Ультраструктура и функция лимфоцитов крови у детей с впервые выявленным нелеченым сахарным диабетом 1-го типа

В настоящее время установлено, что сахарный диабет 1-го типа (СД1) является аутоиммунным заболеванием, при котором происходит селективная деструкция инсулинпродуцирующих р-клеток поджелудочной железы [3,4, 9]. В результате этого развивается гипоинсулинизм и нарушается гомеостазис глюкозы, т. е. возникает аутоиммунный инсулинзависимый сахарный диабет. Вместе с тем многие иммунные механизмы этиопатогенеза СД1 остаются недостаточно изученными. Как известно, большую роль в механизмах разрушения островков Лангерганса играют различные иммунорегулятор- ные клетки [7, 11]. Имеется значительное количество работ, преимущественно экспериментального характера, в которых приводятся данные о содержании и функции различных субпопуляций лимфоцитов при СД1 [3, 7]. Однако что касается развития СД1 у человека, то по этому вопросу пока нет единого мнения. В определенной мере это объясняется тем, что разные авторы обследовали неидентичные группы больных. Например, к группе пациентов с впервые выявленным СД1 одни авторы относили пациентов, у которых иммунологические показатели определяли непосредственно после установления диагноза, другие — через 3—6 мес после выявления заболевания на фоне инсулино- терапии. При этом вид используемого препарата и курс лечения инсулином были также неодинаковыми. К сожалению, еще и сейчас публикуются работы, в которых иммунофенотип лимфоцитов при СД1 определяют с помощью розеткообразования. Работы, в которых изучали иммунофенотип и функцию лимфоцитов впервые выявленных больных детей до инсулинотерапии с помощью современных методов исследования, единичны и противоречивы [2, 3, 11]. Почти отсутствуют публикации, посвященные субмикроскопическому строению лимфоцитов при СД1, дающие информацию о функции их определенных видов.

В связи с вышеизложенным задачей настоящего исследования явилось изучение количества, ультраструктуры и функции различных популяций лимфоцитов у детей с впервые выявленным СД1, которые до первого взятия крови никогда не получали инсулин или какие-либо другие сахароснижающие средства. Подбор таких больных составлял определенную сложность, так как во многих случаях дети поступают в реанимацию уже в критическом состоянии, нередко даже в коме, и им немедленно вводят инсулин.

Материалы и методы

Обследовано 90 детей обоего пола (42 мальчика и 48 девочек) в возрасте от 8 до 15 лет. Диагноз СД1 у этих детей впервые был поставлен при профилактических осмотрах или при направлении на консультацию к врачам других специальностей согласно классификации и требованиям Комитета экспертов ВОЗ (1999). Все пациенты до определения иммунологических показателей не получали инсулин или другие сахароснижающие препараты. В группу обследуемых были включены только тщательно отобранные больные, у которых отсутствовали какие-либо воспалительные заболевания и не было выраженных сосудистых или других осложнений.

Контрольная группа состояла из 45 практически здоровых детей обоего пола и сопоставимого с больными детьми возраста, у которых уровень глюкозы натощак и после нагрузки был в пределах нормы.

Содержание глюкозы и гликозилированного гемоглобина (НЬ А_|с) в крови определяли общепринятым методом, концентрацию С-пептида в сыворотке крови — радиоиммунологическим методом, используя стандартные наборы "Cis bio-International" (Франция).

Общее число лейкоцитов подсчитывали традиционным способом. Лейкоцитарную формулу определяли в мазках крови на 200 клеток, окрашенных по Паппенгейму, используя фосфатный буферный раствор (pH 6,85), выделяя в отдельную группу большие гранулосодержащие лимфоциты (БГЛ), являющиеся морфологическим гомологом естественных клеток-киллеров (ЕК-клеток).

Определение содержания и распределения лимфоцитов различного иммунологического фенотипа проводили методом проточной цитометрии с использованием лазерного цитофлюориметра "FACS tar plus" фирмы "Becton Dickinson" (CILIA). Моно- нуклеары выделяли методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фи- колла—уротраста и инкубировали в пластиковых чашах в СО₂-инкубаторе в течение 1 ч для устранения моноцитов. Поверхностные антигены лимфоцитов метили моноклональными антителами, маркированными флюоресцеина изотиоционатом или фикоэритрином. Использовали моноклональные антитела фирм "Becton Dickinson" (США) и "Сорбент" (Россия) к поверхностным антигенам: CD3⁺ (все Т-лимфоциты), CD4⁺ (Т-индукторы/хелперы), CD8⁺ (Т-супрессоры/киллеры), CD20⁺ (В-лимфо- циты) и CD56⁺ (ЕК-клетки).

