Оценка стероидного профиля в слюне у пациентов с врожденной дисфункцией коры надпочечников

ВВЕДЕНИЕ

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) — это группа аутосомно-рецессивных заболеваний, в основе которых лежит дефект одного из ферментов или транспортных белков, принимающих участие в биосинтезе кортизола в коре надпочечников. Наиболее частой причиной ВДКН является дефицит 21-гидроксилазы, с первых недель после рождения и на протяжении всей жизни требующий замещения глюкокортикоидами (ГК) [1–4]. Недостаточность терапии ГК приводит к преждевременному половому развитию у мальчиков, гетеросексуальному развитию у девочек, ускоренному костному созреванию, быстрому закрытию зон роста и низкому конечному росту. В подростковом возрасте недостаточность терапии ГК является причиной нарушения становления менструального цикла у девочек, развития опухолевых образований яичек у мальчиков, в конечном счете — снижения репродуктивного потенциала у лиц обоих полов. С другой стороны, передозировка ГК сопровождается ожирением, низкорослостью, артериальной гипертензией, развитием метаболического синдрома в более старшем возрасте [5–7]. В связи с этим подбор доз ГК в детском возрасте крайне важен.

Общепринятыми маркерами оценки эффективности терапии ВДКН являются: 17-ОН-прогестерон (17ОНП), андростендион и тестостерон плазмы крови, измеренные методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФА) [1–4]. Однако данные методики не являются оптимальными, так как, с одной стороны, не позволяют оценить другие стероидные маркеры заболевания, а с другой — обладают высокой степенью погрешности, завышением полученных результатов за счет так называемой «перекрестной реакции» близких по строению стероидов [8–10].

В последнее время для исследования стероидного профиля в плазме используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ МС/МС), так как, в отличие от ИФА, ВЭЖХ МС/МС позволяет исследовать одновременно концентрации нескольких надпочечниковых стероидов с высокой точностью [11–14]. Помимо этого, при интерпретации полученных результатов необходимо учитывать тот факт, что забор крови является «стрессорным» фактором для ребенка и может приводить к повышению уровней исследуемых стероидов [15]. В этой связи использование слюны в качестве субстрата для определения стероидов представляется перспективным неинвазивным методом.

ОБРАЗОВАНИЕ СЛЮНЫ И ПОПАДАНИЕ В НЕЕ СТЕРОИДОВ

В железистых клетках ацинусов слюнных желез находятся секреторные гранулы, в которых осуществляется синтез ферментов и муцина. Образующийся первичный секрет из клеток попадает в протоки, где он разбавляется водой и насыщается минеральными веществами. Околоушные железы в основном образованы серозными клетками и вырабатывают жидкий серозный секрет, в то время как подъязычные — слизистыми, которые выделяют слюну, богатую муцином. Подчелюстные — вырабатывают смешанную серозно-слизистую слюну [16].

Существует два основных механизма попадания стероидных гормонов в слюну.

Первый — внутриклеточная пассивная диффузия, посредством которой жирорастворимые «несвязанные» стероиды могут проходить сквозь клеточную мембрану ацинусов слюнных желез. Их концентрация не зависит от скорости секреции слюны, поэтому определяемый уровень гормонов в слюне совпадает с таковым в ­крови [17][18].

Второй — ультрафильтрация. «Связанные» с белками стероиды крови вместе с водой проникают через плотные перегородки в ацинусы. Их концентрация сильно зависит от скорости потока, поэтому определяемый уровень стероидов в слюне значительно ниже, чем в ­крови [17][18].

МЕТОДЫ СБОРА СЛЮНЫ

В настоящее время существует несколько методов сбора слюны, однако стандартизированного варианта не существует, так как каждый из них так или иначе влияет на анализируемые стероиды.

ПАССИВНОЕ СЛЮНОТЕЧЕНИЕ

С 1934 г. «золотым стандартом» сбора слюны считается пассивное слюнотечение, поскольку оно позволяет исключить влияние скорости потока слюны на ее состав. В емкости для сбора (например полипропиленовые ­эппендорфы) пациенту необходимо, не прилагая активных действий, позволить стечь слюне.

