Полиморфные маркеры генов АРОВ и АРОЕ, а также хромосомная область 3q21-q25 ассоциированы с развитием диабетической нефропатии при сахарном диабете типа 1

Диабетическая нефропатия (ДН) — микрососудистое осложнение сахарного диабета (СД), развитие которого значительно ухудшает течение и дальнейший прогноз заболевания. При ДН наблюдается поражение мелких кровеносных сосудов фильтрирующего аппарата почек, приводящее в дальнейшем к увеличению количества белка, выделяющегося с мочой (протеинурии). Несмотря на сходную частоту развития ДН при СД типов 1 и 2, смертность от терминальной почечной недостаточности у больных СД типа 1 гораздо выше. Эффективность терапии данного осложнения в значительной мере зависит от своевременности его выявления, что придает особую актуальность и значимость проблеме изучения факторов риска ДН и диктует необходимость выработки информативных методов ее прогнозирования.

Ранее проведенные исследования ассоциации большой группы генов-кандидатов показали, что только полиморфные маркеры гена фермента, превращающего ангиотензин I (АСЕ), и гена NO-син- тетазы клеток эндотелия сосудов (NOS3) ассоциированы с ДН среди русских больных СД типа 1 [1]. Ассоциацию генов, кодирующих липопротеины, ранее не изучали среди русских больных СД типа 1, хотя и считается, что одним из факторов риска ДН при СД типа 1 является повышенная концентрация липидов в плазме, поскольку определенные группы липопротеинов обладают сильным сродством к сосудистой стенке и могут способствовать ее повреждению. По некоторым данным, измененный липидный профиль на ранних стадиях может быть причиной развития нефропатии нормоальбумину- рического типа у пациентов с СД типа 1. Поэтому гены, кодирующие аполипопротеины В и Е, индивидуальные концентрации и свойства которых в значительной мере определяют липидный обмен у конкретного больного, представляют несомненный интерес для исследования в качестве генов- кандидатов, определяющих предрасположенность к развитию сосудистых осложнений при СД типа 1.

Аполипопротеин Е (апоЕ) играет центральную роль в метаболизме липидов. Его основная функция — участие в доставке холестерина тканям от мест его синтеза или всасывания в составе липопротеинов. Эта функция осуществляется благодаря высокому сродству апоЕ к рецепторам липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой (ЛПОНП) плотности, что способствует эндоцитозу ассоциированных липопротеиновых частиц [17].

Аполипопротеин Е существует в трех распространенных изоформах: Е2, ЕЗ и Е4. Все изоформы кодируются одним геном (АРОЕ). Различия между ними определяются двумя однонуклеотидными полиморфизмами (С/Т) в экзоне 4, которым соответствуют полиморфизмы аминокислотных остатков: цистеина (Cys) или аргинина (Arg) в положениях 112 и 158 аминокислотной последовательности апоЕ. Аллелю е2 соответствует наличие 2 остатков Cys в обоих положениях (Cysl 12 и Cys 158), аллелю еЗ — наличие Cysl 12 и Arg 158 и аллелю s4 — наличие 2 остатков Arg в обоих положениях (Argll2 и Argl58) [13]. Ряд исследований, проведенных на зарубежных популяциях, указывает на несомненную связь полиморфного маркера £2/сЗ/е4 гена АРОЕ с развитием ДН при СД типа как 1, так и 2 [4, 5, 10].

Аполипопротеин В (апоВ) — один из наиболее важных структурных апобелков частиц хиломикронов, ЛПОНП, липопротеинов промежуточной плотности, а также ЛПНП. Он играет важную роль в сборке и секреции частиц хиломикронов из тонкой кишки и ЛПОНП из печени [19], а также является лигандом для рецепторов, связывающих ЛПНП, таким образом, опосредуя поступление холестерина внутрь клеток [7]. Та центральная роль, которую апоВ играет в транспорте липидов, позволяет высказать предположение о том, что одной из основных причин, определяющих различия в уровне липидов у разных индивидов, может быть именно носительство определенных аллельных вариантов гена АРОВ. Одним из наиболее важных аллельных вариантов гена АРОВ, несомненно, является полиморфизм I/D в области, кодирующей сигнальный пептид. Данный полиморфизм представляет собой вставку/отсутствие вставки из 9 нуклеотидов, кодирующих аминокислоты 14—16 сигнального пептида (Leu—Ala—Leu) [6]. По всей видимости, сигнальный пептид играет важную роль как в эффективности внутриклеточного транспорта вновь синтезированного белка, так и в секреции и деградации апоВ.

