Preview

Проблемы Эндокринологии

Расширенный поиск

Экскреция гидроксипролина с мочой и локализация коллагена III, IV и VI типов в клубочках почек у больных сахарным диабетом 1-го типа с нефропатией

https://doi.org/10.14341/probl20055146-10

Полный текст:

Аннотация

Цель работы - изучить метаболизм коллагена и аккумуляцию коллагена III, IV и VI типов в клубочках почек у больных сахарным диабетом (СД) 1-го типа с ранними стадиями нефропатии. У 57 больных СД и 15 здоровых лиц определяли экскрецию пептидно-связанного и свободного гидроксипролина с мочой. У 17 больных проведено иммуногистохимическое исследование биоптатов почек с помощью моноклональных антител к коллагену III, IV и VI типов. Контролем служили почки 10 здоровых лиц, погибших от несчастных случаев. Значительное увеличение экскреции с мочой пептидно-связанного гидроксипролина обнаружено у больных СД с микро- и микроальбуминурией. Избыточная аккумуляция в клубочках коллагена IV и VI типов выявлена у 8 и 7 пациентов соответственно. Интерстициальный коллаген III типа обнаружен в клубочках у 9 больных, в то время как в контроле он отсутствовал. Полученные данные свидетельствуют о значительной интенсификации обмена коллагена и аккумуляции коллагена III, IV и VI типов в почечных клубочках у больных СД 1-го типа с ранними стадиями диабетической нефропатии.

Для цитирования:


Бондарь И.А., Климонтов В.В., Надеев А.П., Ким Л.Б. Экскреция гидроксипролина с мочой и локализация коллагена III, IV и VI типов в клубочках почек у больных сахарным диабетом 1-го типа с нефропатией. Проблемы Эндокринологии. 2005;51(4):6-10. https://doi.org/10.14341/probl20055146-10

For citation:


Bondar I.A., Klimontov V.V., Nadeev A.P., Kim L.B. Urinary hydroxyproline excretion and glomerular location of collagen III, IV, and VI in patients with type 1 diabetes mellitus concurrent with nephropathy. Problems of Endocrinology. 2005;51(4):6-10. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl20055146-10

Диабетическая нефропатия (ДН) — одно из наиболее тяжелых осложнений сахарного диабета (СД). Несмотря на достигнутые успехи в ранней диагностике и лечении ДН, частота развития почечной недостаточности при СД 1-го типа остается высокой. Сложность проблемы усугубляется тем, что формирование диабетического гломерулосклероза начинается задолго до снижения функции почек, по-видимому, еще на доклинических стадиях нефропатии [1].

В основе склерозирования почечных клубочков, как и в основе любого склеротического процесса, лежит аккумуляция коллагена. Установлено, что развитие ДН связано с накоплением в базальных мембранах и мезангиальном матриксе клубочков коллагена IV типа [9, 12]. В некоторых исследованиях обнаружены появление коллагена III типа [9, 12] и аккумуляция коллагена VI типа [7, 10, 13] в клубочках при выраженной нефропатии. Экспрессия этих коллагенов в клубочках на ранних стадиях ДН не изучена.

Открытым остается вопрос и о маркерах обмена коллагена, пригодных для клинической практики. Обычно об обмене коллагена судят по экскреции с мочой его метаболитов, в частности гидроксипролина (ГП). Последний присутствует в моче в виде свободной и пептидно-связанной фракций [3]. В некоторых работах показано возрастание экскреции ГП у больных с ДН [2, 15], однако неясно, в какой мере это отражает обмен коллагена в почках.

С учетом изложенного целью работы явилось изучение экскреции свободного и пептидно-связанного ГП с мочой и локализации коллагена III, IV и VI типов в почечных клубочках у больных СД 1-го типа с ранними стадиями нефропатии.

