Современные концепции иммунопатогенеза инсулинзависимого сахарного диабета

Термин «иммунопатогенез инсулинзависимого сахарного диабета» обозначает наблюдающийся на доклиническом этапе заболевания процесс деструкции секретирующих инсулин Р-клеток под действием иммунокомпетентных клеток-эффекторов и выделяемых ими медиаторов, а также гуморальных факторов иммунного ответа. В настоящий момент не ясно, каким образом нарушается иммунологическая толерантность и развивается иммунный ответ к собственным антигенам р-клеток. Возможно, процесс инициируется высвобождением или повреждением этих антигенов под действием эндогенных (изменение структуры генов главного комплекса гистосовместимости человека - МНС) или экзогенных (вирусная инфекция) факторов. Затем в островке появляются макрофаги, а на р-клетках - молекулы МНС II класса, и начинается процессинг антигена с помощью антигенпредставляющих клеток (АПК). Презентируемый антиген в связи с молекулами МНС II класса распознается Т-хелперами (Тх), инфильтрирующими островок. В свою очередь Тх активируют АПК, секретирующие цитокины. Цитокины амплифицируют иммунный ответ Т-, В-, NK-клеток и макрофагов в отношении островковых клеток- мишеней, а ростовые факторы вызывают клональную экспансию предшественников Т- и В-лимфоцитов. Затем факторы дифференцировки приводят к образованию цитотоксических / супрессорных Т-лимфоцитов (Тц,с), разрушающих 0-клетки при прямом межклеточном контакте, и плазматических клеток, продуцирующих аутоантитела, в том числе цитотоксичные в отношении островковых клеток. Иммунный ответ ограничен во времени существованием антигена-мишени: после разрушения большей части 0-клеток и элиминации антигена этот процесс заканчивается [1]. 1. Роль факторов генетической предрасположенности в развитии инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД) Основной гипотезой, объясняющей происхождение ИЗСД, является аутоиммунитет, опосредованный генами МНС (2-6]. Популяционное обследование населения позволяет выявить факторы генетической предрасположенности к ИЗСД - 95 % европейцев, больных ИЗСД, экспрессируют HLA DR3 и/или DR4 |7-9]. Более 95% 6Р4(-|-)-больных ИЗСД экспрессируют аллель DQw 3.2 [10]. Следовательно, эти аллели ассоциируются с развитием заболевания. Однако аллели HLA DR3 и DR4 обнаружены также у 40 % лиц, не страдающих ИЗСД [11, 12]. Напротив, экспрессия антигенов DR2 у больных ИЗСД практически не встречается. В то же время рестрикционный анализ геномной ДНК различных гаплотипов DR2 ( + ) выявил аллельный вариант DwAZH, практически не встречающийся в здоровой популяции, но характерный для большинства DR2 ( + )-больных ИЗСД [13]. Таким образом, аллель DwAZH гаплотипа DR2( + ) и аллель DQw 3.2 гаплотипа DR4( + ), несмотря на структурные различия, функционируют как гены предрасположенности к ИЗСД [14]. Возникает вопрос, не связано ли развитие ИЗСД с появлением мутантных аллелей HLA II класса. На молекулярном уровне обнаружены единичные мутации - в молекуле DQ (у DR4( + )- и 0Е2( + )-больных ИЗСД) в положении 57 0-цепи находились аминокислоты аланин, валин или серин. Напротив, у здоровых лиц в положении 57 0-цепи, как правило, определяется аспарагиновая кислота. Возможно, полиморфизм 0-цепи DQ по аминокислоте в положении 57 определяет критическую роль молекулы DQ в развитии ИЗСД. Действительно, аллели DQ(-j-) с 2 остатками аспарагиновой кислоты резистентны к развитию заболевания |15]. У мышей всех линий, кроме NOD со спонтанным диабетом, в структуре гена I-А в положении 57 также находится аспарагиновая кислота [16]. В то же время не ясно, каким образом реализуется генетическая предрасположенность к ИЗСД. Вероятно, за счет изменений в строении 0-цепи DQ-молекулы формируется структура, представляющая аутоантигены 0-клеток Т-лимфоцитам. При этом появляются аутореактивные Т-клетки и развивается Т-клеточный ответ на инсулинпродуцирующие 0-клетки. II. Роль вирусов в развитии ИЗСД У генетически предрасположенных к ИЗСД лиц заболевание развивается при наличии провоцирующих факторов, среди которых особое место занимает вирусная инфекция [17]. Несмотря на то что специфический диабетогенный вирус не обнаружен, в некоторых случаях ювенильного диабета в разрушенных островках выявляются вирусы [18, 19|. Так, из поджелудочной железы ребенка с остро протекающим ИЗСД был выделен вирус Коксаки В4, а трансфекция этого вируса мышам привела к пенетрации островковых клеток и развитию гипергликемии [20]. В то же время связь между развитием ИЗСД и инфицированием одним определенным вирусом не обнаружена. Показано, что целая группа вирусов разной природы (Коксаки, паротита, цитомегаловирус) вызывает нарушения функции 0-клеток и клинические проявления диабета у генетически предрасположенных к ИЗСД лиц [21]. Еще более сложно определить роль вирусов в случае латентного диабета, развивающегося в зрелом возрасте. Не исключено, что вирус длительное время персистирует в 0-клет- ках, не разрушая их, но постепенно