Механизмы нарушений функций мембранорецепторного аппарата при инсулинзависимом сахарном диабете у бе¬ременных женщин

Известно, что все конечные эффекты действия инсулина в клетках — следствие сложной цепи метаболических событий, начинающихся с обязательного формирования активного комплекса инсулин — инсулиновый рецептор (ИР). «Вмонтированный» в мембрану рецептор оказывается включенным в сложную систему взаимодействий, во многом определяющих его функциональное состояние. Такие мембранные факторы, как белки и липиды, оказывают влияние на аффинность рецептора. Вероятно, изменение аффинности часто опосредовано изменениями в микроокружении рецептора. Связывающие характеристики рецептора в первую очередь необходимо сопоставить с такими интегральными показателями физико- химического состояния липидного матрикса, как его жидкостность [14], проницаемость и другие свойства мембран.

Данные литературы о характере инсулин- рецепторных взаимодействий у больных инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД) весьма противоречивы [8, 13, 15]. Интенсивность рецепторного связывания инсулина тканевыми клетками весьма вариабельна и отрицательно коррелирует с уровнем как эндогенного, так и экзогенного инсулина [17].

Установлено, что при нормальной беременности у женщин, несмотря на постоянное возрастание концентрации инсулина в циркуляторном русле, толерантность к глюкозе снижается [6]. У больных сахарным диабетом при беременности доза инсулина возрастает в 2—3 раза.

При ИЗСД может наблюдаться инсулинре- зистентность вследствие нарушений инсулин-ре- цепторных взаимодействий в клетках и структурно-функциональных свойств мембран [3—5].

В настоящей работе нами проведено исследование параметров структурной организации мембран и факторов, влияющих на инсулин-рецеп- торные взаимоотношения в мембранах клеток крови, у женщин с ИЗСД в III триместре беременности.

Материалы и методы

Состояние мембранорецепторного аппарата изучено у 68 больных ИЗСД женщин в III триместре беременности. Возраст больных составил 18—40 лет (средний возраст 26±5,4 года). Срок заболевания — от 5 до 16 лет. Нами изучены инсулин-рецепторные связи в эритроцитах (Эр) у беременных женщин с ИЗСД, у которых суточная доза инсулина составляла в среднем 72 ЕД. К. моменту исследования больные находились в состоянии компенсации сахарного диабета, что подтвеждалось нормогликемией, натощак и в течение дня, аглюкозурией. Контрольная группа состояла из 20 женщин в Ш триместре беременности, без эндокринной патологии. Концентрацию инсулина определяли с помощью наборов для радиоиммунологического анализа, количество инсулиновых рецепторов в плазматических мембранах (ПМ) Эр — по описанному нами методу [5]. Связывание ¹²°1-инсулина с рецепторами ПМ Эр исследовали по методу I. Roth (1983) с использованием метода вытеснения ¹²⁵1-инсулина из комплекса с рецепторами возрастающими количествами немеченого гормона в условиях равновесия [9]. Общее количество инсулинсвязывающих мест и сродство рецепторов к гормону определяли по методу L. Scatchard [15], Р. Meyts и

1. Roth [И], чувствительность клеток к инсулину оценивали по степени утилизации глюкозы Эр. Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и выделенных ПМ Эр судили по содержанию гидроперекисей (ГП) [1] и малонового диальдегида (МДА), используя колориметрический метод с, тиобарбитуровой кислотой [12], антиокислительную активность (АОА) крови определяли в модификации Г. И. Клебанова и соавт. [2]. Структурно-функциональные свойства мембран Эр оценивали по изменению в мембранах Эр концентрации МДА, ГП, АОА, а также путем измерения концентрации тиоловых групп, микровязкости и гидрофобности эритроцит- ных мембран посредством вычисления коэффициента упорядоченности и гидрофобности эритроцитных мембран методом ЭПР-спектроскопии с помощью спиновых зондов на радиоспектрометре Е-4 («Varian», США).

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты показали, что в эритроцитных мембранах у беременных с ИЗСД значительно увеличивается «жесткость» липидного бислоя мембраны. Повышенная «жесткость» мембран, по-видимому, может служить одной из причин нарушения связывания инсулина с рецепторами, так как латеральная диффузия рецепторов, способность их к агрегированию и интернализации при этом резко затрудняются. Как видно на рис. 1, при 2-часовой инкубации Эр, взятых у беременных женщин, больных ИЗСД, с инсули-

Рис. 1. Структурная организация эритроцитных мембран беременных при инкубации клеток инсулином.

