Роль межклеточных взаимодействий в печени при реализации кооперативного эффекта глюкокортикоидов и липопротеинов крови

Известно, что между клетками печеночного синусоида и гепатоцитами существуют многочисленные функциональные связи. Особый интерес представляют взаимодействия между резидентными макрофагами (клетками Купфера) и гепатоцитами в обмене стероидных гормонов. Показано, что в макрофагах глюкокортикоиды подвергаются восстановлению при учатсии 5оси 5[3-редуктаз с образованием тетрагидросоединений, при этом восстанавливается Д⁴, 3-кетогруппа в кольце А [13]. Ранее предполагалось, что тетрагидросоединения не обладают функциональной активностью, в гепатоцитах они трасформируются в глюкурониды и в таком виде выводятся из организма [10].

Функциональные связи между макрофагами и гепатоцитами проявляются также при обмене липопротеинов (ЛП). Клетки Купфера захватывают как модифицированные, так и интактные ЛП, которые в них подвергаются неполной деградации [2]. Показано, что после захвата ЛП высокой плотности 3-го подкласса (ЛПВП₃) и кортизола макрофаги ресекретируют аполипротеин А-1 и тетрагидрокортизол. Комплекс этих соединений повышает биосинтез белка в гепатоцитах, т. е. проявляется кооперативный эффект, не характерный для каждого отдельно взятого компонента |6, 7|.

В данном исследовании прослежены некоторые биохимические изменения в крови и ультраструктурные изменения в клетках печени при анализе кооперативного эффекта глюкокортикоидов с ЛПВП₃ и с ЛП низкой плотности (ЛПНП).

Материалы и методы

Работа выполнена на крысах-самцах Вистар массой 180—200 г. В сыворотке крови определяли липопротеиновый спектр с помощью электрофореза в полиакриламидном геле [11] и содержание 11оксикортикостероидов (11-ОКС) флюориметрическим методом [8] через 24 и 72 ч после стимуляции резистентных макрофагов липополисахаридом (ЛПС) бактериального происхождения. В качестве последнего использовали продигиозан ("Мосхимфармпрепарат”) в дозе 0,25 мг/кг внутривенно.

Для морфологических исследований животных забивали под эфирным наркозом, после чего печень in situ отмывали фосфатным буфером от крови. Перфузию изолированной печени проводили in vitro при 37°С 10, 30 и 60 мин в замкнутой системе объемом 25 мл через v. porta средой Игла pH 7,4, содержащей 20 мм HEPES, 10 мкМ кортизола и конъюгаты коллоидного золота с ЛП из расчета 100 мкг белка на 1 мл среды. Для стимуляции макрофагов в параллельных сериях в перфузат вносили продигиозан (20 мг/мл). Коллоидное золото с размером частиц 9—10 нм получали по методу Frens [9]. Нативные ЛПНП (d = 0,95 — 1,006 г/мл) и ЛПВП₃ (d = 1,125—1,21 г/мл) выделяли из сыворотки крови крыс методом изоплотностного ультрацентрифугирования [ 12|. Авторы выражают глубокую благодарность Г. В. Правоторову и И. Ф. Усынину за организацию эксперимента.

Для электронно-микроскопического исследования материал фискировали в 2,5% растворе глутарового альдегида, дофиксировали в 1,5% растворе OsO₄, заливали в смесь эпона с аралдитом. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали в электронном микроскопе JEM100SX при увеличении 5000—30 000. Количественно оценивали распределение метки между клетками печени. Стереоморфометрию проводили только в тех ядрах гепатоцитов, в срез которых попало ядрышко. Измеряли диаметр ядер, относительные объемы эухроматина, гетерохроматина и ядрышка. Отдельно учитывали относительный объем гранулярного вещества в ядрышках. В каждом ядре считали число ядерных пор по срезу оболочки и выражали их плотность в расчете на 10 мкм ее длины. Статистическую обработку данных проводили в пакете Statgraphics 4.0, уровень достоверности принимали равным 0,05.

Результаты и их обсуждение

Проведенные ранее исследования показали, что в реализации кооперативного эффекта глюкокортикоидов и ЛПВП₃ активную роль играют макрофаги печени, а основным его проявлением является усиление биосинтеза белка в гепатоцитах [3, 4]. Функциональная взаимосвязь гормонов и ЛП в крови проявляется в одновременном снижении содержания глюкокортикоидов, доли ЛПВПз и ЛПНП в липопротеиновом спектре после введения животным Л ПС. Именно стимуляция Л ПС ретикулоэндотелиальной системы делает заметным одновременный захват обоих соединений. Относительное содержание других ЛП (высокой плотности 2-го подкласса — ЛПВП₂ и очень низкой плотности — ЛПОНП) в этих условиях увеличивалось (табл. 1).