нарушая синтез и секрецию инсулина [22, 23]. Персистирующая инфекция лимфотропным вирусом хориоменингита (ЛХМВ) у мышей - хорошо описанная экспериментальная модель участия вируса в развитии ИЗСД. ЛХМВ обладает тропизмом к островковым клеткам, в которых он длительное время персистирует. При этом развивается избирательный дефицит вирусспецифических Тцд-лимфоцитов, что препятствует развитию иммунного ответа в отношении пораженных клеток |24, 25]. Однако ЛХМВ проникает во все виды островковых клеток, что противоречит специфичности иммунного ответа в отношении 0-клеток при ИЗСД. В то же время появление вирусного гликопротеида на поверхности пораженных клеток может активировать механизмы иммунологического распознавания и аутоиммунной агрессии в отношении 0-клеток [26]. Наличие антигенных эпитопов, общих для белков 0-клеток и микроорганизма (так называемая молекулярная мимикрия), приводит к тому, что иммунный ответ начинает развиваться к антигенам вируса, а затем к собственным антигенам 0-клеток организма-хозяина. Так, участок аминокислот белка (BOLF-1) вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) гомологичен положению 57 цепи DQw 3.2, ассоциированной с ИЗСД [27]. Согласно гипотезе молекулярной мимикрии, ткань поджелудочной железы вообще может быть не инфицирована вирусом, но являться вторичной мишенью перекрестной иммунной реактивности, развивающейся в другой ткани [28]. Возможно, на многие вопросы о взаимосвязи нарушений экспрессии генов МНС, вирусной инфекции или перекрестнореактивного иммунного ответа можно будет ответить после идентификации антигенов-мишеней аутоиммунной агрессии при ИЗСД. III. Нарушения клеточно-опосредованного иммунитета при развитии ИЗСД В настоящее время выявлены различные механизмы деструкции 0-клеток: антителоопосредованная цитотоксичность, цитотоксическая деструкция за счет Т-клеток, увеличения активности NK-клеток и макрофагов, токсическое воздействие лимфокинов. Необратимому разрушению 0-клеток и клинически манифестному ИЗСД предшествует длительный латентный период. Вместе с тем использовать биопсию поджелудочной железы для исследования этого процесса in situ невозможно в связи с опасностью для жизни человека. Поэтому стадийность повреждений 0-клеток полностью не изучена. Анализ нарушений клеточно-опосредованного иммунитета во многих случаях проводится с использованием клеток периферической крови больных ИЗСД, Т-клеточных линий и моделирования заболевания на животных. 111.1. Экспрессия антигенов МНС на ^-клетках D. Bottazzo в 1983 г. предположил, что первичным проявлением органоспецифического аутоиммунного заболевания может быть аберрантная экспрессия молекул МНС II класса на эндокринных клетках-мишенях, поскольку они активируют АПК. В 1985 г. ему удалось при аутопсии поджелудочной железы больного с недавно выявленным ИЗСД обнаружить экспрессию молекул II класса на 0-клетках [29]. В дальнейшем аналогичные результаты получили еще на 14 аутопсийных образцах [30]. Была сформулирована следующая стадийность изменений in situ, приводящих к развитию ИЗСД: 1) индукция избирательной экспрессии молекул II класса на 0-клетках; 2) мононуклеарная инфильтрация островков (инсулит); 3) прогрессирующая деструкция 0-клеток; 4) постепенное исчезновение мононукле- арной инфильтрации и экспрессии МНС II класса в связи с субтотальным разрушением 0-клеток [31]. Механизм появления молекул МНС II класса на 0-клетках изучали in vitro, воздействуя на них лимфокинами. Оказалось, что интерферон (ИФ) не индуцирует экспрессию антигенов II класса [32]. Однако при использовании ИФ в сочетании с опухоленекротическим фактором на 0-клетках появляются эти маркеры [33]. В то же время молекулы II класса экспрессируются и на а-клетках, следовательно, избирательный эффект в отношении 0-клеток отсутствует, что противоречит предыдущему заключению. Обнаружить причинно-следственную связь между продукцией лимфокинов и появлением антигенов МНС трудно, так как источник лимфокинов - макрофаги и лимфоциты - в интактных островках отсутствуют. В дальнейшем при развитии инсулита и разрушении лимфоцитов могут высвобождаться лимфоки- ны, однако не на начальном этапе диабетогенеза [34]. Теоретически возможно, что экспрессия молекул МНС II класса на 0-клетках индуцируется вирусом или другим агентом, первично действующим на эндотелиальные клетки. Они в свою очередь секретируют дополнительные факторы, приводящие к селективной экспрессии маркеров МНС на 0-клетках [35]. Кроме того, в пределах одного островка обнаруживается гипсрэкспрессия антигенов МНС I класса на всех типах эндокринных клеток, предваряющая появление молекул 11 класса на 0-клетках [36]. Не исключено, что эти двухэтапные изменения предшествуют развитию инсулита и разрушению 0-клеток. В этом контексте интересны следующие наблюдения: ИФ in vitro участвует в регуляции экспрессии антигенов I класса на 0-клетках, а инфицирование этих клеток диабетогенным реовирусом также приводит к усилению