^

Слева — коэффициент упорядоченности, справа — коэффициент гидрофобности. N —интактные Эр; /—/// —Эр, подвергнутые действию инсулина в дозах 20, 80, и 1000 пг/мл соответственно. * р<0,001 достоверность по отношению к группе здоровых беременных.

Рис. 2. Анализ инсулин-рецепторного взаимодействия у больных ИЗСД, резистентным к инсулинотерапии.

А — кривые конкурентного вытеснения ¹²⁵1-инсулина немеченным инсулином в разных концентрациях в Эр здоровых лиц (/) и больных сахарным диабетом (2). По оси ординат специфическое связывание ^|251-инсулина Эр (в % от общего инсулина в расчете на 2-10⁹ клеток в 1 мл); по оси абсцисс — логарифм концентрации немеченого инсулина (в нг/мл). Б — те же данные в координатах графика Скетчарда. По оси ординат — отношение ^|251-инсулина связанного к свободному; по оси абсцисс — связанный инсулин (в нг/мл в расчете на 2,0-10⁹ клеток в 1 мл.

ном in vitro в концентрациях 20, 80 и 1000 пг/мл в прямой зависимости от дозы инсулина происходит возрастание коэффициента упорядоченности и снижение гидрофобности мембран Эр по сравнению с интактными клетками. Повышение микровязкости мембран Эр связано, по-видимому, с глубокими метаболическими нарушениями, в частности, усилением ПОЛ, приводящими, как известно, к увеличению «жесткости» липидного бислоя мембран [7}_f

При изучении одной из наиболее активных групп белка — SH с помощью спиновой метки отмечено изменение конформации поверхности белков, т. е. усиление процессов ПОЛ мембран, сочетается с агрегацией поверхностных белков мембран. Мембранодеструктивное воздействие процессов ПОЛ, изменение микровязкости и гидрофобности клеточных мембран ведут к повышению их проницаемости, что способствует смещению ионного равновесия и накоплению воды в клетке. Кроме того, проведенные у беременных с ИЗСД исследования поверхностных тиоловых группировок мембран Эр показали их малую доступность зонду. В связи с тем что свободные тиоловые группы являются основными структурами, обеспечивающими действие мембранных антиоксидантов, уменьшение их доступности указывает на деструктивные изменения в мембране. При беременности у больных ИЗСД низкая доступность тиоловых групп говорит о высокой упорядоченности мембранных белков, т. е. о повышении «жесткости» мембраны. С другой стороны, уменьшение количества активных SH-группировок снижает способность мембраны связывать активные перекисные радикалы.

Таким образом, у беременных с ИЗСД отмечаются выраженные структурно-функциональные изменения в эритроцитных мембранах. Наряду с повышением пассивной проницаемости мембраны для воды, что обусловлено снижением гидрофобности, нарушается активный транспорт через мембрану веществ, требующих для этого взаимодействия с мембранными рецепторами. Об этом говорит повышение упорядоченности липопротеидных структур мембраны. В результате этих изменений нарушается функция Эр, не только как переносчика связанного с гемоглобином кислорода, но и как транспортера биологически активных веществ [10]. С другой стороны, изменение структурно-функциональной организации эритроцитных мембран может свидетельствовать о подобных нарушениях в клетках других тканей, в частности р-клетках островков Лангерганса. В результате окисления белковосвязанных SH- групп в инсулиновом рецепторе может наступить ослабление инсулин-рецепторного взаимодействия вследствие полимеризации белков.

Нами изучено инсулин-рецепторное взаимодействие на Эр больных ИЗСД с признаками инсулинрезистентности: суточная доза инсулина была выше 60 ЕД и в среднем составляла 80 ЕД. На момент исследования больные были в состоянии компенсации сахарного диабета. Специфическое связывание инсулина рецепторами на Эр оказалось значительно меньшим, чем у здоровых лиц, причем это снижение определялось уменьшением концентрации рецепторов на Эр (рис. 2).

При изучении инсулин-рецепторных взаимоотношений у беременных с ИЗСД оказалось, что в последний триместр беременности, несмотря на удовлетворительную компенсацию диабета, связывание инсулина с рецепторами на Эр было значительно снижено по сравнению со здоровыми беременными с такими же сроками беременности. Как видно на рис. 3, это снижение обусловливалось в большей степени уменьшением концентрации рецепторов на клетках и в меньшей степени снижением сродства рецепторов к инсулину.