Результаты подсчета метки на ультратонких срезах в экспериментах с перфузией печени показали, что основная масса меченных коллоидным золотом ЛПВП₃иЛПНП захватывается эндотелиоцитами и макрофагами с помощью рецепторно-обусловленного эндоцитоза. В эндотелиоцитах трасцитоз ЛП осуществляется в составе эндосом. Этот механизм внутриклеточного перемещения, вероятно, не приводит к существенным изменениям структуры ЛП. В макрофагах метка накапливается преимущественно в лизосомах. Биохимически было показано, что в лизосомах полной деградации ЛП не происходит. Освобождающиеся аполипопротеины, обладая выраженными детергентными свойствами, легко проникают за пределы вторичных лизосом [5].

Количество и распределение меченных коллоидным золотом липопротеинов между клетками печени (усредненные данные за 10—60 мин перфузии средой Игла с добавлением глюкокортикоидов).

а — гепатоцит; б — вне клеток; в — эндотелий; г — макрофаг.

По оси ординат — число на единицу площади.

Эндосомы и вторичные лизосомы могут открываться на базальной поверхности клеток, освобождая свое содержимое в интерстициальное пространство. В макрофагах также происходит ферментативная модификация стероидных гормонов, связанная с восстановлением А⁴, 3-кетогруппы в кольце А, что было показано ранее другими авторами [13].

Рецепторно-обусловленный эндоцитоз ЛП значительно усиливается как в эндотелиоцитах, так и в макрофагах под влиянием ЛПС (см. рисунок). Данный эффект наиболее ярко выражен, когда перфузия проводилась глюкокортикоидами и ЛПВП₃. Оказалось, что уже через 10 мин перфузии 70% всей метки обнаруживалось во вторичных лизосомах макрофагов. В дальнейшем метка распределялась более равномерно между синусоидными клетками. Через 60 мин она уже появлялась в пространстве Диссе. В гепатоцитах обнаруживалось не более 7% метки. Это свидетельствует о том, что в присутствии глюкокортикоидов стимулированные синусоидные клетки значительно активнее захватывают и переносят Л П из крови в интерстиций. При этом вполне возможно, что их связь с частицами коллоидного золота теряется.

Морфометрические исследования показали, что при перфузии печени средой Игла с добавлением кортизола и ЛПВП₃ ^или кортизола и ЛПНП не происходит существенных изменений в ядрах гепатоцитов. Однако ситуация оказалась существенно иной, когда перфузию осуществляли в присутствии ЛПС (табл. 2). При стимуляции макрофагов отмечалось достоверное увеличение относительного объема ядрышек и содержания гранулярного компонента в них. Особенно ярко это проявилось при использовании глюкокортикоидов и ЛПВПз по сравнению с ЛПНП; кроме того, обнаруживалось достоверное увеличение плотности ядерных пор иТаблица 1

Изменение липопротеинового спектра (в %) и содержания 11-ОКС (в мг%) в сыворотке крови после введения ЛПС (М ± т)

Примечание. * — достоверность (р < 0,05) средних различий с интактными животными.

Морфометрические показатели ядер гепатоцитов при перфузии печени крыс средой Игла с глюкокортикоидами и ЛП (М ± т)

Примечание. * — достоверность различий средних (р < 0,05) с интактной печенью; ** — усредненные результаты за время перфузии от 10 до 60 мин. Г — глюкокортикоид.прослеживалась четкая динамика всех показателей. Уже через 10 мин перфузии относительный объем ядрышек и содержание гранулярного вещества в них достигали максимальных значений. Фибриллярный компонент выглядел рыхлым, мелкозернистым, в нем выявилось много фибриллярных центров. Ядрышки приобретали нуклеонемное строение. Такие изменения, согласно общепринятым критериям, свидетельствуют об активном формировании незрелых субъединиц рибосом [1 ]. Через 30 мин перфузии все признаки активации ядер сохранялись. Более того, в ядерных мембранах более чем в 2 раза увеличивалась плотность поровых комплексов, что создавало необходимые предпосылки для быстрой доставки в цитоплазму продуктов синтетической активности ядрышек. Через 60 мин перфузии высокий относительный объем ядрышек сохранялся, однако содержание гранулярного вещества в нем значительно снижалось. Одновременно на ядерной мембране уменьшалась плотность пор, оставаясь выше контрольных показателей. Эти перестройки являются необходимым условием для усиления синтеза белка в гепатоцитах.

Выводы

1. Получены ультраструктурные подтверждения, свидетельствующие о существовании функциональных связей между непаренхимными клетками печени и гепатоцитами при обмене глюкокортикоидов и ЛП крови.
2. Стимуляция макрофагов ЛПС вызывает параллельное снижение концентрации глюкокортикоидов и доли ЛПВП₃ и ЛПНП в липопротеиновом спектре крови. В опытах in vitro показано, что при этом резко усиливаются захват и трансцитоз меченых ЛП через синусоидные клетки, особенно ЛПВП₃.
3. Морфологическим проявлением кооперативного эффекта глюкокортикоидов и Л ПВП₃, а также глюкокортикоидов и ЛПНП являются структурнофункциональные изменения ядер гепатоцитов. При стимуляции макрофагов ЛПС в ядрах гепатоцитов увеличиваются относительный объем ядрышек и содержание гранулярного вещества в них, а также плотность поровых комплексов, что указывает на усиление экспрессии генов, в первую очередь входящих в ядрышковую ДНК.