В 2007 г. D. Granger и соавт. отметили преимущества пассивного слюнотечения, такие как возможность собрать большой объем биоматериала и малое влияние внешних факторов, имеющих место при других методиках, или стимуляции слюноотделения. Однако у этого метода также есть свои ограничения: он неприменим у пациентов, которым невозможно объяснить принцип сбора (например, маленький ребенок, пожилой человек и др.) [19].

ВЫПЛЕВЫВАНИЕ СЛЮНЫ

Выплевывание слюны — это метод сбора слюны, при котором человек сначала собирает слюну на дне ротовой полости, а затем выплевывает собранное в заранее подготовленный контейнер. Данный метод быстрее предыдущего, однако он тоже имеет ограничения, а за счет активного процесса слюна становится «стимулиро­ванной» [20].

СБОР СЛЮНЫ С ПОМОЩЬЮ ТАМПОНА

Слюна может быть собрана с помощью тампона из хлопка или других синтетических материалов, помещенного в ротовую полость. От выбора материала зависит точность определяемых аналитов (материал может абсорбировать на себя ту или иную часть интересующего аналита). В литературе наиболее часто упоминаемыми устройствами для сбора слюны являются Salivette (Sarstedt) и SalivaBio Oral Swab (SOS, Salimetrics). Salivette выпускаются в 3 вариантах: с полипропиленовым, ­полиэтиленовым легкой плотности и хлопковым тампоном. Все варианты производятся одинаковой формы и размеров. Основной отличительной чертой является цвет крышки устройства: белая крышка говорит о хлопковом тампоне; синяя/голубая — о синтетическом. Для сбора слюны пациенту необходимо поместить тампон в ротовую полость до полного пропитывания слюной, данный процесс может занимать до 10 минут. Необходимо избегать непроизвольного проглатывания тампона (что может быть важным при сборе образцов у детей) [17].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРОИДОВ В СЛЮНЕ

Одно из первых исследований в данной области было проведено еще в 70-х годах прошлого века. R. Walker и соавт. (1979) проводили сравнительный анализ содержания 17ОНП в слюне и крови у пациентов от 1 до 16 лет с классической 21-гидроксилазной недостаточностью, находящихся на лечении пероральным гидрокортизоном в дозе 15–20 мг/м²/сут и флудрокортизоном 0,1–0,15 мг/м²/сут, а также у 32 здоровых добровольцев методом радиоиммунного анализа (РИА). Сбор образцов крови и слюны производился одномоментно в промежутке времени с 9 до 10 ч утра. Слюна собиралась непосредственно в стеклянные пробирки. У детей раннего возраста слюна собиралась с помощью шприца со дна полости рта. В результате было установлено, что у контрольной группы среднее содержание 17ОНП в слюне соответствовало 390 пмоль/л (от 90 до 1520 пмоль/л). Диапазон концентраций 17ОНП в основной группе варьировал от 67 до 26300 пмоль/л [21].

Возможности использования слюны для анализа стероидов продемонстрировала О. Фофанова (1989) в своей диссертации, защищенной на базе Института клинической эндокринологии Всесоюзного эндокринологического центра Академии медицинских наук СССР. В этом исследовании участвовали 30 детей допубертатного возраста, от 3 до 11 лет, с классической 21-гидроксилазной недостаточностью (вирильной формой) и 33 условно здоровых ребенка. Все дети были разделены на две группы: 1-я — с допубертатным костным возрастом, 2-я — с пубертатным. Парные пробы крови и слюны собирались исследователем 6 раз в течение суток: в 8:00, 12:00, 16:00, 20:00, 24:00, 4:00. Забор слюны предшествовал забору крови. Пробы смешанной цельной слюны (по 4–6 мл) собирались детьми в центрифужную стеклянную пробирку. Методом РИА была выявлена сильная положительная корреляция между концентрациями тестостерона в обеих биологических жидкостях (r=0,766; р<0,0001). Сильная положительная корреляция была получена и при исследовании 17ОНП в парных пробах сыворотки и слюны (r=0,818; р<0,0001). Средние анализируемые концентрации стероидов в крови и слюне представлены в таблице 1.