Для электронно-микроскопического исследования выделенную лейкоцитарную пленку фиксировали 2,5% глутаральдегидом на 0,1 М какодилатном буфере фирмы "Fluka" (Германия) с 2% сахарозой, постфиксировали 1% тетраокисью осмия на том же буфере, проводили через спирты и безводный ацетон, заключали в аралдит фирмы "Fluka". Ультра- тонкие срезы готовили на микротоме LKB-8800 (Швеция) и исследовали под электронным микроскопом фирмы JEM-100C (Япония).

У части больных (л = 7) и здоровых детей (л = 10) определяли цитотоксическую активность ЕК-клеток с помощью разработанного нами 4-часового теста. Выделенные из периферической крови (ПК) лимфоциты, очищенные от моноцитов клетки-эффекторы смешивают с клетками-мишенями культуры К562, меченными FITC — йодидом пропидия. Количество лизированных клеток-мишеней определяли с помощью проточного цитофлюориметра "FACS tar plus" фирмы "Becton Dickinson" (США).

Результаты и их обсуждение

Как видно из табл. 1, у детей с впервые выявленным СД1 до назначения им лечения не было обнаружено достоверных изменений со стороны общего количества лейкоцитов, нейтрофилов (палочкоядерных и сегментоядерных) и базофилов в ПК по сравнению с детьми контрольной группы. Наблюдались умеренная лимфоцитопения, в основном за счет значительного снижения количества БГЛ. Относительное и абсолютное содержание эозинофилов и моноцитов в ПК было несколько повышено (р < 0,05).

Для обследуемой группы больных детей было характерно небольшое, но статистически достоверное снижение относительного и абсолютного содержания общего количества Т-лимфоцитов (СОЗ*-клеток) и одной из их важнейших регуляторных субпопуляций — СО4⁺-клеток. Как известно, популяция СЕ)4⁺-клеток является функционально неоднородной. Она состоит из нескольких субклассов (Till и Th2; CD4⁺-, CD25⁺- и CD4⁺-, СО25⁺-клетки), соотношение которых может изменяться неоднозначно в зависимости от влияния различных факторов. Можно предположить, что выявленное снижение количества СО25*-клеток обусловлено миграцией из циркуляции субпопуляций СО4*-клеток, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2 (CD4*-, СО25⁺-клеток), что недавно было описано при первичном СД1 [7, 8].

Таблица 1. Лейкоцитарный состав н иммунофснотип лимфоцитов крови у здоровых детей (л = 55) и детей с впервые выявленным нелеченым СД1 (л = 90) (Л/ ± л»)

Примечание • — р < 0,05 по сравнению со здоровыми детьми

Среднее относительное и абсолютное содержание другой субпопуляции Т-лимфоцитов — CD8*- клеток, как видно из табл. 1, почти не отличалось от такового у здоровых детей. Ввиду этого индекс CD4/CD8 у большинства пациентов был ниже контрольных величин. Процентное содержание В- лимфоцитов (CD20*-клеток) в ПК больных детей не было изменено, но абсолютное их количество было достоверно снижено.

У детей с первые выявленным СД1 отмечалось статистически значимое снижение относительного и абсолютного количества СЭ56⁺-клеток, т. е. экспрессирующих мембранный антиген, наиболее характерный для ЕК-клеток. Подтверждением того, что для многих больных детей с начальной формой СД1 характерно более низкое количество ЕК-клеток в ПК, является также тот факт, что у этих же пациентов отмечалось, как уже указывалось выше, и снижение содержания БГЛ в ПК. Однако снижение количества БГЛ было более выраженным, чем СО56⁺-клеток. Не у всех больных имелась коррекция между изменением числа БГЛ и СО56⁺-клеток, что, по-видимому, объясняется тем, что (как сейчас показано) не все БГЛ являются ЕК-клетками и, наоборот, не все СО56⁺-клетки содержат в цитоплазме азурофильные гранулы, которые являются одним из морфологических признаков БГЛ.

