Острое влияние агонистов люлиберина на гипофизарную, тестикулярную и овариальную функцию у обезьян

Пульсаторное введение низких доз люлиберина (ЛГРФ) и агонистов ЛГРФ (аЛГРФ) для лечения гипоталамического гипогонадотропного гипогонадизма свидетельствует об очевидном его преимуществе перед заместительной терапией гонадотропинами [6, 10, 12]. Обнадеживающие результаты получены и при использовании стимулирующего влияния аЛГРФ на гипофизарно-гонадальную ось для ранней диагностики пубертатных расстройств [7, 9], лечения некоторых форм задержки полового созревания и крипторхизма [6], а также для индукции овуляции в программах фер- тилизации in vitro [5, И]. Тем не менее результаты большинства клинических исследований свидетельствуют о недостаточной эффективности терапии с помощью ЛГРФ и его агонистов [6]. В определенной степени это может быть обусловлено использованием неадекватных экспериментальных моделей для отработки различных схем применения аЛГРФ в клинических целях. В частности, широко используемые в исследованиях мелкие лабораторные животные, например крысы, существенным образом отличаются от человека как по чувствительности к ЛГРФ и его агонистам, так и по механизму их регулирующего влияния на функцию гонад.

В настоящей работе представлены результаты сравнительного исследования способности агонистов ЛГРФ сурфагона (КНЦ РАМ) и бузерелина (A. Hoechst, ФРГ) стимулировать секрецию гонадотропинов и половых стероидных гормонов с учетом дозы препаратов, а также фазы овариально-менструального цикла (МЦ) в эксперименте на низших приматах.

Материалы и методы

В опытах использованы 8 половозрелых фертильных самцов и 9 самок павианов гамадрилов (Papio hamadryas) в возрасте 8—10 лет массой тела соответственно 18—22 и 9—12 кг из Сухумского и Адлерского приматологических центров. Животных во время эксперимента содержали в индивидуальных метаболических клетках в комнате с контролируемой температурой и влажностью.

Самцам вводили раствор сурфагона в изотоническом растворе хлорида натрия — D-Ala⁶, бе8С1у¹⁰-этиламид ЛГРФ (КНЦ РАМН, Россия) внутривенно в дозе 5, 50, 500 и 5000 нг на 1 кг массы тела (л = 5), раствор бузерелина — D-Ser(t- Bu)⁶, бе8С1у¹⁰-этиламид (A. Hoechst, ФРГ) внутривенно в дозе 500 и 5000 нг на 1 кг массы тела (т? = 5) или только физиологический раствор (и — 3) для получения фоновых данных. Между двумя последовательными инъекциями препаратов выдерживали по крайней мере 2-недельный интервал. Образцы крови брали из локтевой вены непосредственно перед введением препаратов, а также через 30 мин, 1, 2, 4, 6, 8 и 24 ч после их введения.

Исследование влияния аЛГРФ на овариальную функцию обезьян проводили в зависимости от фазы МЦ с использованием 2 групп самок. Животным 1-й группы сурфагон в дозе 500 и 5000 нг/кг и физиологический раствор вводили в раннюю фолликулярную фазу (3—5 день МЦ; п = 5), а также во 2-й половине фолликулярной фазы (8—12-й день МЦ; п — 3), животным 2-й группы — в лютеальную (7—9-й день после овуляции; п = 4). Регистрацию овуляции проводили путем визуальной оценки состояния половой кожи в аногенитальной области, а также изучения динамики уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ), эстрадиола (Е₂) и прогестерона (А4Р) в периферической крови. Взятие крови проводили непосредственно перед введением, а также через 1, 5 и 24 ч после введения препаратов.