Материалы и методы

Исследование экскреции ГП проведено у 57 больных СД 1-го типа (25 мужчин и 32 женщин в возрасте 16—53 лет; средний возраст 30,6 ± 9,6 года). В исследование не включали больных с нарушением азотовыделительной функции почек, заболеваниями почек недиабетического генеза, патологией костной системы, кетоацидозом, обострением сопутствующих заболеваний. Основные группы обследованных составили пациенты с нормальной экскрецией белка с мочой (группа ДН0; п = 25) и микроальбуминурией (группа ДН]; п = 20), в группу сравнения вошли больные с протеинурией (группа ДН2; п — 12). Клинико-лабораторная характеристика групп приведена в табл. 1. Контрольная группа состояла из 15 здоровых лиц (8 мужчин и 7 женщин) в возрасте 18—48 лет. Содержание пептидно-связанного и свободного ГП определяли в утренней порции мочи по методу П. Н. Шараева и соавт. [3]. Результаты определения уровня ГП позволяли установить количество экскретируемого креатинина.

Морфологические исследования биоптатов почек проведены у 17 больных, в том числе у 11 с нор- моальбуминурией, у 4 с микроальбуминурией и у 2 с протеинурией и нормальным клиренсом креатинина (0,68 и 0,8 г/сут). Пункционную нефробиоп- сию выполняли с целью уточнения характера и выраженности поражения почек у пациентов с диабетической ретинопатией и/или артериальной гипертензией. Пациенты давали письменное информированное согласие на проведение биопсии. Процедуру осуществляли под ультразвуковым контролем в лаборатории ультразвуковой диагностики (зав. — А. В. Сасин) Новосибирской государственной областной клинической больницы. Образцы ткани почек фиксировали в 10% растворе формалина. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реакцией, по Ван-Гизону. Проводили светооптическую микроскопию биоптатов, а также иммуногистохимические исследования локализации коллагена III, IV и VI типов в клубочках стрепто- видин-биотиновым методом с помощью моноклональных антител фирмы "Novocastra Laboratories Ltd" (Великобритания). Контролем служили почки 10 здоровых лиц (5 мужчин и 5 женщин в возрасте 25—42 лет), погибших от несчастных случаев.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета STATISTICA 6.0 (Stat-Soft, 2001) и программы BIOSTATISTICA 4.03 (S. A. Glantz, McGraw Hill, перевод на русский язык — "Практика", 1998). Применяли дисперсионный анализ (ANOVA), многофакторный регрессионный пошаговый анализ. Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро—Уилкса, различия данных оценивали по критерию Стьюдента. В случае множественных сравнений применяли поправку Бонфер- рони. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Данные представлены как средние и стандартные отклонения (М ± SD).

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика групп больных СД

Показатель

Группа обследованных

ДН0 (л = 25)

ДН] (л = 20)

ДН2 (л= 12)

Возраст, годы

31,1 ± 8,2

28,2 ± 10,5

34,2 ± 11,9

Длительность СД, годы

5,5 ± 6,2

5,7 ± 3,1

11,0 ± 7,2*

НЬ А, %

13,2 ± 3,4

13,0 ± 2,4

11,6 ± 2,1

Среднесуточная гликемия, ммоль/л

10,4 ± 3,4

12,3 ± 3,9

11,5 ± 3,8

Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин

102,7 ± 21,9

109,3 ± 17,8

97,6 ± 25,3

Примечание. Звездочка — достоверное различие с группами ДН0 (р = 0,02) и ДН] = 0,007).

Результаты и их обсуждение

Как видно из табл. 2, у больных СД с микроальбуминурией и протеинурией выявлено увеличение содержания пептидно-связанного ГП в моче по сравнению с контрольной группой: в 1,7 раза (р — 0,01) и 2,2 раза (/? = 0,01) соответственно. Тенденция к повышению экскреции свободного ГП не достигала степени статистической значимости. По мере увеличения тяжести нефропатии повышалось отношение пептидно-связанного ГП к свободному. Считается, что уровень пептидно-связанного ГП отражает одновременно степень распада и скорость биосинтеза коллагена [2]. В связи с этим найденное увеличение экскреции пептидно-связанного ГП можно интерпретировать как свидетельство интенсификации метаболизма коллагена у больных СД 1-го типа с микро- и макроальбуминурией.

Зависимость экскреции пептидно-связанного ГП от пола, возраста пациентов, длительности СД, стадии ретинопатии и нефропатии, показателей среднесуточной гликемии была изучена с помощью многофакторного регрессионного анализа. Установлено влияние на экскрецию ГП длительности заболевания и уровня глюкозы в крови (регрессионные коэффициенты 0 = 0,53 и 0 = 0,52 соответственно; коэффициент детерминации R2 = 0,81; р < 0,001). Последнее согласуется с представлениями о роли гипергликемии в активации синтеза коллагена при СД. В опытах in vitro доказано, что в условиях повышенного уровня глюкозы эпителиальные, эндотелиальные и мезангиальные клетки клубочков резко усиливают продукцию коллагена IV типа [5].