поверхностной экспрессии белков 1 класса, возможно, путем транскрипции соответствующих генов. Эти наблюдения вполне можно рассматривать как подтверждение роли вируса как промотора аутоиммунной деструкции 0-клеток. Вместе с тем ряд авторов считают, что это мнение ошибочно, так как большинство позитивных по II классу инсулинсодержащих клеток при развитом ннсулите представляют собой мононуклеары, поглотившие разрушенные 0-клетки. Кроме того, у животных со спонтанным аутоиммунным диабетом - крыс ВВ и мышей NOD - аберрантная экспрессия молекул МНС II класса обнаруживается только при значительно развитом инсулите на фоне массивной деструкции 0-клеток [37]. На большом патологоанатомическом материале (материалы аутопсии поджелудочной железы от 75 и биоптаты от 23 больных с дебютом ИЗСД, а также от 12 - с более длительным течением заболевания) исследовали взаимосвязь экспрессии антигенов МНС на островковых клетках и гистопатологических изменений островков. Антигены МНС II класса иммуноцитохимически идентифицировали у 21 из 23 больных с впервые выявленным ИЗСД только на 0-клетках [38]. Подобных изменений не наблюдали в поджелудочной железе больных инсулиНнезависимым сахарным диабетом, хроническим или острым панкреатитом, вызванным вирусом Коксаки В, кистофиброзом поджелудочной железы. На основании этих наблюдений предположили, что аберрантная экспрессия продуктов МНС II класса на эндокринных клетках- мишенях приводит к презентации органоспецифических поверхностных антигенов потенциально аутореактивным Тх, что вызывает аутоиммунный инсулит и деструкцию (5-клеток. III.2. Инсулит W. Gepts в 1965 г. впервые описал инфильтрацию островков поджелудочной железы больного ИЗСД мононуклеарами. Автор связал этот процесс с деструкцией р-клеток и ввел термин «инсулит» для обозначения специфического аутоиммунного воспаления островка. В доклинической стадии ИЗСД инсулит наблюдается в 13-75 % островков и неравномерно выражен в пределах поджелудочной железы. Инсулит характерен для островков, в которых сохранилась значительная часть р-клеток: у больных, умерших вскоре после клинической манифестации ИЗСД, обнаруживается мононуклеарная инфильтрация до 23 % островков, содержащих инсулинпозитивные клетки и только в 1 % опустошенных островков [39]. В настоящее время стадийность развития инсулита и повреждения р-клеток наиболее полно изучена у крыс ВВ. При исследовании серийных срезов островков и биоптатов поджелудочной железы выделены 3 стадии развития инсулита: 1- я стадия - инфильтрация активированными макрофагами с фенотипами EDI +, W3/25+, 0x3/6/17+, ED2-, усиление экспрессии антигенов МНС II класса по периферии островков |40- 43]. На этой стадии развития инсулита Т-, NK- и В-клетки обнаруживаются в количестве менее 1 на срез; 2- я стадия - массивная инфильтрация макрофагами, единичными 0x19+ Т-клетками и 0x8+ NK-клетками; 3-я стадия - инфильтрация Т- и NK-клетками и массивная инфильтрация 0x12+ В-лимфоцитами. Состав инсулярного инфильтрата у мышей NOD практически не отличается от такового у крыс ВВ [44, 45]. В целом определяется 20,4-28,1 % Т-лимфоцитов, среди которых преобладают ЕЗТ4+ТХ; 28,8-30,8 % В-лимфоцитов, 22,8- 32,2 % МНС 11+ клеток, преимущественно макрофагов, и 5,5-8,5 % активированных Т- и NK-клеток (АМТ 13+; 7 D4 + ). II 1.3. Иммунокомпетентные клетки-эффекторы деструкции (5-клеток Анализ развития инсулита позволяет предположить, что в деструкции р-клеток участвуют различные клетки-эффекторы [46,47]. Основная гипотеза, объясняющая нарушения клеточно-опосредованного иммунитета в диабетогенезе,- активация аутореактивных Т-клеток, несущих рецепторы к антигенам р-клеток и инсулину, но не к антигенам другой тканевой специфичности [48-51]. Действительно, мононуклеары периферической крови (МПК) больных ИЗСД обладают способностью размножаться в ответ на эти антигены и вызывают клеточно-опосредованную деструкцию р-клеток [52-54]. Кроме того, стимулированные in vitro специфическим антигеном Т-клетки выделяют фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов (ЛИФ), причем у больных ИЗСД повышенная секреция ЛИФ коррелирует с гиперчувствительностью на внутрикожное введение антигена [55]. Т-клетки, специфические в отношении островковых антигенов, циркулируют в крови больных с впервые выявленным ИЗСД, а с увеличением его продолжительности исчезают [56]. В 2 из 3 случаев была также показана направленная миграция к островкам аутологичных МПК, предварительно выделенных у пациентов с остро развившимся ИЗСД, затем меченных изотопом и вновь введенных тем же больным [57]. Так как мононуклеары больных ИЗСД инфильтрируют остров ки, пролиферируют в ответ на антигены островковых клеток и мигрируют в этот орган, предположили, что возможен пассивный перенос заболевания при помощи МПК. Действительно, адоптивный перенос диабета осуществили при помощи Т-клеточных линий, происходящих от лимфоцитов, инфильтрирующих островки мышей NOD [58]. Эти клетки по фенотипу преимущественно