Сравнение экспериментальных данных, полученных во многих исследованиях, в том числе и в наших работах, выявляет значительную противоречивость полученных результатов об ассоциации генов-кандидатов с ДН. Эта противоречивость и была одной из причин того, что в лаборатории Кро- левского (США) провели анализ сцепления с ДН участков хромосом, содержащих гены АСЕ, AGT и AT₂R1, с использованием семей с дискордантными сибсами из европейской популяции США. Оказалось, что области генома, в которых локализованы гены АСЕ и AGE, не сцеплены с ДН при СД типа 1, однако существует сильное сцепление с ДН участка размером 20 сМ из области 3q21—q25, содержащий ген AT₂R1 [18].

Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров е2/еЗ/е4 гена АРОЕ, I/D гена АРОВ и группы полиморфных микросателлитов, расположенных в хромосомной области 3q21 — q25, с развитием ДН у русских пациентов с СД типа 1, проживающих в Москве.

Материалы и методы

Группы больных русского или восточнославянского происхождения были отобраны из числа пациентов Эндокринологического научного центра РАМН (Москва). Группы формировали с использованием неперекрывающихся критериев отбора. В группу с ДН (ДН +; п = 62) вошли больные с продолжительностью СД типа 1 не более 15 лет и выраженной протеинурией (альбуминурия свыше 300 мг/ сут). Контрольную группу (ДН-) образовали 68 пациентов с длительным (более 20 лет) диабетом и альбуминурией менее 200 мг/сут. Общая характеристика обследованных больных приведена в табл. 1.

Геномную ДНК из венозной крови обследуемых выделяли с помощью метода фенол-хлороформной экстракции [15]. Полиморфные участки амплифи- цировали с помощью ПЦР. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле. Гели окрашивали нитратом серебра [8].

Идентификацию аллелей полиморфного маркера e2/£3/s4 гена АРОЕ проводили после расщепления продукта амплификации (272 п. н.) рестрикта- зой HinGI. Аллелю s2 на полиакриламидном геле соответствовали фрагменты размером 91 и 83 п. н., аллелю еЗ — 91, 48 и 35 п. н., аллелю s4 — 72, 48, 35 и 19 п. н. В случае полиморфного маркера I/D гена АРОВ аллелю I (наличие вставки) соответствовал фрагмент размером 92 п. н., а аллелю D (отсутствие вставки) — фрагмент размером 83 п. н.

Сравнение распределения частот аллелей и генотипов исследованных полиморфных маркеров в группах проводили с использованием точного критерия Фишера. Статистически достоверными считали различия при р < 0,05. Для полиморфного маркера е2/еЗ/е4 гена АРОЕ и полиморфных микросателлитов, расположенных в хромосомной области 3q21— q25, вводили поправку на множественность аллелей и генотипов (поправка Бонферро- ни). Относительный риск развития заболевания оценивали с помощью показателя соотношения шансов (OR). Значение OR и доверительного интервала (CI) вычисляли с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (D. Hutchon [14]).

Таблица 1. Клиническая характеристика обследованных больных СД типа 1 с ДН+ и ДН- (М ± SD)

Результаты и их обсуждение

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера е2/еЗ/е4 гена АРОЕ (табл. 2) показал, что наиболее часто в обеих группах встречался аллель еЗ (0,815 и 0,693 в группах ДН+ и ДН- соответственно), а наиболее распространенным генотипом был еЗ/еЗ (0,704 и 0,539 соответственно). Аллель е2 встречался чаще, чем аллель е4: в 2,3 раза в группе ДН+ и в 1,5 раза в контрольной группе. Генотипы е2/еЗ и еЗ/е4 в группе больных с ДН наблюдались с одинаковой частотой (0,111), а генотипы е2/е4 и е4/е4 в данной группе не обнаружены. При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера е2/еЗ/е4 между двумя группами было обнаружено достоверное (д = 0,026 с поправкой на множественность аллелей) возрастание содержания аллеля еЗ в группе больных ДН+ (0,815 против 0,693 в группе ДН-), при этом доля аллеля е4 уменьшилась в 2,2 раза (0,056 против 0,123), а доля аллеля е2 — в 1,43 раза (0,129 против 0,184) по сравнению с группой больных без ДН. Однако эти различия оказались статистически недостоверными. В распределении генотипов наблюдалось возрастание доли генотипа еЗ/еЗ в группе ДН+ (0,704 против 0,539 в группе ДН-) при уменьшении содержания всех остальных генотипов, кроме е2/еЗ (см. табл. 2). Однако после введения поправки на множественность генотипов статистически достоверными оказались только различия в распределении генотипа еЗ/еЗ (р = 0,048).

Таблица 2. Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров е2/еЗ/е4 гена АРОЕ и I/D гена АРОВ в группах больных СД типа 1 с ДН+ и ДН-

Ген АРОВ

Полученные данные свидетельствуют об ассоциации полиморфного маркера е2/еЗ/е4 гена АРОЕ с развитием ДН при СД типа 1 у русских пациентов Москвы. При этом носительство аллеля еЗ и генотипа еЗ/еЗ является генетическим фактором повышенного риска развития ДН при СД типа 1 (OR = 2,08; Cl = 1,12—3,87 и QR = 2,16; CI = 1,01—4,63 соответственно).