При светооптическом исследовании биоптатов у всех обследованных больных выявлены изменения, характерные для начальных стадий ДН, в виде гипертрофии клубочков, расширения мезангиального матрикса, пролиферации мезангиальных клеток, утолщения стенок капилляров, дистрофических и атрофических изменений канальцев. Степень этих изменений варьировала от минимальной до умеренно выраженной. При окраске по Ван-Гизону определялось диффузное расположение коллагеновых волокон в клубочках, более выраженное у больных с микро- и макроальбуминурией. Узелковый тип гломерулосклероза не выявлен ни в одном случае. Очевидно, это объясняется тем, что данный тип склероза клубочков встречается на более поздних стадиях Д Н [ 11 ].

Таблица 2. Экскреция ГП с мочой (в мг/ммоль креатинина) у больных СД 1-го типа с различными стадиями нефропатии

Показатель

Группа обследованных

контроль

ная (л = 15)

ДН0 (л = 25)

ДН, (л = 20)

ДН2 (л = 12)

Пептидно-связанный ГП

3,4 ± 1,8

3,4 ± 3,0

5,8 ± 3,4*

7,6 ± 5,7*

Свободный ГП

1,1 ± 0,9

1,1 ± 1,2

1,5 ± 1,1

1,4 ± 1,1

Отношение пептидно-свя- занный/сво- бодный ГП

3,0 ± 1,4

3,1 ± 1,5

3,9 ± 1,4*

5,4 ± 2,0*

Примечание. Звездочка — достоверное (р < 0,05) различие с контролем.

При иммуногистохимическом исследовании биоптатов коллаген IV типа был обнаружен в базальных мембранах, мезангии и капсуле Боумена у всех больных СД и у лиц контрольной группы. При этом у 8 больных СД (у 6 с нормоальбуминурией, у 1 с микроальбуминурией и у 1 с протеинурией) отмечена диффузно-очаговая аккумуляция коллагена, в 4 случаях с резко положительной реакцией, чего не наблюдалось в контроле. У 6 пациентов этой подгруппы среднесуточное АД превышало 130/80 мм рт. ст. Коллаген IV типа, относящийся к классу минорных (нефибриллярных) коллагенов, является одним из основных структурных элементов мезангия и базальных мембран. В его функции входит обеспечение размероселективности почечного фильтра. Избыточная аккумуляция коллагена IV типа в базальных мембранах и мезангии считается характерным проявлением гломерулосклероза [9, 12].

Положительная реакция на коллаген VI типа в клубочках обнаружена у 7 больных; 4 пациента этой подгруппы имели нормальную экскрецию альбумина, у 3 выявлена микроальбуминурия. Среднесуточное АД у 4 больных оказалось выше 130/80 мм рт. ст. Слабоположительная реакция на коллаген VI типа отмечена у 5 обследованных. В контроле реакция варьировала от отрицательной до слабоположительной. О возможности обнаружения коллагена VI типа в почечных клубочках в норме сообщали и другие авторы [20]. Накопление этого коллагена ранее наблюдали при выраженной ДН в зонах диффузного [7, 13] и узелкового [7, 10, 13] гломерулосклероза. Имеются данные, что аккумуляция коллагена VI типа более характерна для диабетического гломерулосклероза, чем для гломерулопатий другой этиологии [7].

Положительная реакция на коллаген III типа в клубочках зафиксирована у 4 обследованных, еще у 5 выявлена слабоположительная реакция. Среди лиц с депозитами этого типа коллагена нормальную альбуминурию имели 5 пациентов, микроальбуминурию — 3, протеинурию — 1, повышение среднесуточного АД выше 130/80 мм рт. ст. — 5 человек. В контрольной группе коллаген III типа в клубочках не выявлялся. Известно, что в здоровых почках этот тип коллагена присутствует в интер- стиции [12, 18]. Вместе с тем при патологии он может экспрессироваться в клубочках, что зафиксировано, в частности, при гломерулонефритах [18]. Описано накопление коллагена III типа в зонах узелкового [9] и тотального [12] гломерулосклероза у больных СД с выраженной нефропатией. В данной работе мы впервые обнаружили появление этого интерстициального коллагена в клубочках при формирующемся диффузном гломерулосклерозе на ранних стадиях ДН.