В предыдущих наших исследованиях [3] было показано, что у детей с впервые выявленным СД1 с особенно низким содержанием СО56*-клеток и БГЛ и у их родителей первой линии также наблюдалось значительное снижение количества ЕК-клеток в ПК. Полученные данные позволяют высказать предположение о том, что такие больные с постоянным низким уровнем ЕК-клеток в ПК принадлежат к особому подтипу больных СД1, в этио- патогенезе которого имеется генетически детерминированный дефект ЕК-клеток, возможно, дефект генов, участвующих в иммунорегуляции, существующий до проявления заболевания и являющийся фактором, способствующим возникновению СД1.

При электронно-микроскопическом исследовании лейкоцитов ПК у детей с впервые выявленным СД1 были обнаружены значительные изменения субмикроскопической организации лимфоцитов, содержащих в цитоплазме особые образования — тельца Голла (ТГ), которые считают морфологическим маркером СО4*-клеток или одной из их популяций [ 1]. ТГ представляют собой гранулоподобные образования округлой, эллипсоидной, гантелеподобной или неправильной формы с электронно-светлым центром и электронно-плотной периферией. Соотношение этих двух разных по электронной плотности частей варьирует. Возле ТГ нередко определяется кластер электрон но-плотных гранул разного размера.

Ультраструктура лимфоцитов крови, содержащих ТГ (а—в) и БГЛ (г—е).

По сравнению с лимфоцитами, содержащими ТГ, в ПК. здоровых детей (см. рисунок, а), лимфоциты с ТГ больных детей (см. рисунок, б, в) имели более высокое ядерно-цитоплазматическое отношение, более диспергированный хроматин в ядре и большое ядрышко с хорошо выраженным фибриллярным центром и обширной ячеистой периферией, что характерно для клеток с повышенной активностью. Кластер гранул вокруг ТГ в цитоплазме таких клеток состоял из значительно большего количества гранул, которые были гетерогенны как по размеру, так и по электронной плотности. Полученные нами данные согласуются с результатами работы [10], в которой показано, что у больных с начальной формой СД1 наряду со снижением количества СО4⁺-клеток отмечается значительное повышение количества активированных форм этой субпопуляции (CD4⁺ НLA-DR).

Значительные изменения ульраструктуры были выявлены также в ЕК-клетках ПК больных. Как уже указывалось, морфологически большинство ЕК-клеток выглядит как БГЛ, т. е. являются клетками, содержащими в обильной цитоплазме азуро- фильные гранулы (см. рисунок, г). На ультраструк- турном уровне в цитоплазме этих клеток выявляются также специфические субмикроскопические образования, получившие название параллельнотрубчатых структур (ПТС), которые в световом микроскопе не видны. У нелеченых больных с только что диагностированным СД1 (см. рисунок, д, е) снижены количество и размер ПТС и азуро- фильных гранул. Последние являются основной органеллой БГЛ, секретирующих перфорин, цитолизины, цитокины, разрыхление их электронноплотного в норме матрикса, а также значительное расширение канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума, структурных компонентов комплекса Гольджи и набухание митохондрий, что можно считать достоверными признаками ослабления цитолитической и секреторной функций ЕК- клеток [3].

Выявленные изменения ультраструктуры БГЛ подтверждаются проведенными нами исследованиями цитотоксической активности ЕК-клеток у обследуемых больных, у них было обнаружено достоверное снижение цитолитической способности ЕК-клеток к клеткам-мишеням культуры К-562 в пропорции 20:1 (28,67 ± 5,8% против 47,50 ± 6,4%, р < 0,05). При этом наблюдалась хорошая корреляция между снижением числа БГЛ и процентом цитотоксичности. Полученные данные согласуются с работами других авторов [5], в которых у впервые выявленных больных СД1 также было обнаружено ослабление цитолитической активности ЕК-клеток при их определении с помощью цитотоксического теста с радиоактивным хромом.

При анализе полученных данных, естественно, возникает вопрос, не являются ли обнаруженные изменения показателей Т- и ЕК-клеточного иммунитета не столько следствием гипоинсулинизма, сколько отражением метаболических нарушений, возникающих в результате недостатка инсулина или каких-либо других причин. В связи с этим у части пациентов (37 человек), у которых через 3 мес после адекватной интенсивной терапии высо- 12 кокачественными препаратами человеческого инсулина (фирм "Novo Nordisk или "Eli Lilly") отмечалась нормализация уровня глюкозы и НЬ А_1с, определенных натощак (табл. 2), были повторно определены все исследуемые показатели. При контроле качества лечения мы придерживались основных показателей, предложенных Европейской установочной группой по СД1 [16].