Результаты поиска ассоциации полиморфного маркера е2/еЗ/е4 гена АРОЕ с развитием ДН в других популяциях носит противоречивый характер. В группах больных СД типа 1 из Германии, Франции, Дании и России (Санкт-Петербург) не обнаружено ассоциации данного полиморфного маркера с ДН [12, 20, 21, 23]. В то же время в группах больных СД типа 1 из Великобритании и США была обнаружена ассоциация аллеля е2 с повышенным риском развития ДН [5, 10]. В работе финских авторов обнаружена ассоциация аллеля е4 с повышенным риском ДН при СД типа 2, в то время как носительство аллеля е2 связано с пониженным риском развития дН [22]. Прямо противоположные результаты были получены в 3 работах японских авторов: среди японских больных СД типа 2 носители аллеля е2 имеют повышенный риск [4, И], в то время как носители аллеля е4 имеют пониженный риск развития ДН [16].

Полученные нами данные о повышенном риске развития ДН у русских больных СД типа 1 — носителей аллеля еЗ и генотипа еЗ/еЗ не находят аналогий с результатами, полученными во всех других исследованиях. Подобные расхождения в результатах исследований скорее всего связаны с тем, что полиморфный маркер е2/еЗ/е4 гена АРОЕ не относится к функционально важным полиморфизмам. Однако обнаруженные в различных исследованиях, проведенных к тому же на разных популяциях, ассоциации данного полиморфного маркера гена АРОЕ с развитием ДН при СД типа как 1, так и 2 указывают на то, что в некоторых популяциях данный маркер находится в неравновесии по сцеплению с другими маркерами, которые действительно определяют некие функционально важные различия в структурной организации гена АРОЕ. Можно предположить, что это могут быть, например, еще не выявленные различия в уровне экспрессии и/ или стабильности мРНК, которые могут определять уровень синтеза этого белка в организме.

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера I/D гена АРОВ (см. табл. 2) показал, что в группе ДН+ самым распространенным вариантом был гомозиготный генотип I/I, тогда как в группе ДН- преобладал гетерозиготный генотип I/D. В группе ДН+ гомозиготный генотип II встречался в 1,54 раза чаще (р = 0,034), в то время как гетерозиготный генотип ID, напротив, встречался в 1,24 раза реже, чем у пациентов без ДН. В группе больных с ДН также наблюдалось достоверно более высокое (р = 0,018) содержание аллеля I (0,722 против 0,585 в группе ДН-).

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что полиморфный маркер I/D гена АРОВ ассоциирован с развитием ДН при СД типа 1 у русских пациентов, проживающих в Москве. При этом носители аллеля I и генотипа 1/1 имеют повышенный риск развития ДН (OR - 1,91; CI = 1,10-3,29 и OR = 2,11; CI = 1,01-4,43 соответственно), в то время как носители аллеля D, напротив, имеют пониженный риск развития данного осложнения (OR — 0,52; CI = 0,31—0,91).

Известно, что сигнальный пептид играет важную роль во внутриклеточном транспорте вновь синтезированного белка, а также в секреции и деградации апоВ. Попытки обнаружить корреляцию между аллелями этого полиморфного маркера и такими показателями, как уровни триглицеридов и холестерина, а также ЛПОНП, успехом не увенчались, так как сравнение результатов, полученных в группах пациентов из различных популяций, показало их крайнюю противоречивость. Тем не менее многие данные свидетельствуют о том, что ген АРОВ вовлечен в развитие сердечно-сосудистых патологий, а полиморфный маркер I/D каким-то образом ассоциирован с изменениями липидного профиля и развитием атеросклероза в различных популяциях [9]. Ассоциацию гена АРОВ с ДН при СД типа 1 ранее не изучали и полученные нами результаты — первый пример достоверной ассоциации гена АРОВ с осложнениями при СД.

Обобщая полученные данные, можно сделать вывод о несомненной вовлеченности ряда генов липидного обмена в развитие ДН при СД типа 1 у русских пациентов Москвы. Однако следует отметить, что достаточно важную роль в патогенезе ранних стадий ДН играют также гены, продукты которых связаны с регуляцией сосудистого тонуса в микроциркуляторном русле, такие как АСЕ и NOS3 [1, 2].

