Роль кальций-чувствительного и витамин D рецепторов в патогенезе множественного поражения околощитовидных желез при спорадическом первичном гиперпаратиреозе

ОБОСНОВАНИЕ

Первичный гиперпаратиреоз (ПГПТ) — распространенное эндокринологическое заболевание, вызванное первичной патологией околощитовидных желез (ОЩЖ) [1].

Преобладает спорадический гиперпаратиреоз (90–95%) (сПГПТ), в 5–10% наблюдений патология встречается в рамках наследственных синдромов. Дебют заболевания до 40 лет подозрителен в отношении наследственного характера заболевания [2]. В 80–85% наблюдений сПГПТ встречается солитарная аденома, в 20–25% — поражение нескольких желез, и менее 1% составляет рак [3]. Специфических признаков множественного поражения ОЩЖ при сПГПТ нет.

Количество оперативных вмешательств по поводу сПГПТ заметно увеличивается, однако унифицированной концепции диагностики и объема хирургического вмешательства при множественном поражении ОЩЖ до сих пор нет. Между тем определение количества избыточно функционирующих ОЩЖ на предоперационном этапе позволяет выбрать оптимальный объем операции, что в главном обеспечивает эффективность лечения сПГПТ.

Одним из направлений поиска патогенетически обоснованных методов диагностики и лечения множественного поражения ОЩЖ при сПГПТ остается исследование молекулярно-генетических особенностей заболевания и ассоциированных с ними клинико-лабораторных факторов.

Нарушение секреции паратиреоидного гормона (ПТГ), контролируемое кальций-чувствительным рецептором (CaSR), и усиленная пролиферация клеток ОЩЖ (паратиреоцитов) имеют ключевое значение для развития сПГПТ [4]. Кроме того, секреторная и пролиферативная активность ОЩЖ через рецептор витамина D (VDR) контролируется кальцитриолом (1,25-дигидроксивитамином D) [5].

Доказано снижение экспрессии CaSR клеток аденомы в 2 раза по сравнению с нормальной тканью ОЩЖ [6]. В эксперименте показано, что CaSR — ключевой фактор, определяющий пролиферацию клеток ОЩЖ, а VDR играет второстепенную роль [7]. Гиперплазия ОЩЖ предшествует подавлению экспрессии CaSR на модели уремических крыс [8], при этом введение кальцитриола или кальцимиметиков приводило к снижению пролиферации клеток. Это связано с повышением экспрессии CaSR и VDR на фоне введенных препаратов [9].

В контексте сПГПТ хронический дефицит витамина D — возможный механизм развития гиперплазии ОЩЖ с последующим приобретением автономной секреции ПТГ и трансформации в аденому [10], ухудшающий течение заболевания. Это связано с высокими уровнями ПТГ и кальция, увеличением массы аденомы, повышением метаболизма костной ткани с более низкой минеральной плотностью костей и риском их малотравматичных переломов [11].

Влияние дефицита витамина D на естественное течение сПГПТ уже не вызывает сомнений, поэтому нельзя отвергать роль уремического фактора.

Длительное время развитие камней в почках и связанные с ними осложнения (инфекция мочевыводящих путей, гидронефроз и почечная недостаточность) считались классическими проявлениями ПГПТ. Однако с введением понятия бессимптомной формы на первый план вышли гиперкальциурия (повышенная экскреция кальция с мочой), снижение фильтрационной и концентрационной функции почек.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить особенности экспрессии кальций-чувствительного и витамин D рецепторов на поверхности паратиреоцитов при ПГПТ с солитарным и множественным поражением ОЩЖ, а также ее изменения при снижении фильтрационной функции почек.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Клиническое исследование проведено с сентября 2019 г. по март 2021 г. на базе отделения торакальной хирургии ГБУЗ «Иркутская ордена “Знак почета” областная клиническая больница», г. Иркутск.

Морфологическое — с сентября 2019 г. по март 2021 г. на базе отделения общей патологии ГБУЗ «Иркутское областное патологоанатомическое бюро», г. Иркутск.

Иммуногистохимическое — с апреля 2021 г. по январь 2022 г. на базе научно-лабораторного отдела ФГБНУ «Иркутский научный центр хирургии и травматологии» (далее ИНЦХТ), г. Иркутск.

Методы

В одноцентровое наблюдательное проспективное исследование с ретроспективным сбором данных включены пациенты независимо от пола и возраста, которые в течение 2019–2021 гг. прооперированы по поводу сПГПТ, вторичного гиперпаратиреоза (ВГПТ), а также третичного гиперпаратиреоза (ТГПТ) в течение 2014–2021 гг.