Тх и пролиферируют в ответ на антигены островковых клеток, а при введении по 15- 20 млн Т - и Тцд-клеток облученным здоровым 4-6-не- дельным NOD-реципиентам вызывают у них развитие клинической картины диабета [59, 60]. Кроме того, введение активированных КонА спленоцитов от больных диабетом крыс ВВ молодым здоровым животным этой линии ускоряет процесс развития заболевания, а у резистентных к диабету крыс DR -ВВ и крыс Вистар в результате введения этих клеток развивается диабет [61, 62]. Роль Т-лимфоцитов как эффекторов деструкции р-клеток ясна из предыдущих экспериментов. В то же время ряд Т-клеточных линий, экспрессирующих комплекс Т-клеточных рецепторов (ТКР), обладает в отношении р-клеток не рестрик- тированной по МНС цитотоксичностью за счет субпопуляции ТКР( + )-клеток с фенотипом клеток-киллеров (NK) [63. 64]. Следовательно, NK-клетки также могут принимать непосредственное участие в разрушении р-клеток. И наконец, существенная роль в деструкции р-клеток при развитии ИЗСД отводится макрофагам. При этом макрофаги могут разрушать их за счет образования свободных гидроксильных и кислородных радикалов, высвобождения протеаз или цитокинов. Показано, что активированные макрофаги здоровых доноров ингибируют секрецию инсулина в культуре островковых клеток [65, 66]. Кроме того, введение веществ, инактивирующих макрофаги, предотвращает развитие инсулита у крыс ВВ. В то же время спленоциты больных ИЗСД не переносят заболевание реципиентам, не предрасположенным к диабету. Поэтому, несмотря на доказательства участия лимфоцитов- эффекторов в деструкции р-клеток и их способности к адоптивному переносу заболевания, этим клеткам не отводится исключительная роль в патогенезе ИЗСД [67]. В настоящий момент также неизвестно, какая субпопуляция МПК является первичным эффектором деструкции р-клеток и какую роль в этом процессе играют цитокины [68, 69]. Так, на начальном этапе развития инсулита аутореактивные Тх участвуют в распознавании антигена и мигрируют в островки, но эти клетки способны переносить заболевание только в присутствии Тц/С лимфоцитов. Несмотря на то что у больных вновь выявленным ИЗСД зачастую наблюдаются снижение активности Т-суп- рессоров, повышенная активность NK-клеток и макрофагов, эти клетки в отличие от аутореактивных Тх не располагают специфическими структурами, распознающими антигены р-кле- ток. Таким образом, наиболее вероятный механизм избирательного поражения р-клеток заключается в кооперативном взаимодействии всех типов клеток-эффекторов. IV. Нарушения гуморального иммунитета в патогенезе ИЗСД До клинической манифестации ИЗСД в составе островкового инфильтрата обнаруживаются не только Т-, но и пре- плазматические В-клетки, а в аффектированных эндокринных клетках - депозиты иммуноглобулинов и комплемента. В крови больных ИЗСД появляются аутоантитела к антигенам островковых клеток, увеличивается количество Ig-секрети- рующих В-лимфоцитов, что позволяет предположить участие в аутоиммунной деструкции р-клеток не только клеточных, но и гуморальных механизмов (70). IV. I. Антигены-мишени аутоиммунной деструкции (5-клеток Активация клеточного и гуморального аутоиммунитета зависит от гипотетических антигенов-мишеней на р-клетках, которые при участии эндо- или экзогенных факторов, провоцирующих ИЗСД, высвобождаются или изменяют свою структуру и вызывают каскад иммунных реакций. В настоящее время при помощи моноклональных антител (МКА) охарактеризован ряд антигенов островковых клеток протеиновой, гликопротеиновой, гликолипидной и ганглиозидной природы. Описана значительная молекулярная гетерогенность органоспецифических антигенов р-клеток, которые представлены основными комплексами с мол.м. 135-145, 90- 100 и 58-64 кД [71-87]. МКА А2В5, 3G5, R2D6 выявляют гликолипидные антигены плазматической мембраны, общие для нормальных островковых, RlNm5F клеток и нейронов, по растворимости и хроматографическим свойствам соответствующие GQ-ганглиозиду головного мозга [88-90]. Эти антигены резистентны к трипсину, но разрушаются под действием нейраминидазы, растворимы в смеси хлороформа и метанола. Среди этих МКА наиболее специфичными к р-клеткам оказались МКА R2D6. По данным иммуноэлектронной микроскопии, МКА R2D6 реагируют исключительно с р-клетками крысы, человека, мыши и морской свинки. Однако антиген, распознаваемый МКА R2D6, обнаружен также в нейросекреторных клетках гипофиза. В отличие от R2D6, А2В5 и 3G5 выявляют ганглиозидный антиген на всех типах островковых клеток и обладают более выраженной экстрапанкреатиче- ской реактивностью. Действие МКА А2В5 по сравнению с R2D6 шире - МКА А2В5 и R2D6 блокируют связывание антител l25I-R2D6, но не l2SI-A2B5 с островковыми клетками [91]. Несмотря на то что МКА R2D6 более специфичны в отношении р-клеток, они не оказывают влияния на инсулин- МКА к антигенам островковых клеток Гибридные клоны Партнеры для гибридизации Антигены, выявляемые МКА (мол. м., кД) Ингибиция секреции инсулина 1 