Как самцам, так и самкам аЛГРФ или физиологический раствор вводили в 9—10 ч, используя в качестве антикоагулянта гепарин. Плазму отделяли центрифугированием, замораживали и хранили при —20°С до проведения гормонального анализа, концентрацию тестостерона вместе с 5ос- дигидротестостероном (Т), а также Е₂ и Д4Р определяли радиоиммунологическими методами [2— 4]. Уровень Л Г измеряли с помощью биологического микрометода in vitro [14], адаптированного к плазме павианов [8]. В качестве стандарта использовали 1-й международный стандарт ВОЗ 69/ 104. Коэффициент вариации результатов определения для всех стероидных гормонов не превышал 10% в пределах одной реакции и 15% в разных сериях определений, для ЛГ — соответственно 9 и 17%. Площадь ответа аденогипофиза и семенников на введение аЛГРФ вычисляли по площади, лежащей под кривой, характеризующей изменения концентрации соответственно Л Г или Т в плазме крови в зависимости от времени, прошедшего с момента введения препаратов. Статистическую обработку результатов анализа проводили с использованием /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Самцы. Стимулирующее влияние однократной инъекции различных доз сурфагона на уровень Т и ЛГ в плазме периферической крови самцов иллюстрирует рис. 1. Сурфагон в дозе 5 нг/кг (см. рис. 1, г) оказывал слабое активирующее влияние на секрецию Т, более выраженное при учете динамики уровня Т на введение физиологического раствора (см. рис. 1, д). Однако в дозе 50 нг/кг (см. рис. 1, в), 500 нг/кг (см. рис. 1, б) и 5000 нг/кг (см. рис. 1, а) сурфагон оказывал выраженное стиму- ' лирующее действие на концентрацию как Т, так и

Рис. 1. Динамика уровня Л Г (/) и Т (2) в плазме периферической крови самцов павианов гамадрилов в ответ на однократное внутривенное введение различных доз сурфагона.

а — 5000 нг/кг; б — 500 нг/кг; в — 50 нг/кг; г — 5 нг/кг (л = 5) и физиологического раствора (д\ п — 3).

По осям ординат: слева — уровень Т (в нмоль/л), справа — уровень ЛГ (в мМЕ/мл); по осям абсцисс здесь и на рис. 3, 4 — время (в ч).

ЛГ, достигающую максимальных значений соответственно через 2 и 0,5—1 ч.

Активирующее влияние препарата на гипофизарно-тестикулярную систему сохранялось в течение по крайней мере 8 ч. Максимальные значения Т и ЛГ в абсолютных единицах не зависели от дозы сурфагона и колебались в интервале соответственно 80—95 нмоль/л и 200—260 мМЕ/мл. Эти величины хорошо согласуются с ранее полученными для павианов в условиях максимальной

Примечание. * — р < 0,001 по отношению к соответствующим значениям при введении сурфагона в дозе 5 нг/кг. Каждую дозу препарата вводили 5 животным.

Рис. 2. Зависимость показателей стимулирующего действия сурфагона на гормональную функцию семенников от дозы.

По оси ординат: lg площади ответа T за 8-часовой период; по оси абсцисс: lg дозы сурфагона. 1 — кривая зависимости площади ответа Т, выраженной в относительных единицах (% в час), от дозы сурфагона: lg Y= -0,4 (lg X)² + 2,1 lg X- 0,3; 2 — кривая зависимости площади ответа Т в абсолютных единицах (нмоль/л в час) от дозы сурфагона: lg У = -0,5 (lg X)² + 2,7 lg X- 0,8.

стимуляции функции аденогипофиза и гонад [1], свидетельствуя о максимальной стимуляции гипофизарно-тестикулярной системы при введении сурфагона в дозе 50—5000 нг/кг. В то же время в отличие от кратковременной активации секреции ЛГ и Т после однократного введения нативного ЛГРФ [1] введение сурфагона индуцировало пролонгированное повышение уровней ЛГ и Т.

Площадь ответа Т и ЛГ за 8-часовой период (см. таблицу) была практически одинаковой для 3 исследуемых доз сурфагона (50, 500, 5000 нг/кг) как в относительных (% в час), так и в абсолютных величинах. В то же время введение сурфагона в дозе 5 нг/кг индуцировало в 20—40 раз меньшую тестикулярную активность (см. таблицу). Зависимость площади ответа Т от дозы сурфагона выражалась биквадратным уравнением от логарифмических функций вида

lg Г= a (lg X)² + lg Х + с,

где Y — площадь ответа Т за 8 ч; X — доза препарата (в нг на 1 кг массы тела); а, Ь, с — коэффициенты, зависимые от единиц измерения площади ответа, исходного уровня Т, индивидуальных особенностей динамики уровня Т в ответ на введение сурфагона (рис. 2).

