Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Влияние компонентов плазмы крови на гликозилирование сывороточного альбумина человека

https://doi.org/10.14341/probl12043

Содержание

Перейти к:

Аннотация

Изучено гликозилирование сывороточного альбумина человека (САЧ) с повышением концентрации глюкозы. Инкубационная среда содержала 5% САЧ и глюкозу в концентрациях 11, 22, 44 и 88 ммоль / л. Степень гликозилирования оценивали по конечному продукту, фруктозамину. Была обнаружена линейная корреляция между концентрацией глюкозы и фруктозамином. Добавление в инкубационную среду нативной плазмы человека нормального субъекта или диабетика с заболеванием типа I (50% от исходного объема) надежно ингибировало гликозилирование. Были идентифицированы термостабильные низкомолекулярные вещества, которые вызывают задержку гликозилирования: креатинин, мочевая кислота и аргинин. Добавление этих соединений в физиологических концентрациях достоверно снижало гликозилирование САЧ. Следовательно, мы нашли компоненты системы защиты плазмы крови, которые предотвращают образование фруктозамина при гипергликемии.

Для цитирования:


Лебедева E.А. Влияние компонентов плазмы крови на гликозилирование сывороточного альбумина человека. Проблемы Эндокринологии. 1996;42(3):32-34. https://doi.org/10.14341/probl12043

For citation:


Lebedeva Ye.A. Effect of blood plasma components on human serum albumin glycosylation. Problems of Endocrinology. 1996;42(3):32-34. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl12043

Гликозилирование белков — это неферментативный процесс присоединения глюкозы к аминогруппам белка [3, 5], неспецифическая реакция, в которую вовлекаются белки сыворотки крови, структурные белки базальных мембран (коллаген, эластин, тубулин), белки мембран эритроцитов и др. Гликозилирование изменяет физико-химические и физиологические свойства белка. По современным представлениям, гликозилирование является пусковым механизмом в формировании диабетических ангиопатий [1, 7, 15]. На процесс гликозилирования влияют концентрация глюкозы и время экспозиции (наиболее значительно через 20 и более дней после начавшегося повышения концентрации глюкозы крови).

Белки плазмы крови подвергаются интенсивному гликозилированию при сахарном диабете [6, 9]. Сумма гликозилированных белков плазмы называется фруктозамином. Среди них доминирует альбумин, который составляет более 60% от всех сывороточных белков [2].

Реакция гликозилирования может успешно протекать не только в организме, но и в пробирке. Описаны методики гликозилирования сывороточного альбумина человека (САЧ) в термостате при 37°С, где образование фруктозамина наблюдали уже через 7 дней [14]. Гликозилирование может происходить и при инкубации среды, содержащей глюкозу и белок, при 1—2°С [12]. Инкубация САЧ в присутствии глюкозы в опытах in vitro позволяет определить степень гликозилирования путем изучения концентрации конечного продукта — фруктозамина.

Целью работы было изучение влияния на процесс гликозилирования веществ, содержащихся в нативной плазме крови человека.

Материалы и методы

Содержание фруктозамина в плазме крови или в искусственной среде определяли методом, основанным на способности фруктозамина восстанавливать тетразолий нитросиний в щелочной среде [5]. 0,1 мл исследуемой жидкости вносили в среду, содержащую 57 мкмоль тетразолия нитросинего, и добавляли карбонатный буфер pH 10,35. Смесь инкубировали в течение 10 мин на водяной бане при 37°С, а затем измеряли плотность с помощью фотоэлектроколориметра при длине волны 530 нм. В качестве стандарта были взяты образцы САЧ, которые инкубировали с глюкозой в концентрации 44 ммоль/л в течение 30 дней при 1—2”С. При этом САЧ был полностью гликозилирован, а содержание фруктозамина — максимальным. В качестве исходного реагента был взят САЧ фирмы ''Re- anal''. Из смеси нескольких образцов полностью гликозилированного САЧ были сделаны разведения и построен калибровочный график, который позволял выразить степень гликозилирования белка в микромолях полностью гликозилированного САЧ. График предусматривал, что содержание фруктозамина в нативном неинкубированном САЧ равно нулю.

