Гистофлюориметрическая оценка содержания инсулина в эндокринной ткани поджелудочной железы крыс в постреанимационном периоде

По справедливому утверждению В. А. Неговского [10], среди систем организма, принимающих непосредственное участие как в процессе умирания, так и в постреанимационном периоде (ПРП), изменения в нейроэндокринной регуляции приобретают ведущее значение. Во время остановки кровообращения нейроэндокринная регуляторная система испытывает острое кислородное голодание, неизбежно приводящее к глубоким метаболическим, функциональным и структурным нарушениям в деятельности инкреторного аппарата организма. В исследованиях А. В. Волкова [3] выявлена специфика нарушений эндокринного статуса оживленных животных и показано его решающее влияние на исход реанимации. Изучение динамики гормонов в ПРП показало, что, начиная с первых минут после оживления, формируется новый и во многом извращенный гормональный баланс организма [6]. В частности, в крови оживленных крыс резко возрастал уровень глюкагона и инсулина (Ин), определенный радиоиммунологическими методами [6]. Более детальное изучение гормонов поджелудочной железы (ПЖ), осуществленное Е. Н. Сочневой, выявило сложную картину расстройств гомеостаза глюкозы и гормонального равновесия этой железы в ПРП. Уже через 3 ч после реанимации отмечалось достоверное повышение уровня глюкозы в 1,5 раза, глюкагона в 4,3 раза, а Ин в 1,2 раза. Но и в более поздние сроки опыта тенденция к росту указанных параметров углеводного обмена сохранялась [13]. Сложившаяся в экспериментах Е. Н. Сочневой парадоксальная ситуация с одновременным длительным повышением уровня трех основных регуляторов углеводного гомеостаза не укладывается ни в одну из четырех стандартных картин диабета, описанных И. Г. Ак- маевым [1], что в свою очередь подтверждает развиваемую им особую форму гипоталамической и бульбарной регуляции деятельности островковых клеток ПЖ [2].

Это обстоятельство и побудило нас обратиться к морфологическому анализу состояния эндокринного аппарата ПЖ крыс в различные сроки ПРП с количественным определением содержания Ин в островковых В-клетках в гистологических срезах железы. До настоящего времени оценка функционального состояния В-клеток по со

авторы выражают глубокую признательность д-ру мед. наук Г. Г. Мейрамову (Карагандинский медицинский институт) за предоставление диэтилпсевдоизоцианина (фирма "Ser- va", ФРГ) для окраски срезов и их гистофлюориметрический анализ, благодарят д-ра мед. наук В. И. Корчина за интерес к работе и канд. мед. наук Б. И. Медведева за помощь в микрофотографии.

держанию Ин в различных условиях эксперимента проводилась лишь в культурах эндокринной ткани ПЖ [7—9, 14].

Материалы и методы

Опыты проведены на 42 белых беспородных крысах массой 160—230 г. 10-минутную клиническую смерть моделировали по методу В. Г. Корпачева путем пережатия сосудистого пучка у основания сердца [5]. Реанимационные мероприятия включали непрямой массаж сердца и искусственную вентиляцию легких [5, 6]. ПЖ извлекали через 3, 9 ч, 3, 5, 7, 14 и 30 сут после оживления. 7 интактных крыс служили контролем. Материал фиксировали в жидкости Буэна, заливали в парафин. Для выявления депонированного в клетках панкреатических островков Ин использовали псевдоизоцианиновую окраску срезов [16J. Она основана на взаимодействии в В- клетках диэтилпсевдоизоцианинхлорида с А-цепыо молекулы Ин и проявляется яркой флюоресценцией островковых В-кле- ток [17]. Для количественной оценки Ин в островковых клетках РЖ в разные сроки после реанимации животных использовали микрофлюориметрическую приставку, апробированную Г. Г. Мейрамовым [7—9]. Все цифровые данные обработаны статистически. Микрофотосъемку осуществляли на фотопленке "Свема" А-2 чувствительностью в 400 ед.

Результаты и их обсуждение

При изучении окрашенных псевдоизоцианином препаратов ПЖ и у подопытных, и у интактных животных в поле зрения отчетливо выявлялись флюоресцирующие ярко-красным светом островки (Ост) Лангерганса. Наиболее интенсивно светилась центральная зона островковых клеток, представленная инсулинпродуцирующими В- клетками. Ближе к периферии Ост флюоресценция В-клеток уменьшалась, но нередко и за пределами Ост выявлялись одиночные ярко флюоресцирующие В-клетки. При использовании визуального метода оценки интенсивности флюоресценции обнаружены различия в степени свечения Ост подопытных животных (см. рисунок, б— г) по сравнению с контрольными (см. рисунок, а). Но оценка интенсивности флюоресценции инсулинсодержащих клеток у экспериментальных животных в разные сроки ПРП не может быть выявлена визуально. Флюориметрия здесь оказалась не только необходимым, но и единственно объективным методом определения в относительных единицах содержания Ин в панкреатических Ост [7], который позволил во всех исследованных случаях установить достоверные различия между опытными и контрольными данными. Результаты исследования отражены в таблице.