1" К28А1* K28D6 Спленоциты мыши, обработанной стрептозотоци- ном, а затем иммунизированной островковыми клетками крысы Миелома мыши p3x63Ag8.653 н/т н/т + I К29аС4 Спленоциты мыши, иммунизированной островковы- То же н/т - К29аС6* ми клетками эмбрионов человека н/т - K56aF3* То же н/т + К69аА12 » » н/т 2G3 Спленоциты мыши BALB/c, иммунизированной клетками RINm5F н/т н/т 3G3 То же » » н/т н/т В1 » » 21 н/т 7F6 Спленоциты мыши BALB/c, иммунизированной островками человека » » 66, 65 н/т IC2 Лимфоциты крысы ВВ Миелома крысы I.3Agl.2.3 н/т н/т ЗА4* Спленоциты мыши NOD Миелома мыши p3X63Ag8.653 64, 28 + МС4Е4 Лимфоциты ребенка в предиабетическом состоянии, трансформированные ЭВБ 64, 56 н/т Е5С2 Спленоциты крыс ВВ крыс с дебютом диабета Миелома крысы I.3Agl.2.3. 68, 60 н/т ICA-1 Спленоциты мыши BALB/c, иммунизированные островковыми клетками Миелома мыши p3X63Ag8.653 69, 67, 64, 56 + * МКА оказывали С'-зависимое цитотоксическое действие на нормальные островковые клетки, МКА ЗА4 - на клетки инсулиномы хомяка. Примечание, н/т - данных о тестировании нет. секреторную функцию in vitro. Напротив, МКА А2В5 в дозе 0,67-67 мкг/мл ингибируют на 80-100 % вызванную глюкозой и толбутамидом секрецию инсулина 0-клетками, МКА А2В5 и 3G5, кроме того, снижают на 40-50 % секрецию паратгормона при концентрации кальция 0,75 ммоль/л. Следовательно, МКА, распознающие цитоплазматический антиген гликолипидной природы на эндокринных клетках поджелудочной железы и нейросекреторных клетках других органов, обладают специфической биологической функцией, заключающейся в пороговой ингибиции секреции пептидных гормонов. При помощи МКА, реагирующих с 0-клетками и другими эндокринными клетками, выявлен также спектр антигенов гликопротеидной природы. В целом эти маркеры можно охарактеризовать как семейство дифференцировочных антигенов нейроэндокринных клеток, последовательно появляющихся в процессе органогенеза: островковые клетки поджелудочной железы (р120, р69, р67, р56), С-клетки щитовидной железы (р120), клетки передней доли гипофиза (р40, р24), нейроэндокринные клетки гипоталамуса, большие пирамидальные клетки коры головного мозга [92, 93]. Эта гипотеза подтверждается характером взаимодействия МКА HISL-19 с опухолевыми клетками инсулиномы, карциноида, аденомы гипофиза, параганглиомы, феохромоцитомы, карциномы щитовидной железы, происходящей из С-клеток, нейроэндокринной карциномы кожи [94, 95]. Также не исключено, что антигены различных эндокринных клеток имеют общий эпитоп с антигенами 0-клеток. Однако взаимодействие МКА 4F2 и HISL-1 - 22 с антигенами 120 и 100 кД соответственно ингибирует секрецию паратгормона, но не инсулина [96, 97]. Поэтому первостепенное значение в изучении антигенов- мишеней аутоиммунного процесса при ИЗСД и функции антигенов в развитии нарушений секреции инсулина придается органоспецифическим МКА. Получена серия МКА, специфически реагирующих с островковыми клетками (см. таблицу) [98]. МКА К28А1 взаимодействуют с поверхностью, а МКА K28D6 - также с цитоплазмой островковых клеток. МКА K28AI, K56aF3 вызывают комплементзависимый цитолиз 0-клеток и ингибируют секрецию инсулина [99, 100]. Ни одно из МКА этой серии не взаимодействует с лимфоцитами периферической крови и не обладает антилимфоцитарной цитотоксичностью. Связывание МКА К28А1 и К69аА12 с островковыми клетками и угнетение секреции инсулина имеют обратимый характер [101]. Предполагается, что в основе этого эффекта - нарушение транспорта катионов через мембрану и тем самым синергического действия глюкозы и цАМФ [102]. Кроме антигенных детерминант, присутствующих в норме на поверхности и в цитоплазме островковых клеток в свободном состоянии, существуют маркеры, экранированные сиаловыми кислотами, функция которых тем не менее может ассоциироваться с развитием аутоиммунного процесса при ИЗСД. МКА Е5С2 реагируют с 5 % интактных RINm5F-Kje- ток, а после обработки 5 мкед/мл нейраминидазы с - 75%. На криосрезах поджелудочной железы и в культуре нормальных островковых клеток после обработки нейраминидазой, но не трипсином и гиалуронидазой, МКА Е5С2 выявляют инсулинпозитивные клетки человека и крысы. Другие эндокринные клетки крысы, а также нервные, мышечные ткани и печень после обработки нейраминидазой не экспрессируют антиген Е5С2, однако обнаруживается слабая реактивность с эпителием клубочков почки. МКА цитотоксичны в отношении нормальных островковых клеток, обработанных нейраминидазой, и не лизируют ряд клеточных линий крысы - LC540 (тестикулярных клеток Лейдига), GH3 (опухоли гипофиза), 2НЗ (базофильного лейкоза), а также фибробласты и сплено- циты. МКА Е5С2 выявляют два гликопротеида с мол.