Среда для инкубации в холодильнике при 1—2"С содержала 1 мл% САЧ, глюкозу в конечной концентрации 44 ммоль/л или в ряде опытов в концентрации 11, 22, 88 ммоль/л. Смесь была приготовлена на фосфатном 0,05 М буфере и находилась в холодильнике. Ее анализировали на содержание фруктозамина на 5, 10, 15 и 20-й день от начала инкубации.

В среду инкубации в отдельных опытах добавляли аминокислоты, мочевину, мочевую кислоту, креатинин в концентрации 10_3 М. Вначале проводили скрининговые опыты, позволяющие приблизительно оценить влияние этих соединений на процесс гликозилирования и выбрать из них наиболее эффективные, а затем ставили опыты с большим числом наблюдений для статистической обработки результатов. Сначала для всех изучаемых веществ применяли концентрацию 10_3 М, она позволяла сравнительно оценить влияние всех соединений на гликозилирование. Однако в заключительных иссле-

Гликозилирование 5% САЧ при различных концентрациях глюкозы в среде в течение 28 дней.

По оси ординат — концентрация полностью гликозилированного САЧ (в мкмоль/л); по оси абсцисс — время от начала инкубации (в сут). 1 — концентрация глюкозы 11 ммоль/л, 2—22 ммоль/л, 3 — 44 ммоль/л, 4—88 ммоль/л.

дованиях были использованы те концентрации, в которых эти вещества находятся в плазме крови.

Результаты и их обсуждение

В I серии опытов изучали гликозилирование САЧ различными концентрациями глюкозы. Из рисунка видно, что при концентрации глюкозы 11 ммоль/л происходит образование незначительного количества полностью гликозилированного САЧ в среде. Концентрации глюкозы 22, 44, 88 ммоль/л к 28-му дню инкубации значительно повышают содержание гликозилированного САЧ, причем чем больше концентрация глюкозы, тем быстрее наступает гликозилирование. Данные отдельных опытов, приведенные на рисунке, позволили судить о выраженности процесса гликозилирования при концентрации глюкозы в среде 44 ммоль/л, которая и была взята в последующих опытах как эталон для дальнейших экспериментов.

Во II серии опытов в среду инкубации, содержащую 5% САЧ и 44 ммоль/л глюкозы, была добавлена плазма крови здорового человека и плазма больного диабетомв стадии декомпенсации заболевания в количестве 50% от объема инкубационной среды. Инкубацию проводили в течение 14 дней в холодильнике.

Из табл. 1 следует, что процесс гликозилирования идет во всех трех пробах по сравнению с инкубированным САЧ. В среде с добавлением к САЧ глюкозы процесс гликозилирования значителен (273,3 ± 6,6 мкмоль/л), в то время как при добавлении плазмы здорового человека величина гликозилирования снижается и составляет лишь 19,0 ±1,3 мкмоль/л (р2 < 0,001), так же, как и при добавлении плазмы больного диабетом — 22,6 ± 0,57 мкмоль/л (р2 < 0,001). Таким образом, и плазма здорового человека, и плазма больного диабетом снижают степень гликозилирования, что было показано нами в предыдущей публикации [4].

Для того чтобы выяснить, какие вещества плазмы обладают способностью подавлять гликозилирование САЧ, мы провели термическую обработку плазмы при 100°С в течение 2 мин. Оказалось, что жидкость, отделенная центрифугированием от коагулированных белков плазмы, способна в такой же степени угнетать гликозилирование САЧ. Так, после 14 дней инкубации образование гликозилированного САЧ в его 5% растворе составило 273 ± 6,6 мкмоль/л, в то время как после добавления жидкой части коагулированной плазмы — 13,44 ± 0,87 мкмоль/л (р < 0,001). Таким образом, можно предположить, что вещества, подавляющие гликозилирование, не относятся к термолабильным соединениям. Они, очевидно, не могут быть отнесены и к белкам. Мы предположили, что этими соединениями являются низкомолекулярные вещества плазмы, оказывающие конкурентное влияние на реакцию гликозилирования. Хорошо известно, что гликозилирование является следствием взаимодействия глюкозы с аминогруппами аминокислот белка. Не исключено, что такими веществами, конкурентно угнетающими процессы гликозилирования, могут быть соединения, содержащие аминогруппу: аминокислоты, мочевина, мочевая кислота, креатинин и др.