Как видно из табл. 2, у больных СД1 детей с хорошо контролируемым уровнем углеводного обмена не произошло ожидаемого полного достоверного восстановления показателей иммунитета, не-

Таблица 2 Содержание глюкозы, НЬ А_|с, С-псптида, лейкоцитарный состав и иммунофснотип лимфоцитов в П К детей с впервые выявленным СД1 натощак до и после инсулинотерапии в течение 3 мес

Примечание. * — р < 0,05 ло сравнению с показателями до инсулинотерапии.

смотря на лечение, а относительное содержание СD8⁺-клеток еще больше снизилось.

Для больных детей до лечения было также характерно низкое содержание С-пептида в ПК (0,36 ± 0,02 нг/л против 0,98 ± 0,02 нг/л в норме; р < 0,05). После инсулинотерапии, как видно из табл. 2, не отмечено достоверного изменения среднего содержания С-пептида, так как у части больных его уровень оставался прежним, в то время как у другой, меньшей части он даже повышался. Это согласуется с известными данными [3], указывающими на то, что на самых начальных этапах заболевания после инсулинотерапии возможно повышение образования С-пептида в ПК вследствие устранения тормозящего влияния гипергликемии на еще оставшиеся, способные к функционированию островки Лангерганса.

При электронно-микроскопическом исследовании лимфоцитов ПК у детей, находившихся на заместительной терапии в течение 3 мес, сохранялись те же изменения ультрастурктуры лимфоцитов, что и до лечения. Следует также отметить, что, как показали наши предыдущие наблюдения, у детей, болеющих СД1 более длительный срок (2—5 лет), отмечаются подобные, но еще более выраженные изменения Т- и ЕК-клеточного иммунитета [3].

Таким образом, проведенные исследования показали, что у детей с впервые выявленным СД1 после 3-месячной заместительной инсулинотерапии, приводящей к существенной нормализации углеводного обмена, сохраняются низкие показатели Т- и ЕК-клеточного иммунитета, подобные таковым до лечения. Очевидно, что при компенсации недостаточного экзогенного инсулина удается устранить нарушения метаболизма и сохранить жизнь больных на многие годы, но не нормализовать иммунные нарушения. В связи с этим можно высказать несколько предположений. Во-первых, экзогенный человеческий инсулин все же не совсем идентичен эндогенному, так как при инсулинотерапии не удается полностью моделировать естественные циркадные колебания концентрации гормона в организме. Во-вторых, возможно также, что после разрушения р-клеток прекращается образование не только инсулина, но и каких-то других биологически активных соединений, которые совместно с инсулином или самостоятельно принимают участие в регуляции иммунитета, в частности пептида амилина, который также секретируется р- клетками и оказывает действие, синергичное с инсулином. Недостаточна информация и об участии в аутоиммунных процессах контринсулярных факторов — глюкагона и лептина. Не исключено, что у больных СД1 могут быть и нарушения внепанкреа- тических факторов, имеющих отношение к иммунитету, в частности со стороны генов, контролирующих Т- и ЕК-клеточный иммунитет, что может предшествовать развитию этого заболевания. Можно предположить, что у детей с ослаблением системы Т- и особенно ЕК-клеток, т. е. главной естественной противовирусной системы защиты, различные вирусные заболевания протекают острее, поражая многие жизненно важные органы, в том числе островки Лангерганса поджелудочной железы.

Заключение

У детей с впервые выявленным нелеченым СД1 отмечается небольшое, но статистически достоверное снижение в ПК относительного и абсолютного количества CD3⁺-, CD4⁺-, СО56⁺-клеток, индекса CD4/CD8 и особенно БГЛ (морфологического гомолога ЕК-клеток). Ультраструктурно в CD4⁺- клетках (лимфоцитах, содержащих ТГ) выявляются признаки повышенной функциональной активности, в то время как в ЕК-клетках (БГЛ) — ее снижение. Трехмесячная инсулинотерапия, приводящая к восстановлению содержания глюкозы и НЬ А_|с в ПК, не вызывает нормализации выявленных изменений показателей Т- и ЕК-клеточного иммунитета. Это дает повод предположить, что либо введение экзогенного инсулина не полностью идентично эндогенно секретируемому инсулину с его циркадными колебаниями, либо обнаруженные изменения обусловлены не только гипоинсулиниз- мом, но и другими факторами, связанными с нарушениями иммунного статуса, в частности генетическими и вирусными, которые могут предшествовать развитию заболевания.