м. 60 и 68 кД с возможной карбогидратной структурой Neu Ас 2-3/6 Gal 1 - 4GlcNAc - R. Причем после того, как нейраминидаза разрывает ковалентную связь с сиаловой кислотой (Neu Ac), Е5С2 взаимодействует с высвобожденной структурой [103]. Таким образом, в отличие от трансформированных на нормальных островковых клетках антигенные детерминанты Е5С2 присутствуют только в экранированном остатками сиаловых кислот состоянии. «Раскрытию» этих антигенов способствует воздействие нейраминидазы. Известно, что нейраминидаза присутствует в лизосомах клеток, а также во многих микроорганизмах. В частности, инфицирование вирусами может привести к отщеплению сиаловых кислот и обнажению кар- богидратных структур, в связанном виде не распознаваемых иммунной системой, а в «раскрытом» состоянии являющихся триггером аутоиммунного процесса при ИЗСД. Однако несмотря на то что описанные МКА высокоспецифичны по отношению к островковым клеткам, полностью использовать их возможности для изучения патогенеза ИЗСД не удалось. Наиболее хорошо изучено участие в развитии ИЗСД одного из маркеров 0-клеток с относительной молекулярной массой субъединиц 64 и 65 кД (так называемого антигена р64). МКА ЗА4 (IgM-класса) преципитирует в |251-меченных экстрактах клеток инсулиномы хомяка (In-llI) белок с мол.м. 64 кД и копреципитирует внутриклеточный белок 28 кД [104]. МКА ЗА4 не оказывают комплементзависимого цитотоксического эффекта в отношении In-III-клеток. В то же время наблюдается зависимый от антител клеточный цитолитический эффект при концентрации МКА 10 мкг/мл в отношении In-III-клеток в присутствии эффекторов-макрофагов мыши. Показано, что МКА ЗА4 значительно угнетают высвобождение инсулина 0-клетками при стимуляции 16,7 мМ глюкозы [105]. Наблюдае- мне эффекты свидетельствуют в пользу того, что функция антигенов, выявляемых МКА ЗА4, может быть связана с развитием аутоиммунного процесса при ИЗСД. Подтверждением патогенетической роли антигенной детерминанты р64 являются результаты исследования этого маркера при помощи МКА МС4Е4 и ICA-1. МКА МС4Е4 (IgM-клас- са) продуцируют лимфоциты ребенка в предиабетическом состоянии, которые были затем трансформированы ЭВБ [106]. МКА МС4Е4 взаимодействуют с поверхностью островковых клеток крысы, а также с островковыми клетками человека на криосрезах поджелудочной железы. Эти МКА не реагируют с другими эндокринными клетками, а также элемента-, ми цитоскелета. Из лизатов островковых клеток крысы и человека МКА МС4Е4 преципитируют белки с мол. м. 64 и 56 кД. МКА ICA-1 (IgM-класса) из лизатов островковых клеток этих видов, а также хомяка преципитируют аналогичные по молекулярной массе белки 64 и 56 кД. Однако с помощью двухмерного электрофореза (ДСН-ПАГЭ) показано, что, кроме субъединицы 56 кД, присутствуют еще 3 субъединицы с мол. м. 64 , 67 и 69 кД, причем изоэлектрическая точка (pl) всех субъединиц равна 6,5. Антигенный комплекс, выделенный при помощи МКА ICA-1, получил название семейства антигенов р64 -69. Подобно МКА ЗА4, МКА ICA-1 in vitro ингибирует стимулируемую глюкозой секрецию инсулина [107]. Таким образом, изучение антигенов островковых клеток при помощи МКА приводит к представлению о едином пути функциональной дифференцировки нейроэндокринной ткани, направленной на синтез и секрецию пептидных гормонов. Так, RlNmSF-клетки после обработки бутиратом Na экспрессируют комплекс А2В5 и 3G5 ганглиозидов, характерный для нормальных островковых клеток. При этом снижается пролиферативная активность и увеличивается уровень секреции инсулина - появляются признаки дифференцировки клеток [108, 109]. Показано также участие антигена р64 в инсулин- секреторной функции in vitro. Однако механизм влияния антигенов р-клеток на процессы синтеза и секреции инсулина не ясен. IV.2. Аутоантитела к антигенам островковых клеток Сыворотки 60-80 % больных с впервые выявленным ИЗСД содержат аутоантитела к цитоплазматическим антигенам островковых клеток (cylCA). Предполагается, что cylCA, подобно МКА к гликолипидным антигенам, взаимодействуют с углеводными детерминантами гликоконъюгатов островковых клеток, поскольку cylCA сыворотки, предварительно инкубированные с фракцией GM3 моносиалоганглиозидов поджелудочной железы, не реагируют со срезами органа [ 110]. Экспрессия моносиалоганглиозидов в человеческих островках носит гетерогенный характер, в связи с чем выделить с применением тонкослойной хроматографии изолированный пик, ассоциированный с cylCA, не удалось. J. Thomas и соавт. в 1987 г. методом CELISA показали, что субклоны RINmSF-клеток, экспрессирующие ганглиозиды (A2B5-F), имеют более высокий уровень связывания с cylCA (±)-сывороткой больных ИЗСД по сравнению с нормальной сывороткой [111]. Аутоантитела к антигенам гликолипидной природы при развитии диабета обнаружили также у крыс ВВ, однако они выявляли антиген другой природы нейтральный гликолипид [112]. В доклиническом периоде развития ИЗСД человека, крыс ВВ и мышей NOD обнаруживаются также циркулирующие аутоантитела к поверхностным антигенам островковых клеток (sICA). Показан специфический цитотоксический эффект sICA у ряда больных в присутствии комплемента (С') в отношении островковых клеток крысы и человека [113]. Причем эти sICA фиксируют комплемент на 0-клетках при 37 °C, а на других типах островковых