Были проведены скрининговые опыты с целью хотя бы ориентировочно выявить соединения, способные в принятой нами концентрации 10~3 М вызывать снижение гликозилирования. Были изучены следующие вещества: глутаминовая кислота, лейцин, лизин, гистидин, цистеин, аргинин, а также мочевина, мочевая кислота, креатинин. По результатам ориентировочного исследования 3 соединения обнаружили тенденцию к подавлению процесса гликозилирования. Поэтому в последующем они были более тщательно исследованы в сериях опытов, позволяющих провести статистическую обработку данных. Аргинин статистически достоверно угнетал процесс гликозилирования САЧ — с 151 ± 18,6 до 31,3 ± 7,9 мкмоль/л (р < 0,001), мочевая кислота — до 1,7 ± 1,7 мкмоль/л (р < 0,001), однако снижение, вызываемое креатинином, было статистически недостоверно.

Таким образом, далеко не все вещества, содержащие аминогруппы, способны вызывать снижение гликозилирования, но 2 из них дают статистически достоверный эффект в концентрации 10_3 М. В последующем мы изучили действие мочевой кислоты и аргинина на гликозилирование при более низкой концентрации глюкозы (17 ммоль/л), которая часто регистрируется у больных сахарным диабетом (табл. 2).

Таблица 1

Влияние плазмы здорового человека и плазмы больного сахарным диабетом на гликозилирование САЧ при концентрации глюкозы в среде 44 ммоль/л в течение 14 дней

Статиста- ческий показатель

Концентрация полностью гликозилированного САЧ (в мкмоль/л) в среде, содержащей

САЧ

САЧ и глюкозу

САЧ, глюкозу и плазму здорового человека

САЧ, глюкозу и плазму больного диабетом

М ± т

0

273,3 ± 6,6

19,0 ± 1,3

22,6 ± 0,57

п

9

9

9

9

Р\

<0,001

<0,001

<0,001

Р1

<0,001

<0,001

Примечание. pt достоверность различий со средой, содержащей один САЧ; р2 со средой, содержащей один САЧ и глюкозу.

Таблица 2

Влияние мочевой кислоты, креатинина, аргинина в концентрации 10~3 М на гликозилирование САЧ при концентрации глюкозы в среде 17 ммоль/л в течение 14 дней

Статисти- веский показатель

Концентрация полностью гликозилированного САЧ (в мкмоль/л)

контроль

мочевая кислота

креатинин

аргинин

М ± т

45,0 ± 5,88

8,25 ± 6,07

33,66 ± 5,78

0

п

9

9

9

9

р

<0,001

>0,05

<0,001

При более низкой концентрации глюкозы в крови мочевая кислота и аргинин (но не креатинин) статистически достоверно подавляют процесс гликозилирования, причем аргинин действует даже более сильно, чем мочевая кислота, что отличает данную серию опытов от предыдущей.

Наконец, решено было создать в инкубационной среде такие концентрации всех трех изучаемых нами веществ, которые в норме присутствуют в плазме крови, и выяснить, может ли такая среда тормозить гликозилирование САЧ. Содержание САЧ в среде составило 5%, глюкозы — 17 ммоль/л, аргинина — 3 мг/100 мл, креатинина — 2 мг/100 мл, мочевой кислоты — 10 мг/100 мл.

В контроле на 14-й день инкубации содержание полностью гликозилированного САЧ было 38,8 ± 5,88 мкмоль/л, а ппи инкубации с физиологическими концентрациями всех трех веществ — 12,88 ± 5,29 мкмоль/л (р < 0,01).

Таким образом, содержащиеся в плазме крови низкомолекулярные соединения — мочевая кислота, аргинин и, возможно, некоторые другие — способны тормозить процесс гликозилирования САЧ при повышении концентрации глюкозы в крови. Не исключено, что аргинин соединяется с глюкозой, такое взаимодействие может быть конкурентным по отношению реакции связывания глюкозы с аминогруппами белка. Известно, что аргинин в части своей формулы похож на аминогуанидин — вещество, которое известно как эффективный блокатор гликозилирования белка [13, 16]. Аминогуанидин не препятствует образованию первичных продуктов гликозилирования, к которым относится фруктозамин. Аминогуанидин блокирует дальнейшее превращение этих соединений, так как образует с ними неактивные комплексы, не способные к дальнейшим модификациям и образованию ковалентных связей между молекулами. Длительное применение аминогуанидина препятствует формированию диабетических ангиопатий [8, 10, 11].