Динамика уровня Т и ЛГ в плазме периферической крови обезьян при однократном введении бузерелина в дозе 500 и 5000 нг/кг носила сходный характер с изменением уровня половых гормонов в ответ на введение соответствующих доз сурфагона. Площадь ответа Т и ЛГ за исследуемый 8-часовой период как в абсолютных, так и относительных единицах практически не различалась для исследуемых доз бузерелина и была сравнима с таковой, индуцированной введением соответствующих доз сурфагона (см. таблицу). Однако при этом следует отметить существенно более низкие значения площади ответа Л Г, выраженные в относительных единицах, по сравнению с соответствующими значениями для площади аденогипофизарного ответа, индуцированного введением сурфагона. Последнее, очевидно, обусловлено различиями в базальных уровнях Л Г, которые для животных, получавших сурфагон, составляли в среднем 59 ± 8 мМЕ/мл, бузерелин — 98 ± 7 мМЕ/мл.

Самки. Фолликулярная фаза. Динамика уровня Е₂ и Д4Р у самок при инъекции различных доз сурфагона в раннюю фолликулярную фазу пред-

Рис. 3. Динамика уровня Е₂ (fl, в пмоль/л) и Д4Р (б, в пмоль/л) в плазме периферической крови самцов павианов гамадрилов в ответ на однократное внутривенное введение различных доз сурфагона (1 — 5000 нг/кг; 2 — 500 нг/кг; п = 5) и физиологического раствора (5; п = 3) в раннюю фолликулярную фазу МЦ (3—5-й день).

ставлена на рис. 3. Как видно, сурфагон в дозе 5000 нг/кг оказывал выраженное активирующее действие на стероидогенез в фолликулах. Так, через 5 ч после инъекции содержание Е₂ более чем в 2 раза превышало его исходную концентрацию и сохранялось на достигнутом уровне в течение 24 ч (/? < 0,001). В дозе 500 нг/кг сурфагон оказывал менее выраженное активирующее влияние на концентрацию Е₂ через 5 ч (577 ± 90 пмоль/л против 366 ± 80 пмоль/л до введения; р > 0,05), которая через 24 ч возвращалась к исходному уровню. Следует отметить, что в отличие от большинства животных у одной из самок, получавшей сурфагон в дозе 500 нг/кг, отмечалось резкое повышение уровня Е₂ через 5 ч после введения, сравнимое с аналогичным подъемом при введении сурфагона в дозе 5000 нг/кг. Однако в отличие от последнего через 24 ч уровень Е₂ возвращался к исходным значениям.

Уровень Д4Р статистически достоверно не изменялся при введении сурфагона в дозе как 5000 нг/кг, так и 500 нг/кг. Следует, однако, отметить четкую тенденцию к повышению уровня А4Р через 1 ч после введения сурфагона в дозе 5000 нг/кг. Последнее, очевидно, является отражением базального характера овариального стероидогенеза в раннюю фолликулярную фазу, который еще не приобрел особенности, детерминированные функционированием фолликула. Выброс ЛГ, стимулированный введением сурфагона, индуцируя ранний ключевой этап стероидогенеза — трансформацию холестерина в прегненолон, стимулирует, очевидно, и превращение последнего в Д4Р, возможно, путем простой субстратной индукции. Через 5 и 24 ч активируется синтез эстрогенов, характерный для фолликулярной фазы.