Иммуногистохимическое типирование коллагена IV, VI и III типов в биоптате почки больной С. с СД 1-го типа с микроальбуминурией. Окрашивание стрептовидин-биотиновым методом с моноклональными антителами к коллагену IV, VI и III типов. Ув. 400.

а — резко положительная реакция на коллаген IV типа в клубочке, диффузно-очаговый тип; б — положительная реакция на коллаген VI типа в клубочке; в — положительная реакция на коллаген III типа в клубочке; г — контрольное окрашивание без антител.

У всех больных с положительной реакцией на коллаген III типа отмечалась положительная или резко положительная реакция на коллаген IV и VI типов. Примером одновременной аккумуляции коллагена IV, VI и III типов в клубочках может быть представленный на рисунке фрагмент био- птата почки больной С., 19 лет, с длительностью СД 7 лет и микроальбуминурией 116 мг/сут.

При клинико-морфологическом анализе нами не выявлено отличий больных с избыточной локализацией коллагена VI, VI и/или III типов от остальных пациентов по возрасту (27,3 ± 6,4 и 27,8 ± 10,5 года соответственно; р > 0,05), длительности СД (5,2 ± 4,9 и 4,2 ± 3,3 года; р > 0,05), уровню НЬ А (11,9 ± 2,6 и 13,2 ± 3,8%; р > 0,05), скорости клубочковой фильтрации (115,4 ± 16,1 и 105 ± 10,2 мл/мин; р > 0,05). Не было достоверных различий и в экскреции пептидно-связанного ГП (2,6 ± 2,5 и 2,4 ±1,2 мг/ммоль креатинина; р > 0,05). Вместе с тем у пациентов с избыточной аккумуляцией коллагена обнаружены более высокие цифры среднесуточного систолического и диастолического АД (121,5 ± 10,6 и 111,4 ± 7,6 мм рт. ст.; р = 0,06; 79,8 ± 4,8 и 73,4 ± 0,9 мм рт. ст.; р = 0,007). Взаимосвязь депозитов коллагена в клубочках с более высоким уровнем АД может объясняться активацией ренин-ангиотензиновой системы. Ангиотензин II играет важную роль в развитии внутриклубочковой и системной гипертензии при ДН [1, 4] и, кроме того, является мощным стимулятором продукции коллагена [16].

Полученные данные доказывают наличие количественных и качественных изменений содержания коллагена в клубочках почек при СД. По-ви- димому, эти изменения связаны с глубоким нарушением синтетической функции клубочковых клеток. О последнем свидетельствуют и результаты исследований in vitro, в которых показано, что в условиях избытка глюкозы мезангиальные клетки повышают продукцию коллагена IV, а также VI [ 17] и I [19] типов.

Данные об интенсификации метаболизма коллагена и избыточной аккумуляции коллагена IV, III и VI типов в клубочках почек у больных с доклиническими стадиями ДН указывают на важность оценки обмена коллагена и разработки подходов к его коррекции в клинике. Для оценки метаболизма коллагена у больных с ДН можно использовать определение экскреции с мочой пептидно-связанного ГП. Методика отличается доступностью и невысокой стоимостью, однако ее чувствительность на ранних (нормоальбуминурических) стадиях ДН требует уточнения. Вопрос о коррекции обмена коллагена также остается открытым. Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные позволяют рассматривать ингибиторы АПФ [8] и гепарины [6] в качестве перспективных препаратов, способных препятствовать накоплению коллагена в почках при СД.

Выводы

  1. У больных СД 1-го типа наблюдается интенсификация метаболизма коллагена, проявляющаяся увеличением экскреции с мочой пептидно-связанного ГП. Степень изменения метаболизма коллагена взаимосвязана с выраженностью нефропатии.
  2. Развитие нефропатии у больных СД 1-го типа сопровождается избыточной аккумуляцией в клубочках почек коллагена IV и VI типов, а также появлением интерстициального коллагена III типа, в норме не присутствующего в клубочках. Накопление коллагенов начинается на ранних стадиях диффузного гломерулосклероза у больных с нормо- и микроальбуминурией и сопровождается развитием артериальной гипертензии.