Механизм действия мочевой кислоты не совсем ясен. Не исключено, что она может изменить структуру белка так, что аминогруппы становятся менее доступны для соединения с глюкозой.

Очень важно, что аргинин, мочевая кислота и креатинин способны предотвращать гликозилирование в тех концентрациях, в которых они содержатся в плазме крови, и при действии концентраций глюкозы, которые могут наблюдаться у больных диабетом. Не исключено, что эти соединения составляют часть системы, препятствующей гликозилированию белков и развитию диабетических ангиопатий.

Выводы

  1. В плазме крови обнаружены низкомолекулярные, термоустойчивые соединения, которые в физиологических концентрациях препятствуют гликозилированию САЧ.

Система, препятствующая гликозилированию САЧ, включает аргинин, мочевую кислоту и в небольшой степени креатинин. Возможно и наличие других содержащих аминогруппы соединений, угнетающих процесс гликозилирования белка.

Список литературы

1. Балаболкин М. И. Сахарный диабет. — М., 1994.

2. Викторова Л. Н., Наводный О. А., Городецкий В. К. // Лаб. дело. — 1990. — № 1. — С. 14—16.

3. Денисенко Т. В. // Вопр. мед. химии. — 1990. — № 2. — С. 5—10.

4. Лебедева Е. А. // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической фармакологии. — Смоленск, 1994. — С. 70-71.

5. Свистунова О. И., Титов В. Н. // Клин. лаб. диагност. — 1992. - № 11-12 - С. 22—30.

6. Arbuster D. А. // Clin. Chem. — 1987. — Vol. 33, N 12. — P. 2153-2163.

7. Brownlee M, Cerami A., Vlassara H. // N. Engl. J. Med. — 1988 - Vol. 318, N 20. - P. 1315—1321.

8. Cameron N. Е, Cotter M. A. // Diabet. Metab. Rev. — 1994. - Vol. 10, N 3. - P. 189-224.

9. Guthrow C. Е., Morris M. A., Day J. B. et al. // Proc. natl. Acad. Sci USA. — 1979. - Vol. 76. - P. 4258-4261.

10. Hammes H. P., Uhlmann M, Weis A., Federlin K. // Europaen Association for the Study of Diabetes. Annual Meeting, 29-th: Abstracts. — Istanbul. 1993. — P. A50.

11. Huijberts M. S. P, Wolttenhuttel B. H. R, Grijns F. R. J. // J. Amer. Diabet. Assoc. — 1993. — Vol. 42, Suppl. 1. — P. 96A.

12. Moldrem J, Robinson P, Wong Z. et al. // Ibid. — P. 4A.

13. Odetti P. R., Borgoglio A., Pascale A. et al. // Diabetes. — 1993 - Vol. 39, N 7. - P. 796-802.

14. Tarsio J., Reger L. A., Fiircht L. T. // Ibid. — 1988. — Vol. 37, N 5. - P. 532-539.

15. Vlassara H. // Diabet. Care. — 1990. — Vol. 13, N 11. — Suppl. 4. - P. 1180—1185.

16. Williamson J. R, Chang K, Ido Y. et al. // Diabet. Metab. — 1990 - Vol. 16, N 4. - P. 369-370.


Об авторе

E. А. Лебедева
Самарский государственный медицинский университет
Россия


Рецензия

Для цитирования:


Лебедева E.А. Влияние компонентов плазмы крови на гликозилирование сывороточного альбумина человека. Проблемы Эндокринологии. 1996;42(3):32-34. https://doi.org/10.14341/probl12043

For citation:


Lebedeva Ye.A. Effect of blood plasma components on human serum albumin glycosylation. Problems of Endocrinology. 1996;42(3):32-34. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl12043

Просмотров: 1128


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)