Следует отметить, что ассоциация всех этих 4 генов с ДН является достоверной, но относительно слабой и, по всей видимости, связана скорее с прогрессией, чем с первыми этапами развития ДН. Общий анализ всего массива данных показывает низкую достоверность и значительную противоречивость результатов, полученных при изучении ассоциации с ДН полиморфных маркеров генов-кандидатов в различных популяциях. В связи с этим, используя те же группы больных СД типа 1 и без ДН, мы изучили ассоциацию с ДН хромосомной области 3q21 — q25, сцепление которой с СД в дискор- дантных семьях из европейской популяции США было обнаружено ранее [18].

Взаимное расположение 4 микросателлитных маркеров, расположенных в области 3q21 — q25 рядом с геном AT₂R1, показано на рисунке. В случае маркера D3S1744 ассоциации не обнаружено [3]. Только аллель 12 маркера D3S1512 [3] был ассоциирован с ДН (ОТ? = 3,39; CI = 1,71     - 6,72; р = 0,0054). Показано, что у носителей аллеля 26 маркера D3S2326 понижен риск ДН (OR = 0,41; CI = 0,21 — 0,80; р - 0,005), тогда как у носителей аллеля 27 — повышен (OR = 2,96; CI = 1,53 — 5,75; р = 0,048) [3]. Наиболее сильная ассоциация с ДН обнаружена у маркера D3S1550. Значительно более высокий риск развития ДН имели носители аллеля 12 (OR = 4,85; CI = 1,73-13,58; р = 0,01) и генотипа 12/14 (OR = 6,25; CI = 1,93-20,25; р = 0,024; табл. 3).

В этой области хромосомы 3 недалеко от маркера D3S1550 найдено 3 гена. Ген LOC285195 гомологичен гену №⁺/Н⁺-АТФазы 7, которая осуществляет обмен ионов натрия и водорода. Ген LOC257039 гомологичен гену S17, кодирующему рибосомный белок субъединицы 40S рибосом, ген LOC285328 гомологичен гену GM2, кодирующему один из компонентов комплекса, расщепляющего ганглиозиды. Все эти гены, в первую очередь ген Ка⁺/Н⁺-АТФазы 7, могут рассматриваться в качестве генов-кандидатов, определяющих развитие ДН.

Таблица 3. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера D3S1550, расположенного в области q21—q25 хромосомы 3 у больных СД типа 1 с ДН+ и ДН-

Примечание. * — обозначение аллелей и генотипов соответствует числу повторяющихся единиц в аллелях полиморфного микросателлита D3S1550.

Среди ряда моделей, объясняющих роль и взаимодействие генетических и метаболических факторов в развитии сосудистых осложнений, в частности ДН, на наш взгляд, наиболее правомочен "смешанный" вариант, предполагающий, что некоторые гены, в том числе, возможно, один "главный", могут интерферировать с метаболическими факторами риска и инициировать ДН, тогда как другие гены больше влияют на скорость ее развития. Опираясь на наши данные [3] и результаты геномного поиска, проведенного в США [18], можно предположить, что в области q21—q25 хромосомы 3 находится именно "главный" ген. Следует отметить, что положительные результаты, полученные разными методами на 2 неродственных популяциях, значительно увеличивают вероятность того, что этот "главный" ген находится именно в данном районе хромосомы 3.

за провоспалительных адгезивных молекул — сосудисто-клеточной адгезивной молекулы 1 (VCAM- 1) и внутриклеточной адгезивной молекулы 1 (ICAM-1), гиперреактивностью гладкомышечных клеток сосудов (CMVC) к сосудосуживающим стимулам, способствуя развитию изменений сосудистой стенки и сосудистых осложнений диабета, включая диабетическую нейропатию [4]. Окислительный стресс является неотъемлемой частью метаболических нарушений, инициирующих перечисленные механизмы развития поздних сосудистых осложнений сахарного диабета.

Выводы

1. Полученные в настоящей работе данные показывают, что гены АРОЕ и АРОВ, продукты которых играют центральную роль в метаболизме липидов, вовлечены в патогенез ДН у русских, больных СД типа 1, проживающих в Москве.
2. Носители аллеля ЕЗ и генотипа ЕЗ/ЕЗ полиморфного маркера Е2/ЕЗ/Е4 гена АРОЕ имеют повышенный риск развития ДН. Носители аллеля I и генотипа II полиморфного маркера I/D гена АРОВ имеют повышенный риск развития ДН, в то время как носители аллеля D, напротив, имеют пониженный риск развития ДН.
3. В хромосомной области 3q21—q25 обнаружена ассоциация с ДН группы полиморфных микросателлитов. Наиболее сильная ассоциация обнаружена для маркера D3S Значительно более высокий риск развития ДН имели носители аллеля 12 (ОА = 4,85) и генотипа 12/14 (ОА = 6,25).
4. По всей видимости, в хромосомной области 3q21— q25 находится "главный" ген, инициирующий развитие ДН, тогда как другие гены, ассоциированные с ДН, в большей мере влияют на скорость ее прогрессии.