клеток - также и при 4 °C. В дальнейшем оказалось, что эти комплементфиксирующие 1СА (CF-sICA) не способны разрушать 0-клетки в отсутствие цитотоксических Т-клеток-эффекторов [114]. Большое значение имеет факт влияния аутоантител к антигенам островковых клеток на секрецию инсулина in vitro. Сыворотка больных ИЗСД, содержащая sICA, ингибирует стимулированную глюкозой секрецию инсулина [115]. Путем использования сочетания мечения мембран островковых клеток |251 и биосинтетического мечения 358-метиони- ном, обнаружили, что IgG sICA (±)-сывороток больных ИЗСД распознают белок с мол. м. 64 и 65 кД антиген р64. Появление аутоантител к антигену р64 совпадает с начальным этапом нарушения функции 0-клеток, т. е. предшествует* cylCA и коррелирует с обнаружением sICA. Исследование аутоантител к антигену р64 при различных аутоиммунных заболеваниях показало, что сыворотки больных аутоиммунным тиреоидитом, болезнью Хашимото, Аддисона, системной красной волчанкой и полиэндокринопатиями не преципитировали аналогичный маркер из меченных 35Б-ме- тионином лизатов островков человека. Тканевое распределение антигена р64 показало его специфичность в отношении островковых клеток вне зависимости от вида - человек или животные (собаки, крысы, мыши, хомяки). В настоящее время не ясно, гликолипидный антиген или антиген р64 являются мишенью аутоиммунной деструкции в развитии ИЗСД. Анализ структуры и функции антигенов при помощи МКА является полезным для выяснения механизмов клеточного и гуморального иммунного ответа, а также разработки специфичных тестов на доклиническое выявление ИЗСД [116]. IV.3. Аутоантиген р-клеток р64 - декарбоксилаза глутаминовой кислоты? В конце 1990 г. были опубликованы данные, что антиген р64 обладает активностью фермента - декарбоксилазы глутаминовой кислоты [117]. Этот фермент в присутствии кофактора - пиридоксальфосфата, катализирует превращение глутаминовой кислоты в гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК) с выделением углекислого газа [118]. Оказалось, что ГДК - видонеспецифический белок, иммунохимическая характеристика которого сходна с антигенным комплексом р64/р64-69. В частности, молекулярная масса нативной ГДК. выделенной из экстракта головного мозга крыс при помощи гель-хро- матографии или аффинной хроматографии, составляет 120± ±10 кД [119]. При анализе этого материала в ДСН-ПАГЭ в редуцирующих условиях определяются белковые зоны окрашивания в области мол. м. 63-65 и 55-59 кД [120]. В вестерн- блоте с МКА GAD-1 к ферменту ГДК также определяются гетерогенные по молекулярной массе иммунореактивные субъединицы с мол. м. 62±2 и 59±2 кД [121]. Таким образом,'ГДК представлена различными по молекулярной массе субъединицами, причем в отличие от млекопитающих у низших позвоночных определяется только одна субъединица - 55-59 кД. Ранее ГДК обнаруживали только в ГАМКергических структурах мозжечка, поэтому в литературе охарактеризована мозговая форма этого фермента. В настоящее время показано, что в островках поджелудочной железы содержится ГАМК в высокой концентрации (2,51 мМ/кг) и соответственно опре-» деляется высокая активность ГДК [122]. Нами обнаружена активность ГДК также в культивируемых островковых клетках, используемых для выделения семейства антигенов р64-69. Этот фермент содержится в мембранной и цитозольной фракциях и отсутствует в ядрах островковых клеток. Из лизатов островковых клеток на иммуносорбенте с МКА ICA-1 аффинно очищен антигенный материал р64-69, в котором выявляется активность ГДК. Таким образом, семейство антигенов р64-69 обладает активностью ГДК. В связи с этим возникает необходимость исследовать возможную идентичность антигенного комплекса р64-69 0-клеток и ГДК головного мозга. Основным источником ГДК в головном мозге являются ГАМКергические структуры мозжечка. Оказалось, что в нРИФ МКА 1СА-1 окрашивают ГАМКергические нейроны, в том числе клетки Пуркинье, на криосрезах мозжечка крысы. 1СА-пози- тивные сыворотки больных ИЗСД, конкурирующие с МКА ICA-1 за места связывания на островковых клетках, также окрашивают аналогичные структуры. Кроме того, МКА ICA-1 и сыворотки больных ИЗСД, содержащие антитела к семейству антигенов р64-69, преципитируют из лизатов мозжечка крысы белки с активностью ГДК. Далее, последовательная иммунопреципитация сывороткой больного ИЗСД, которая в предыдущем эксперименте преципитировала белки мозжечка с активностью ГДК, и МКА ICA-1 показала, что аутоантитела больных ИЗСД и МКА ICA-1 выявляют идентичный антиген с активностью ГДК. Полученные данные позволяют сделать предположение об идентичности семейства антигенов р64-69 островковых клеток и ГДК головного мозга. Вместе с тем следует отметить гетерогенный характер иммунореактивности сывороток больных ИЗСД с ГДК головного мозга: значительная активность ГДК отмечается только в иммунопреципитатах с сыворотками, содержащими антитела к семейству антигенов р64-69 в высоком титре. Возможно, ГДК островков поджелудочной железы и