Критерий включения — показания к хирургическому лечению сПГПТ в соответствии с клиническими рекомендациями [13], а также к хирургическому лечению ВГПТ у пациентов, находящихся на заместительной почечной терапии гемодиализом (ЗПТ ГД), в соответствии с рекомендациями Российской ассоциации эндокринологов 2006, 2013 гг. и Национальными рекомендациями по минеральным и костным нарушениям при хронической болезни почек Российского диализного общества 2011 г. [14] и к хирургическому лечению ТГПТ на заместительной почечной терапии трансплантацией почки (ЗПТ ТП) [15][16]. Критерий исключения — возраст моложе 40 лет в сочетании с ПГПТ.

Морфологический материал ткани ОЩЖ получен в ходе оперативных вмешательств пациентам по поводу ПГПТ, ВГПТ на ЗПТ ГД и ТГПТ на ЗПТ ТП. В исследование включены результаты световой микроскопии и иммуногистохимической окраски 140 препаратов ткани ОЩЖ на CaSR и VDR. Поскольку известно, что наибольшая экспрессия обоих рецепторов наблюдается в нормальных тканях ОЩЖ, то для ранжирования экспрессии была выполнена интраоперационная биопсия 1/3 части унилатеральной визуально неизмененной железы у 5 пациентов с ПГПТ при удалении солитарной аденомы. Нормальность строения этих желез была подтверждена в гистологическом исследовании.

Морфологическое исследование включало рутинную световую микроскопию окрашенных гематоксилином-эозином удаленных ОЩЖ.

Для проведения иммуногистохимического исследования использовали парафиновые срезы ОЩЖ. Применялся непрямой метод, который основан на двухэтапном нанесении специфичных и антивидовых антител. В качестве первичных использовались кроличьи антитела к CaSR и VDR:

1. к CaSR — rabbit polyclonal antibody IgG (Abcam Anti-CaSR antibody, Cat. N Ab137408), рабочее разведение 1:200;
2. к VitDR — rabbit polyclonal IgG (Abcam Anti-Vitamine D Receptor antibody, Cat. N Ab137371), рабочее разведение 1:200.

В качестве вторичных — меченные пероксидазой хрена козьи антитела к кроличьим иммуноглобулинам: NovolinkPolymer, Anti-rabbit Poly-HRP-IgG (RE 7112 из набора Novolink Polymer Detection System RE7140-K). Иммуногистохимическое исследование выполняли в соответствии с протоколом, предлагаемым производителем первичных антител компанией Abcam¹.

Микроскопическое исследование проводили с использованием светового микроскопа CarlZeiss Axio Vert. A1 и регистрировали на камеру AxioCam ICc5 с программным обеспечением CarlZeiss Zen 2.3.

Предметные стекла исследовали под световым микроскопом при увеличении ×20 в 10 полях зрения. Проводился качественный анализ экспрессии CaSR и VDR с распределением результатов на 4 степени интенсивности окраски (рис. 1): 3-я — высокая экспрессия рецептора; 2-я — умеренная экспрессия рецептора; 1-я — низкая экспрессия рецептора; 0-я — отсутствие экспрессии рецептора. Анализ проводился тремя независимыми исследователями с подсчетом среднего результата.

Дизайн морфологического и иммуногистохимического исследования представлен в таблице 1.

Статистический анализ

Этическая экспертиза

Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено комитетом по биомедицинской этике ИНЦХТ, протокол №8 от 23.12.2019 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Согласно данным таблицы 2, во всех группах преобладали женщины старше 50 лет, кроме ВГПТ на ЗПТ ГД, в которой пациенты моложе и мужчин было больше. У всех больных выявлены нарушения минерального и костного обмена, характерные для соответствующей патологии. В зависимости от группы исследования нарушение фильтрационной функции почки варьировалось от 1-й до 5-й стадии ХБП.

Из 19 пациентов основной группы у 12 при морфологическом исследовании установлена гиперплазия, у 7 — аденома. В группе 1 у всех пациентов установлены аденомы. В группах 2 и 3 у всех диагностирована гиперплазия ОЩЖ.

Сравнительная оценка степени экспрессии CaSR и VDR в зависимости от морфологических изменений в ОЩЖ представлена в таблице 3.