Гистофлюориметрический метод оценки содержания Ин в В-клетках Ост позволяет проводить одновременный сочетанный анализ структуры и функции инсулинпродуцирующих клеток на различных этапах постреанимационного состояния животного. Так, уже через 3 ч после оживления

Инсулинпродуцирующие В-клетки в панкреатических Ост (а—г), ацинусах (д) и протоковом эпителии (е, ж) крыс в ПРП.

Ок. х 7, об. х 40. Фиксация в жидкости Буэна. Окраска псевдоизоиианином. а — контроль; 6 — через 3 ч после оживления; в — через 9 ч; г — на 3-и сутки после реанимации; д — инсулинпродуцирующие В-клетки в ацинусах ПЖ; в, ж — те же клетки в протоковом эпителии ПЖ.

уровень Ин в В-клетках достоверно снижается в 1,3 раза, ччо наахдит свое              в сттуктууе

этих клеток. Как втдао на рисунке, б, инсулин- продуцирующие клетки приобретают гетероморф- адсть, межклеточные щели освобождаются от гормона, наблюдаются отдельные В-клетки с апикальной локализацией Ин вместо свойственной норме диффузной [10, 15]. Эти изменения в морфологии В-клеток еще более отчетливо проявляются через 9 ч после реанимации (см. рисунок, в). Здесь присущий норме [15] "непрямой" путь транспорта Ин (В-клетка — межклеточная щель -э перикапиллярное пространство -э капилляр) заменяется на "прямой" (В-клетка -» перикапиллярное пространство -э капилляр). Локализация Ин в В-клетках повсеместно становится апикальной. В-клетки гроздьями группируются вокруг стазтрооанных капилляров и Ост приобретает специфические черты строения, резко отличающиеся от нормы (см. рисунок, а). На наш взгляд, подобная особая структура Ост способствует ускоренному выведению гормона на потребности организма, находящегося в экстремальном состоянии. По этой причине она длительное время прослеживается в Ост ПЖ реанимированных животных (см. рисунок, г). Результаты гистоф- люортметуии (см. таблицу) подтверждают усиленный выброс Ин в кровь. По уровню содержания Ин В-клетками Ост подопытных крыс лишь на 30-е сутки после оживления приближаются к таковым в контроле. Наряду с этим на 3-и сутки после эксперимента в ПЖ развиваются процессы компенсаторного характера. Они проявляются в трансформации "смешанных" ацтндинсуляуных клеток (см. рисунок, г; стрелки), ацинарно-железистых (см. рисунок, д), и, наконец, клеток пуо-

Результаты гистофлюоримстрии Ин в ПЖ крыс в пострсанимационном периоде после 10-минутной клинической смерти

токового эпителия (см. рисунок, е, ж) в инсулярные. Возможность подобной трансформации показана в ряде исследований в различных экспериментальных условиях [11, 15] и у больных с инсулинзависимым сахарным диабетом [12]. Она прослеживается в филогенетическом и онтогенетическом становлении эндокринного аппарата ПЖ [11]. Наши наблюдения с использованием высокочувствительной гистофлюориметрической методики выявления В-клеток в Ост, ацинусах и дук- тальном эпителии ПЖ делают эту трансформацию несомненной. Увеличением резервного пула В-клеток и ускоренной секрецией из них Ин, вероятно, и объясняется стойкое повышение уровня этого гормона в крови крыс, перенесших терминальное состояние [3—6, 13]. В наших опытах в ответную реакцию организма вовлекается не только эндокринная ткань ПЖ, что наблюдается при обычных формах экспериментального диабета [1, 2, 9], но и паравентрикулярные ядра гипоталамуса совместно с задней долей гипофиза [2, 4]. При этом повышенная продукция вазопрессина и окситоцина многократно увеличивает выброс глюкагона [2, 4] и обеспечивает высокую гипергликемию [13]. Можно полагать, что одновременное парадоксальное увеличение трех основных регуляторов углеводного обмена [6, 13] объясняется спецификой нейроэндокринных нарушений гомеостаза в реанимированном организме [3, 6, 10, 13].

Выводы

• Терминальное воздействие и факторы постреанимационного состояния оказывают существенное влияние на эндокринный аппарат ПЖ, вызывая в В-клетках Ост не только усиленный выброс Ин, но и способ их взаимосвязи с капиллярным руслом.
• Непрямой путь вывода Ин, свойственный норме, заменяется прямым выводом гормона в кровь реанимированных животных.

Те же факторы реанимации приводят к трансформации смешанных (ациноинсулярных), ацинарно-железистых клеток и клеток протокового эпителия железы в инсулинпродуцирующие В- клетки.