Введение сурфагона во 2-ю половину фолликулярной фазы не оказывало влияния на содержание Д4Р в крови и стимулировало секрецию Е₂ на протяжении суток (890 ± 98 пмоль/л через 5

Рис. 4. Динамика уровня Е₂ (fl, в пмоль/л) и Д4Р (б, в пмоль/л) в плазме периферической крови самцов павианов гамадрилов в ответ на однократное внутривенное введение различных доз сурфагона (/ — 5000 нг/кг; 2 — 500 нг/кг; п = 4)i и физиологического раствора (3; п = 4) в лютеальную фазу МЦ (7—9-й день).

ч, 962 ± 96 пмоль/л через 24 ч против 560 ±18 пмоль/л до введения; р < 0,01).

Следует отметить, что введение сурфагона в раннюю фолликулярную фазу в дозе 5000 нг/кг у 2 из 5 экспериментальных животных сопровождалось изменениями в характере и продолжительности МЦ. У одной из самок МЦ был укорочен до 18 дней (в контрольном периоде — 32—33 дня) и носил ановуляторный характер, а у другой, напротив, — удлинен до 35 дней (в контроле — 25 дней) за счет увеличения продолжительности фолликулярной фазы. Сходные нарушения МЦ при введении аЛГРФ в первые дни МЦ наблюдались и у других видов обезьян [13, 15]. Следует подчеркнуть, что глубокое влияние аЛГРФ на задержку фолликулогенеза наблюдали только в тех случаях, когда эти пептиды вводили в раннюю фолликулярную фазу. Так, как уже отмечалось выше, введение сурфагона во 2-ю половину фолликулярной фазы, оказывая выраженное стимулирующее влияние на секрецию Е₂, не приводило к нарушению процессов овуляции и продолжительности МЦ. Очевидно, нарушения обусловлены ингибирующим влиянием высоких концентраций гонадотропинов, индуцированных введением аЛГРФ, на процесс отбора фолликулов до селекции доминирующего фолликула.

Лютеальная фаза. Введение сурфагона в дозе 5000 нг/кг приводило к существенному повышению уровня Д4Р через 1 ч посл'е инъекции (34 ±1,5 нмоль/л против 24 ± 4 нмоль/л; р < 0,05), которое сохранялось на том же уровне в течение 5 ч (рис. 4), подтверждая важную роль ЛГ в регуляции функции желтого тела. В дозе 500 нг/кг сурфагон не давал выраженного лютеотропного эффекта. Помимо стимуляции синтеза Д4Р, сурфагон активировал секрецию эстрогенов, более выраженную при введении 5000 нг/кг. Однако в отличие от Д4Р максимальный стимулирующий эффект агониста на концентрацию Е₂ наблюдался позже, т. е. только через 5 ч, но частично сохранялся и через сутки при введении сурфагона в дозе 5000 нг/кг. Продолжительность МЦ при введении сурфагона в лютеальную фазу не нарушалась.

Выводы

1 . Однократное внутривенное введение сурфагона и бузерелина самцам павианов гамадрилов в дозах 50, 500 и 5000 нг/кг индуцирует резкое повышение уровней ЛГ и Т в плазме периферической крови в течение 8 ч. Биологическая активность сурфагона и бузерелина практически идентична.

2. Активирующее влияние сурфагона на гормональную активность семенников носит зависимый от дозы характер, выражающийся биквадратным уравнением вида

lg Y= a (lg X)^[1] + b lg X + c,

где Y — площадь ответа T за 8 ч; X — доза препарата (в нг на 1 кг массы тела); а, Ь, с — коэффициенты, зависимые от единиц измерения площади ответа, исходного уровня Т и индивидуальных особенностей реакции семенников на введение сурфагона.

3. Однократное внутривенное введение сурфагона самкам павианов гамадрилов в раннюю фолликулярную фазу индуцирует пролонгированную активацию секреции эстрадиола, более выраженную в дозе 5000 нг/кг. Активирующее влияние сурфагона на фолликулярный стероидогенез может сопровождаться последующими нарушениями в характере и продолжительности МЦ.
4. Однократное внутривенное введение сурфагона самкам павианов гамадрилов в лютеальную фазу МЦ оказывало лютеотропное действие, а также вызывало активацию секреции эстрадиола, существенно более выраженные при введении препарата в дозе 5000 нг/кг.