Для нормальной ткани ОЩЖ характерна высокая интенсивность экспрессии как CaSR, так и VDR (100%), что можно оценивать как условную «норму». Статистически значимое снижение частоты нормальной экспрессии рецепторов CaSR и VDR встречается при любом морфологическом варианте гиперпаратиреоза и отмечается в 93–60% препаратов. Снижение нормальной экспрессии CaSR при гиперплазии выявляется статистически значимо реже, чем при аденоме (р≤0,01). Медиана интенсивности экспрессии при аденоме составила 2,5 (2–3), при гиперплазии — 3,5 (3–4) (р≤0,01) (рис. 2). Влияние морфологического варианта патологии ОЩЖ на интенсивность экспрессии VDR не обнаружено (p>0,1).

Сравнительная оценка степени экспрессии CaSR и VDR в зависимости от вида гиперпаратиреоза, почечной функции представлена в таблице 4.

Частота высокой (3-й степени, нормальной) экспрессии CaSR статистически значимо преобладала при ПГПТ с множественным поражением ОЩЖ (48%) и при ВГПТ на ЗПТ ГД (39%) в сравнении с солитарным поражением при ПГПТ (19–22%) и множественным при ТГПТ на ЗПТ ТП (21%) (p≤0,05).

Выявленные зависимости дают основание определить характерные молекулярно-генетические особенности исследуемых заболеваний, связанные с изменением интенсивности экспрессии CaSR ОЩЖ. Молекулярно-генетический механизм развития солитарных аденом при ПГПТ и множественного поражения при ТГПТ на ЗПТ ТП — снижение частоты сохранения нормальной экспрессии CaSR до 19–21% в отличие от множественного поражения ОЩЖ при ПГПТ и ВГПТ на ЗПТ ГД, при котором установлена более высокая частота сохранения (в 39–48% образцах ОЩЖ) нормальной экспрессии CaSR (p≤0,05).

Для выявления локального и общего характера молекулярно-генетических изменений в экспрессии генов при множественном поражении ОЩЖ оценена вариабельность экспрессии CaSR и VDR в разных ОЩЖ у одного и того же пациента (табл. 5).

Для множественного поражения ОЩЖ при ПГПТ, как и для ВГПТ на ЗПТ ГД и ТГПТ на ЗПТ ТП, характерна неоднородность экспрессии CaSR и VDR в препаратах ОЩЖ от одного и того же больного, что свидетельствует о спонтанном локальном характере молекулярно-генетических нарушений в ОЩЖ в отобранных для анализа наблюдениях (нет случаев генетических наследственных синдромов).

Для оценки вариабельности молекулярно-генетических нарушений в ОЩЖ в зависимости от клинических особенностей гиперпаратиреоза, почечной функции и вида заместительной терапии исследовали вариабельность экспрессии CaSR и VDR в разных ОЩЖ у одного пациента в группах множественного поражения (табл. 6).

Вариабельность экспрессии CaSR в ОЩЖ одного и того же больного не зависит от клинических особенностей гиперпаратиреоза, почечной функции и вида заместительной почечной терапии (p>0,95), что свидетельствует о стабильности (или первичности) выявленного молекулярно-генетического механизма при множественном поражении. Вариабельность экспрессии VDR при ПГПТ оказалась ниже, чем у больных, получающих ЗПТ (p<0,07; p<0,05), что свидетельствует об изменчивости выявленного молекулярно-генетического механизма под действием ЗПТ.

Совокупность полученных данных дает основание заключить, что различным молекулярно-генетическим механизмом развития гиперпаратиреоза с преобладанием аденомы (ПГПТ с солитарной аденомой) или гиперплазии (ВГПТ на ЗПТ ГД и ПГПТ с множественным поражением) выявлено различие в частоте сохранения нормальной экспрессии CaSR в ткани ОЩЖ. Этот механизм реализуется на локальном уровне, его вариабельность не изменяется под влиянием ЗПТ.

Общим молекулярно-генетическим механизмом развития гиперпаратиреоза с преобладанием аденомы или гиперплазии установлено снижение частоты сохранения нормальной экспрессии VDR в ОЩЖ (до 7–13%), p<0,01. Этот механизм реализуется на локальном уровне, его вариабельность изменяется под влиянием ЗПТ, достигая статистически значимых различий у больных ТГПТ.

Зависимость характера экспрессии CaSR и VDR от основных лабораторных показателей при ПГПТ с множественным поражением ОЩЖ представлена в таблице 7.