Повторное исследование вышеуказанных показателей было проведено через 6 мес после коррекции терапии ГК. Отмечалась положительная динамика в виде снижения выраженности гиперандрогении и средней концентрации тестостерона и 17ОНП в крови и слюне. Результаты повторных исследований представлены в таблице 2.

Автор допустил использование слюны не только в диагностическом процессе, но также и для контроля лечения этого заболевания [22].

N. Shindo и соавт. (1990) определили наличие 8 стероидных гормонов: тестостерон, 17ОНП, 17ОН-прегненолон, прогестерон, прегненолон, 11-дезоксикортизол, кортизол и альдостерон в слюне методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии с термоспреем у двух пациентов с ВДКН, получающих заместительную гормональную терапию, и у здорового добровольца. В своей работе авторы не указали, какой метод сбора слюны они использовали, а также не проводили количественный анализ [23].

M. Groshl и соавт. (2003) разработали референсные значения для кортизола, 17ОНП и прогестерона, исследовав данные параметры в слюне у 252 детей в возрасте от 4 дней до 15 лет. Сбор слюны проводился в 7:00, 13:00 и 19:00. Для этого использовались специальные наборы для сбора слюны Salivette с тампонами из полиэстера (компания-производитель Sarstedt) или для новорожденных детей с помощью модифицированной пустышки. В соске пустышки были проделаны отверстия, а полоски фильтровальной бумаги, используемой в карточках для проведения анализа методом сухих пятен крови, были помещены внутрь соски. Абсорбирующий материал не влиял на полученные результаты методом РИА. Были разработаны референсные значения для групп ­детей старше 4 нед, 1–12 мес, 1–2 лет и 2–15 лет. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Для детей старше 1 года различий в определяемых аналитах в зависимости от пола выявлено не было (p=0,05) [24].

A.Z. Juniarto и соавт. (2011) проводили сравнительный анализ содержания 17ОНП и андростендиона в крови и слюне методом ИФА. С этой целью у 24 пациентов с ВДКН в возрасте от 1,4 до 16,3 года собирали слюну с помощью специальных наборов для сбора слюны Salivette с тампонами из полиэстера (компания-производитель Sarstedt). Все пациенты получали заместительную терапию гидрокортизоном 12 мг/м²/сут, разделенную на 3 приема. Сбор слюны и крови предшествовал приему гидрокортизона. Исследователи получили положительную корреляцию содержания 17ОНП (R=0,929, p<0,01) и андростендиона (R=0,611, p<0,01) в слюне и крови [25].

Большой вклад внесла Ж.Е. Белая (2013), подтвердив в своей диссертации, защищенной на базе ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ, возможность использования слюны как альтернативного биоматериала для выявления гиперсекреции кортизола. В исследовании образцы были взяты у 255 человек (98 здоровых добровольцев с нормальным индексом массы тела и 127 пациентов с ожирением, в том числе 10 человек с избыточной массой тела, которые имели клинические признаки эндогенного гиперкортицизма). Сбор образцов проводился в специальные наборы для сбора слюны Salivette с тампонами из полиэстера (компания производитель Sarstedt). В результате исследования содержания свободного кортизола слюны, собранной в 23:00, был разработан референтный интервал (минимальный 0,5 нмоль/л, максимальный 14,5 нмоль/л) для здоровых добровольцев. Воспроизводимость определения свободного кортизола в вечерней слюне оценивалась при сравнении измерения уровня кортизола в двух образцах слюны. Всего два образца сдали 205 человек (410 образцов), статистически значимых различий между двумя тестами выявлено не было (р=0,12). Коэффициент корреляции между двумя образцами составил R=0,785 (р<0,0001). Полученные в данном исследовании результаты используются для подтверждения эндогенного гиперкортицизма у детей и взрослых по сей день с минимальной погрешностью [26].

