Состояние тироцитов крыс при окислительном стрессе

Йод играет центральную роль в физиологии щитовидной железы (ЩЖ). Этот микроэлемент является не только незаменимым субстратом для синтеза тиреоидных гормонов, но и регулятором гор- моногенеза и пролиферации тироцитов. Длительное время йодная недостаточность считалась практически единственным фактором, провоцирующим развитие эндемической зобной патологии, а также узловой патологии ЩЖ. Однако увеличение числа заболеваний ЩЖ у лиц, проживающих в экологически неблагоприятных районах [ 1, 6], однозначно свидетельствует о том, что не только дефицит эндогенного йода провоцирует нарушение . функции ЩЖ. Отмечен рост узловой патологии (аденомы, рака, коллоидных узлов), а также аутоиммунного тиреоидита у жителей Маршалловых островов [7, 12], Хиросимы и Нагасаки после взрыва атомной бомбы [19], а также Белоруссии, России и Украины после аварии на Чернобыльской АЭС [1, 15, 16]. Какие же факторы могут стимулировать нарушение функции ЩЖ? До настоящего времени механизмы развития аутоиммунной патологии ЩЖ, возникновения доброкачественных и злокачественных опухолевых узловых образований окончательно не установлены.

‘Работа выполнена при финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (грант № Б01-343).

Хорошо известен ряд специфических структурно-функциональных особенностей клеток ЩЖ: тироциты относятся к немногочисленным клеткам, специализированный метаболизм которых предполагает постоянное образование высоких концентраций активных форм кислорода в ответ на физиологическое стимулирующее действие тиреотропного гормона; важнейшие этапы биосинтеза тиреоидных гормонов в тироцитах теснейшим образом сопряжены с клеточной мембраной: это сим- порт йода недавно открытым специфическим натрий-йодным симпортером [8], окисление йодида ассоциированной на апикальной мембране тиреопероксидазой; органические соединения йода являются внутриклеточными медиаторами, регулирующими рост и пролиферацию клеток ЩЖ.

Эти особенности предполагают, что значительное нарушение процессов поглощения и органи- фикации йода в клетках ЩЖ можно наблюдать в условиях активации окислительного стресса. Активность различных звеньев антиоксидантного статуса ЩЖ детально не исследована, и это представляет особый интерес в связи со специфическим фолликулярным строением ткани ЩЖ, где по сути органификация йода происходит во внеклеточном фолликулярном пространстве.

Основная задача нашей работы — изучить влияние Бе²⁺/аскорбатзависимой активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) на функциональную активность тироцитов органной культуры ЩЖ крыс в условиях культивирования in vitro.

Материалы и методы

Органную культуру ЩЖ крыс получали с использованием метода, отработанного нами ранее для ЩЖ новорожденных поросят и человека [2]. ЩЖ у крыс брали в стерильных условиях и помещали в раствор Хенкса, измельчали до размеров — 1,5 мм³, тщательно отмывали раствором Хенкса ■: помещали в сосуд для культивирования. Культивирование проводили в среде 199 с солями Хенкса, 20 мМ HEPES и L-глутамином, содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 ЕД/мл пенициллина, 10 мг/мл стрептомицина, в закрытых сосудах при 37°С. После 24 ч культивирования отбирали пробы среды для определения в ней содержания трийодтиронина (Т₃) и тироксина (Т₄) (нулевая точка). В культуральную среду вносили Fe²⁺/acKop- бат в концентрациях 0,1 • 10^_3, 0,2* 10~⁴, 0,1 • 10^-4, ?,4 • 10^-5, 0,2 • 10~⁵ М. Пробы среды для определения концентрации гормонов брали через 1, 2, 4, 6 ч и 1,2, 4 сут после добавления прооксидантов. После 1 сут культивирования в присутствии прооксидантов проводили полную замену среды и далее культивирование осуществляли в новой среде (2— 4 сут). В культуральной среде определяли содержание Т₃ и Т₄ радиоиммунологическим методом с использованием наборов ХОП ИБОХ НАН Республики Беларусь, а также концентрацию стабильных альдегидных продуктов ПОЛ, реагирующих с тио- барбитуровой кислотой (ТБКРС) [5].

Результаты и их обсуждение

Внесение в культуральную среду Бе²⁺/аскорбата в концентрациях 0,1 • 10^_3, 0,2 • 10^-4 М сопровождается выраженным повышением содержания стабильных альдегидных продуктов ПОЛ уже через 2 ч (рис. 1).

При концентрации прооксидантов 0,1 • 10~³ М уровень ТБКРС возрастает наиболее значительно — в 2,88—6,76 раза по сравнению с контрольными значениями. Активация свободнорадикального окисления в значительной мере влияет на функциональную активность культивируемых тироцитов. Об этом в первую очередь свидетельствует изменение соотношения синтезируемых гормонов Т₃/Т₄ в среде (рис. 2). Как видно из представленных данных, соотношение Т₃/Т₄ в контрольных пробах сохраняется практически постоянным в течение 24 ч эксперимента. В условиях Ее²⁺/аскорбатзависимой активации ПОЛ наблюдали значительное увеличение (в 1,5—3,0 раза) соотношения Т₃/Т₄ через 2—24 ч при концентрациях прооксидантов 0,1 • 10^_3, 0,2 • 10^-4 М, что обусловлено как повышением уровня Т₃ в среде, так и снижением содержания Т₄.