В когорте ПГПТ с множественным поражением ОЩЖ уровень кальция крови не связан с экспрессией CaSR и VDR. Снижение экспрессии CaSR сопряжено с более низким уровнем креатинина крови (сохраненная функция почек).

При множественном поражении ОЩЖ вследствие ВГПТ установлена положительная корреляция между экспрессией CaSR и VDR, отрицательная — между экспрессией VDR и уровнем кальцидиола в крови (табл. 8).

При сохраненной функции почек уровень кальцидиола не связан с экспрессией VDR на поверхности паратиреоцитов. При ВГПТ на ЗПТ ГД выявляется умеренная отрицательная корреляция между уровнем кальцидиола в крови и экспрессией VDR и положительная — экспрессией CaSR и VDR. Совокупность выявленных корреляций показывает различную роль витамина D в реализации молекулярно-генетических механизмов заболеваний — она не выявляется при сохраненной функции почек и манифестирует у больных на ЗПТ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование оценивает характер экспрессии CaSR, VDR, а также показывает ее зависимость от клинического варианта гиперпаратиреоза, морфологического субстрата и основных лабораторных показателей.

Статистически значимое снижение частоты нормальной экспрессии CaSR и VDR встречается при любом морфологическом варианте гиперпаратиреоза и отмечается в 93–60% случаев. Снижение нормальной экспрессии CaSR при гиперплазии выявляется статистически значимо реже, чем при аденоме (р≤0,01). Медиана интенсивности экспрессии при аденоме составила 2,5 (2–3), при гиперплазии – 3,5 (3–4) (р≤0,01). Полученные в исследовании данные дополняют существующие представления [17–19], показывая не только различия в интенсивности экспрессии CaSR и VDR на поверхности паратиреоцитов при аденоме и гиперплазии, но и частоту снижения экспрессии при различных морфологических вариантах заболевания.

Различие молекулярно-генетических механизмов развития гиперпаратиреоза с преобладанием аденомы (ПГПТ с солитарной аденомой) или гиперплазии (ВГПТ на ЗПТ ГД и ПГПТ с множественным поражением) реализуется в частоте сохранения нормальной экспрессии CaSR в ткани ОЩЖ. Эти механизмы проявляются на локальном уровне, их вариабельность не изменяется под влиянием ЗПТ. Выше показано, что экспрессия CaSR на паратиреоцитах солитарных аденом при ПГПТ снижается до 90% в сравнении с нормальным строением ОЩЖ. Авторы наблюдали снижение CaSR на уровне как белка (рецептора на поверхности паратиреоцитов), так и генов в спорадических аденомах и не обнаружили значимой корреляции между снижением экспрессии рецептора и клинико-лабораторными характеристиками ПГПТ [20]. Результаты исследования показывают, что вариабельность экспрессии CaSR в ОЩЖ одного и того же больного при множественном поражении не зависит от клинических особенностей гиперпаратиреоза, почечной функции и вида заместительной почечной терапии (p>0,95), что свидетельствует о стабильности (или первичности) выявленного молекулярно-генетического механизма.

Общий молекулярно-генетический механизм развития гиперпаратиреоза с преобладанием морфологического субстрата в виде аденомы или гиперплазии — снижение частоты сохранения нормальной экспрессии VDR в ОЩЖ (до 7–13%), p<0,01. Он реализуется на локальном уровне, изменяется под влиянием ЗПТ, достигая статистически значимых различий у больных ТГПТ на ЗПТ ТП. Тaniguchi M. и соавт. установили, что экспрессия CaSR у пациентов с ВГПТ на ЗПТ ГД выше (45,0±2,8), чем при ТГПТ на ЗПТ ТП (29,3±2,3) [21]. В представленном исследовании также получены сведения о снижении частоты нормальной экспрессии CaSR при ТГПТ на ЗПТ ТП. Полученные данные показывают значительную вариабельность снижения экспрессии CaSR в ОЩЖ одного и того же больного. Кроме того, выявлены вариабельность экспрессии VDR в ОЩЖ одного и того же больного с множественным поражением ОЩЖ различного генеза и зависимость этой вариабельности от заместительной почечной терапии: максимальных значений она достигает у больных после трансплантации почки.