Е. Jurgens и соавт. (2019) занимались одномоментным количественным определением 7 стероидов (андростендион, кортизон, кортизол, 11-дезоксикортизол, 21-дезоксикортизол, 17ОНП и тестостерон) в слюне с помощью ВЭЖХ МС/МС. Для этого исследования образцы собирались у 19 «здоровых» добровольцев младше 20 лет. Был выбран метод «прямого выплевывания слюны» в полипропиленовые ампулы. Основываясь на полученных результатах, были определены минимальная и максимальная концентрация для кортизола, кортизона, тестостерона и андростендиона. Полученные результаты представлены в таблице 4. Не было никаких существенных различий в зависимости от пола в вышеперечисленных аналитах, за исключением тестостерона, который у мужчин был ожидаемо выше (p<0,05). В исследуемых образцах не удалось обнаружить 21-дезоксикортизол, 11-дезоксикортизол и 17ОНП. только в нескольких образах их удалось определить в крайне низких концентрациях [27].

I. Bacila и соавт. (2019) провели мультицентровое исследование, в котором проводился сравнительный анализ содержания 5 стероидов: 17ОНП, андростендиона, тестостерона, 11-гидроксиандростендиона и 11-кетотестостерона в слюне и плазме крови у пациентов с классической 21-гидроксилазной ВДКН. В исследование были включены 78 детей в возрасте от 8 до 18 лет и группа контроля, сопоставимая по возрасту, полу и индексу массы тела. Слюна собиралась методом «пассивного слюнотечения» в полипропиленовый сосуд с одномоментным сбором венозной крови. Все дети получали заместительную терапию ГК: 72 пациента — гидрокортизон в суточной дозе от 4 до 27 мг/м², 6 пациентов — преднизолон в суточной дозе от 3 до 4 мг/м² (в пересчете на гидрокортизон от 15 до 20 мг/м²). Концентрации гормонов в плазме и слюне были значительно выше у пациентов, чем в контроле (P<0,001) для 4 исследуемых стероидных гормона (17ОНП, андростендион, 11-гидроксиандростендион и 11-кетотестостерон). У пациентов с ВДКН для всех 5 гормонов была обнаружена сильная корреляция между плазмой и слюной. Наиболее положительная корреляция отмечалась для концентрации андростендиона (rs=0,931; P<0,001) и 11-кетотестостерона (rs=0,944; P<0,001). Более слабая корреляция выявлена для концентрации тестостерона (rs=0,867; P<0,001), 17ОНП (rs=0,871; P<0,001) и 11-гидроксиандростендиона (rs=0,876; P<0,001) [28].

B.P.H. Adriaansen и соавт. (2022) занялись разработкой референсных интервалов для 17ОНП и андростендиона у здоровых добровольцев. С этой целью была собрана слюна у 255 здоровых добровольцев в возрасте от 4 до 75 лет в 3 временных точках (с 7:00 до 8:00; с 15:00 до 16:00 и с 22:00 до 23:00). В выборку не вошли девочки 10–15 лет и мальчики 11–15 лет, так как активный пубертат в данных возрастных группах может влиять на итоговые показатели. Данные временные интервалы были выбраны с учетом стандартного приема заместительной терапии пациентами с ВДКН. Для сбора слюны применялся метод прямого стекания в специальный набор для сбора слюны (полипропиленовый флакон компании BD Biosciences). Анализ проводился с помощью ЖХ МС/МС. В результате были разработаны референсные значения для нескольких возрастных групп: с 4 до 10 лет с 16 до 51 лет. Полученные результаты представлены в таблице 5 [29].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Контроль стероидного профиля у детей с ВДКН крайне важен для адекватного подбора заместительной терапии. Согласно клиническим рекомендациям, протокол наблюдения детей с ВДКН подразумевает определение уровня стероидов в крови в зависимости от возраста и степени компенсации основного заболевания 1 раз в 1–6 мес. Забор крови является «стрессорным» и крайне трудозатратным, особенно у детей первого года жизни. В связи с этим поиск альтернативного пути забора биоматериала для контроля проводимой терапии крайне важен. Согласно вышеизложенным исследованиям, слюна может быть хорошей альтернативой венозной крови для контроля проводимой терапии у пациентов с классической 21-гидроксилазной недостаточностью. Вместе с тем для разработки стандартизированного метода необходимы дальнейшие исследования в данной области.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания «Персонализация терапии врожденной дисфункции коры надпочечников на основе исследования стероидного профиля слюны» №123021000036-2.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.