Рис. 3. Содержание Т₃ в культуральной среде (в % по отношению к нулевой точке) при Ре²⁺/аскорбатзависимой активации ПОЛ. Здесь и на рис. 4 по осям абсцисс за "0" принята точка добавления прооксидантов.

Рис. 4. Содержание Т₄ в культуральной среде (в % по отношению к нулевой точке) при Ре²⁺/аскорбагзависимой активации ПОЛ.

При концентрациях Ре²⁺/аскорбата 0,1 • 10~³, 0,2 • 10~⁴ М на протяжении 2—24 ч наблюдали выраженное повышение (рис. 3), которое составляет 120—250% по сравнению с исходным уровнем (нулевая точка). И лишь к 48 ч опыта уровень Т₃ снижался до контрольных значений. При более низких концентрациях прооксидантов повышение содержания Т₃ в среде менее выражено или отсутствует. Другая закономерность выявлена нами в изменении наработки клетками основного гормона ЩЖ Т₄ (рис. 4). При концентрациях прооксидантов 0,1 • 10~³—0,1 • 10"⁴ М наблюдается, по-видимому, ингибирование синтеза Т₄, поскольку его уровень в культуральной среде снижается на протяжении 2— 24 ч, наиболее выраженно к 6 ч опыта (в 1,7—3,2 раза). При концентрации в среде Ре²⁺/аскорбата 0,4 • 10~⁵ М содержание Т₄ снижается лишь к 6 ч, и только при концентрации Ре²⁺/аскорбата 0,2- 10^-5 ингибирующий эффект прооксидантов отсутствовал, более того, наработка Т₄ тироцитами была еще более значительной, чем в контроле. Уровень Т₄ в среде повышался через 1 ч на 35,0%, далее наблюдали снижение через 4 ч и еще более значимое повышение (на 78,8%) через 24 ч. Необходимо отметить, что незначительная стимуляция синтеза Т₄ отмечена через 1 ч и при более высоких концентрациях в среде прооксидантов, однако в дальнейшем она сменялась угнетением наработки этого гормона.

Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что активация процессов свободнорадикального окисления сопровождается выраженными сдвигами в реакциях синтеза тиреоидных гормонов в клетках ЩЖ. Поскольку активация окислительного стресса вызывает увеличение продукции менее йодированного гормона Т₃ и снижение — более йодированного Т₄, можно полагать, что эти сдвиги обусловлены нарушением процессов орга- нификации йода в тироцитах. Это, по-видимому, возможно, на этапе окисления йода тиреопероксидазой, поскольку установлено, что высокие концентрации Н₂О₂ и супероксидного радикала ингибируют тиреопероксидазу [11]. Кроме того, показано, что Н₂О₂ вызывает повреждение (увеличивает фрагментацию) тиреоглобулина [10]. По-видимому, состояние антиоксидантного статуса тироцитов значительно влияет на их функциональную активность, учитывая, что специализированный метаболизм этих клеток предполагает образование в высокой концентрации активных форм кислорода. Показано, что активация окислительного стресса приводит к индукции апоптоза и некроза тироцитов [9, 18]. Представляют интерес данные авторов, показавших, что важнейший регулятор функции ЩЖ тиреотропный гормон регулирует и транскрипцию тиолспецифического антиоксиданта в ЩЖ [13]. Полученные данные согласуются с более ранними нашими результатами, полученными в экспериментах in vivo, где было установлено, что воздействие внешнего радиационного излучения в дозах 0,25—5,0 Гр сопровождается активацией окислительного стресса в ЩЖ и снижением концентрации Т₄, а в более поздние сроки — и Т₃ в крови крыс [4]. Активацией окислительного стресса в клетках ЩЖ авторы объясняют развитие гипотиреоидного состояния у голубей при голодании [17]. Не исключено, что следствием окислительных повреждений тироцитов является развитие узловой патологии ЩЖ, поскольку в узловой ткани аденомы и рака ЩЖ больных, оперированных по поводу эутиреоидного узлового зоба, обнаружены значительная активация антиоксидантных систем и повышение концентрации токсичных продуктов пероксидации липидов [14].

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что активация окислительного стресса, сопровождающаяся повышением концентрации активных форм кислорода, перекисей, продуктов пероксидации липидов, может рассматриваться как фактор, вызывающий нарушение метаболизма йода в тироцитах, что, по-видимому, может играть определенную роль в патогенезе эндемического и узлового зоба. Однако механизмы реализации ингибирующего эффекта окислительного стресса, безусловно, требуют более детального исследования.

Выводы

1. Ре²⁺/аскорбатзависимая активация окислительного стресса in vitro вызывает увеличение соотношения гормонов Т₃/Т₄ в культуральной среде, что обусловлено снижением экскреции Т₄ и увеличением продукции Т₃ тироцитами органной культуры ЩЖ крыс.
2. Выраженное нарушение экскреции тиреоидных гормонов в условиях активации окислительного стресса свидетельствует о модулирующей роли активных форм кислорода, продуктов пероксидации липидов в отношении процессов биосинтеза тиреоидных гормонов в клетках ЩЖ.