее физиологически активных препаратов. В свете полученных данных возникает вопрос об особенностях функционирования ионных каналов в р-клетках, полученных из островковой ткани животных с различной степенью повреждения поджелудочной железы. Решение его очень важно для специалистов-диабетологов как при выборе препарата для терапии конкретного больного, так и при поисках новых высокоэффективных сахарпонижающих препаратов. Выводы 1. Показано специфическое действие глибенкламида, гликлазида и глипизида на К+-АТФ-чув- ствительные каналы р-клеток, проявляющееся в снижении их активности, вплоть до закрытия, что способствует началу процесса секреции инсулина. 2. Глибенкламид является наиболее активным препаратом в своем влиянии на мембрану Р-клетки и проявляет свое действие на кинетику К+-АТФ-чувствительных каналов аналогично эффекту глюкозы.