Список литературы

1. Дедов И. И., Шестакова M.В. Диабетическая нефропатия. - М., 2000.

2. Казакова И.А., Трусов В.В., Черемискина И.Б. // Клин. лаб. диагн. - 2003. - № 10. - С. 19-22.

3. Шараев П.Н., Ботникова Е.А., Иванов В.М. и др. // Лаб. дело. - 1990. - № 12. - С. 23-25.

4. Brewster U.С, Setaro J.F., Perazella М.А. // Am. J. Med. Sci. - 2003. - Vol.326, № 1. - P. 15-24.

5. Danne Т., Spiro M.J., Spiro R.G. // Diabetes. - 1993. - Vol.42, № 1. - P. 170-177.

6. Gambaro G., D'Angelo A., Del Prete D. et al. // Am. J. Nephrol. - 1999. - Vol.19, № 4. - P. 530-534.

7. Groma V. // Nephrol. Dial. Transplant. - 1998. - Vol.13, № 2. - P. 305-312.

8. McLennan S.V., Kelly D.J., Cox A.J. // Diabetologia. - 2002. - Vol.45, № 2. - P. 268-275.

9. Nerlich A., Schleicher E. // Am. J. Pathol. - 1991. - Vol.139, № 4. - P. 889-899.

10. Nerlich A.G., Schleicher E.D., Wiest I. et al. // Kidney Int. - 1994. - Vol.45, № 6. - P. 1648-1656.

11. Olsen S. // The Kidney and Hypertension in Diabetes Melllitus / Ed. C. E. Mogensen. - Boston, 1994. - P. 141-150.

12. Razzaque M.S., Koji Т., Taguchi T. et al. // J. Pathol. - 1994. - Vol.174, № 2. - P. 131-138.

13. Razzaque M.S., Koji Т., Harada Т., Taguchi T. // Anal. Cell. Pathol. - 1997. - Vol.15, № 3. - P. 175-181.

14. Riser B.L., Cortes P. // Ren. Fail. - 2001. - Vol.23, № 3-4. - P. 459-470.

15. Selby P.L, Shearing P.A., Marshall S.M. // Diabet. Med. - 1995. - Vol.12, № 3. - P. 240-243.

16. Singh R., Alavi N., Singh A.K. et al. // Diabetes. - 1999. - Vol.48, № 10. - P. 2066-2073.

17. Wakisaka M., Spiro M.J., Spiro R.G. // Diabetes. - 1994. - Vol.43, № 1. - P. 95-103.

18. Yoshioka K., Tohda M., Takemura T. et al. // J. Pathol. - 1990. - Vol.162, № 2. - P. 141-148.

19. Zheng F., Fornoni A., Elliot S.J. et al. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. - 2002. - Vol.282, № 4. - P. F639-F648.

20. Zhu D., Kim Y., Steffes M.W. et al. // J. Histochem. Cytochem. - 1994. - Vol.42, № 5. - P. 577-584.


Об авторах

И. А. Бондарь

Новосибирская государственная медицинская академия


Россия


В. В. Климонтов

Новосибирская государственная медицинская академия


Россия


А. П. Надеев

Новосибирская государственная медицинская академия


Россия


Л. Б. Ким

ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН


Россия


Для цитирования:


Бондарь И.А., Климонтов В.В., Надеев А.П., Ким Л.Б. Экскреция гидроксипролина с мочой и локализация коллагена III, IV и VI типов в клубочках почек у больных сахарным диабетом 1-го типа с нефропатией. Проблемы Эндокринологии. 2005;51(4):6-10. https://doi.org/10.14341/probl20055146-10

For citation:


Bondar I.A., Klimontov V.V., Nadeev A.P., Kim L.B. Urinary hydroxyproline excretion and glomerular location of collagen III, IV, and VI in patients with type 1 diabetes mellitus concurrent with nephropathy. Problems of Endocrinology. 2005;51(4):6-10. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/probl20055146-10

Просмотров: 211


ISSN 0375-9660 (Print)
ISSN 2308-1430 (Online)