Результаты исследования зависимости между дозой инсулина и характером изменения одного из метаболических эффектов инсулина свидетельствует, что при физиологическом уровне инсулина in vitro утилизация глюкозы Эр у беременных с ИЗСД (длительность заболевания 5—12 лет) осуществляется в меньшей мере, чем в контроле, однако при увеличении концентрации инсулина в пробах в 4 раза этот процесс возрастал до нормы. Исходя из этого, можно сделать заключение, что у беременных с длительно существующим ИЗСД имеется резистентность к инсулину, проявляющаяся понижением чувствительности на пороговые физиологические дозы инсулина, но на максимальные концентрации его ответ не нарушен. При ИЗСД у беременных вторично развивается инсулинрезистентность, которая зависит от состояния ИР клеток и вводимой дозы инсулина.

Изучение влияния стрессорных факторов на структурную организацию эритроцитных мембран, таких, как, интенсификация свободнорадикального окисления и снижение активности эндогенных антиоксидантов, показало, что у всех беременных женщин, больных ИЗСД, in vitro по

Рис. 3. Анализ инсулин-рецепторных взаимодействий у беременных ИЗСД.

Обозначения те же, что на рис. 2.

Статистически достоверно отличающиеся значения обозначены знаком ♦

Действие инсулина in vitro на содержание МДА, ГП, АОА и утилизацию глюкозы Эр

Контроль 1—здоровые беременные (п= 15)                               3,1 ±0,7

Контроль 2— больные ИЗСД беременные (п=12)                      3,65±0,06

Эр+инсулин

20 пг/мл (л=12)                                                                             3,83±0,08

80 пг/мл (п=10)                                                                             3,83±0,08

1000 пг/мл (л=10)                                                                        8,03±0,9*

* Достоверные различия по отношению к контролю.

сравнению с контролем происходит усиление ПОЛ и снижение АОА в сыворотке крови. В эритроцитных мембранах значимых различий АОА в сравниваемых группах не отмечено. Различия в содержании МДА и ГП в Эр, взятых от больных ИЗСД, в контроле и после 2-часовой инкубации Эр с инсулином в концентрациях 20 и 80 пг/мл были незначительными (см. таблицу). Добавление инсулина к Эр в более высокой концентрации усиливало образование ПОЛ (резко возрастала концентрация ГП и МДА; р<0,05) и не вызывало изменения АОА, т. е. инсулин в высоких концентрациях оказывал у беременных с ИЗСД прооксидантное действие. В то же время инсулин в больших концентрациях (80 и 1000 пг/мл) усиливает процессы утилизации глюкозы Эр (р<0,05, см. таблицу), причем существует тесная корреляционная связь при указанных дозах между АОА и степенью утилизации глюкозы (г=0,65 и г=0,76; р<0,05, соответственно). Следовательно, внесение инсулина в высокой концентрации к Эр приводило к повышению утилизации глюкозы, значительному возрастанию содержания МДА и не вызывало изменения АОА по сравнению с контролем. Вероятно, можно говорить об относительной недостаточности активности антиоксидантных ферментов на фоне усиления липидной пероксидации под влиянием высокой концентрации инсулина (1000 пг/мл).

В условиях активации ПОЛ, несмотря на компенсаторное утолщение клеточной мембраны, судя по увеличению содержания липидного фосфора (с 2,67±0,11 ммоль на 10^е клеток в контроле до 3,82±0,19 ммоль при ИЗСД; р<0,01), мембраны Эр остаются функционально неполноценными, о чем свидетельствуют сниженная чувствительность клеток к инсулину и сниженная концентрация ИР.

Таким образом, проведенные эксперименты с Эр беременных свидетельствуют о том, что ИЗСД характеризуется развитием инсулинрезистент- ности вследствие нарушения чувствительности клеток к пороговым физиологическим и субмаксимальным дозам инсулина. Максимальные дозы гормона приводят к нормализации потребления глюкозы клетками, однако при этом усиливается пероксидация липидов, повышаются микровязкость и гидрофильность мембран.

Выводы

1. У беременных женщин, страдающих ИЗСД с признаками инсулинрезистентности, выявлено нарушение чувствительности клеток к пороговым физиологическим и субмаксимальным дозам инсулина. Максимальные дозы гормона приводят к нормализации потребления глюкозы клетками.
2. Большие дозы инсулина вызывают активацию интенсивности пероксидации липидов, высокую упорядоченность белков мембраны, уменьшение количества тиоловых групп, снижение АОА в мембранах и, следовательно, снижение способности мембран связывать активные перекисные радикалы.

Структурно-функциональные изменения в мембранах Эр сопровождаются снижением аффинности ИР, снижением числа инсулинсвязывающих мест в мембранах.