головного мозга представлены различными изоформами данного фермента, различающимися по спектру антигенных детерминант. Наше предположение о возможной идентичности семейства антигенов р64-69 и ГДК головного мозга подтверждается данными, полученными S. Baekkeskov и соавт. [117]. Показано, что аутоантитела к мозговой форме ГДК являются патогенетическим признаком редкого неврологического заболевания - синдрома ригидного человека (СРЧ). При этом заболевании описана высокая частота развития ИЗСД. Авторы исследовали возможную идентичность антигена-мишени при СРЧ и ИЗСД. Эксперименты по последовательной преципитации экстрактов мозжечка антн-ГДК-антителами и анти-р64-антителами показали, что антитела к ГДК больных СРЧ блокируют связывание анти-р64-антител с ГДК, что подтверждает предположение об идентичности ГДК и антигена р64. Следует отметить, что иммунореактивность сывороток больных ИЗСД с мозговой формой ГДК имеет гетерогенный характер. По результатам структурно-функционального анализа антигена р64/р64-69 р-клеток - это фермент глутаматдекарбоксилаза. При этом нами обосновано существование различных по иммунореактивности изоформ ГДК - островковой и мозговой. Действительно, в октябре 1991 г. американскими специалистами была определена первичная структура островковой изоформы этого фермента и показана 92 % гомология с первичной структурой мозговой изоформы [123, 124]. На 11-м Международном рабочем совещании по иммунологии диабета (Нагасаки, 1991) большое внимание специалистов было уделено изучению развития аутоиммунных реакций на ГДК и доказательству патогенетической роли этой структуры в развитии ИЗСД 1125]. В том числе нами были представлены данные о селективном связывании сывороток впервые выявленных больных ИЗСД с синтетическим пептидом MS-579, воспроизводящим первичную структуру одного из предполагаемых антигенных участков, расположенного вблизи N-концевого участка мозговой изоформы ГДК. В настоящее время в Институте иммунологии проводится интенсивная работа по синтезу пептидов - аналогов антигенных детерминант ГДК с целью разработки иммунодиагностических тест- систем. В заключение следует отметить, что механизм развития ИЗСД носит аутоиммунный характер: 1) определяются аутоантитела к собственным антигенам р-клеток; 2) имеется гипотетический антиген-мишень аутоиммунного ответа - р64/ГДК; 3) в островках наблюдаются мононуклеарная инфильтрация и специфическое воспаление - инсулит; 4) возможен пассивный перенос заболевания посредством лимфоидных клеток или сыворотки больного. Обобщая известные данные, можно определить дебют аутоиммунного ИЗСД как критическую стадию резистентности к собственным антигенам. Каким образом нарушается иммунологическая толерантность в отношении собственных антигенов р-клеток и развивается аутоиммунный процесс деструкции, в настоящее время не ясно. Вероятно, инициация происходит за счет эндо- или экзогенных факторов, которые вызывают высвобождение или повреждение собственных антигенов р-клеток. В результате развивается иммунный ответ на эти видоизмененные структуры. Первый этап при этом - захват и процессинг антигена АПК, наиболее вероятно, макрофагом. В результате процессинга антиген презентируется на поверхности АПК и распознается в контексте с собственной молекулой МНС II класса Тх-клетками, экспрессирующими специфические для данного антигена рецепторы. Параллельно активированные при процессинге антигена и в результате взаимодействия с Тх АПК секретируют медиаторы иммунного ответа - цитокины. Эти растворимые антигеннеспецифические факторы усиливают иммунный ответ. Кроме того, цитокины, обладающие хемотаксическим свойством, способствуют миграции Т- и В-лимфоцитов, Мф, NK-клеток в островки. Секретируемые Тх в присутствии антигена лимфокины - промоторы роста Т- и В-клеток (ИЛ-2) и фактор роста В-лимфоцитов приводят к клональной экспансии предшественников Т- и В-клеток. Последние дифференцируются в цитотоксические Т-клетки, супрессорные Т-клетки или антителопродуцирующие плазматические клетки. Клетки-эффекторы и аутоантитела участвуют в селективной деструкции 0-клеток. Этот механизм иммунного ответа детерминирован по времени и прекращается после элиминации антигена [126]. Наблюдающийся при развитии ИЗСД длительный латентный период и полиморфизм проявлений инсулита не противоречат предполагаемому механизму действия клеток-эффекторов, так как островки поджелудочной железы представляют собой изолированные структуры, диффузно расположенные в железе. С началом аутоиммунной деструкции высвобождаются антигены разрушенных 0-клеток, которые презентируются макрофагами Т-клетками с дальнейшим образованием спектра аутоантител и цитотоксических Т-лимфоцитов. Поэтому в различных островках либо еще начинается презентация антигена АПК и определяются единичные мононуклеары, либо уже мигрируют аутореактивные Т-клетки и на гистологических срезах хорошо определяется инсулит, причем эти процессы не синхронизированы по времени [127].