Показано значение витамина D в реализации молекулярно-генетических механизмов заболеваний — не выявляется при ПГПТ с сохраненной функцией почек и манифестирует у больных на ЗПТ. Как уже сообщалось, введение кальцитриола или кальцимиметиков приводило к снижению пролиферации клеток ОЩЖ. Это связано с повышением экспрессии как CaSR, так и VDR на фоне введенных препаратов [9][22]. При ПГПТ изменение концентрации кальцидиола не влияет на экспрессию VDR, а уровень кальция не сопряжен с экспрессией CaSR (p>0,95), что позволяет исключить указанные механизмы из патогенеза ПГПТ и не рассматривать медикаментозные методы лечения этого состояния (кальцимиметики и колекальциферол) в качестве патогенетически обоснованных.

Установленная отрицательная корреляция между уровнем кальцидиола в крови и экспрессией VDR у больных на ЗПТ противоречит имеющимся данным о роли хронического дефицита витамина D в развитии гиперплазии ОЩЖ с последующим приобретением автономной секреции ПТГ и трансформацией в аденому при уремическом гиперпаратиреозе [10]. Повышение уровня кальцидиола в крови у включенных в наше исследование больных согласуется со снижением экспрессии VDR. Это противоречие объясняется глубокими локальными молекулярно-генетическими нарушениями, реализующимися в виде согласующейся между собой сниженной экспрессии CaSR и VDR. Ранее было показано, что уже на ранних стадиях развития гиперпаратиреоза недостаточная экспрессия CaSR и VDR делает клетки ОЩЖ неспособными адекватно реагировать на окружающий кальций и/или кальцитриол [12].

Другой причиной выявленного противоречия можно считать развитие автономной секреции ПТГ при низких уровнях экспрессии CaSR. У этих пациентов ограничено использование заместительной терапии дефицита витамина D (повышение уровня кальция крови). В результате уровень кальцидиола в крови больных со сниженной экспрессией CaSR (и, соответственно, VDR), оказывается ниже.

Ограничения исследования

Исследование имело ряд ограничений: небольшой размер выборки, качественный анализ экспрессии рецепторов, невозможность выполнения анализа экспрессии непосредственно генов рецепторов ввиду отсутствия ресурсов. Главное в проведенной работе заключается в оценке экспрессии основных рецепторов (CaSR, VDR), участвующих в патогенезе всех нозологических вариантов гиперпаратиреоза, а также зависимости экспрессии от варианта гиперпаратиреоза, морфологии и лабораторных показателей. Кроме того, основной акцент сделан на изучение изменений именно множественного поражения ОЩЖ при ПГПТ.

Направления дальнейших исследований

Дальнейшее исследование экспрессии рецепторов CaSR и VDR на выборке больших размеров с возможным исследованием экспрессии непосредственно генов этих рецепторов поможет лучше понять патогенез множественного поражения ОЩЖ при ПГПТ, что улучшит диагностику и лечение данной формы заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование демонстрирует особенности изменения экспрессии кальций-чувствительного и витамин D рецепторов при ПГПТ с множественным поражением ОЩЖ. Показаны взаимосвязи экспрессии этих рецепторов с клиническим вариантом гиперпаратиреоза, морфологическим субстратом, основными лабораторными показателями и почечной функцией.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование осуществляется в соответствии с планом научно-исследовательской работы (НИР) ИНЦХТ № 063 «Биомедицинские технологии профилактики и лечения органной недостаточности в реконструктивной и восстановительной хирургии», сроки выполнения 2013–2021 гг., а также НИР «Персонифицированный подход к профилактике и коррекции полиорганной дисфункции в лечении хирургических заболеваний», сроки выполнения 2022–2026 гг.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Ильичева Е.А. — разработка концепции и дизайна, анализ и интерпретация данных, обоснование рукописи и проверка критически важного интеллектуального содержания; Шурыгина И.А. — разработка концепции, дизайна иммуногистохимического исследования и интерпретация данных, обоснование рукописи и проверка критически важного интеллектуального содержания; Дремина Н.Н. — проведение иммуногистохимического исследования, анализ и интерпретация данных; Берсенев Г.А. — разработка концепции и дизайна, сбор материала, проведение иммуногистохимического исследования, анализ и интерпретация данных, обоснование рукописи; Григорьев Е.Г.  — разработка концепции и дизайна, анализ и интерпретация данных, обоснование рукописи и проверка критически важного интеллектуального содержания, редактирование и окончательное утверждение рукописи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Коллектив авторов выражает благодарность Кане Олегу Витославовичу — к.м.н., начальнику ГБУЗ ИОПАБ за помощь в морфологическом исследовании гистологического материала; Махутову Валерию Николаевичу — к.м.н., заведующему торакальным хирургическим отделением ГБУЗ ИОКБ за помощь на всех этапах подготовки рукописи.