Роль опиоидных пептидов в регуляции пролиферации лимфоцитов и изменении Тh1/Тh2-цитокинового профиля

Поддержание внутреннего гомеостаза определяется взаимодействием трех основных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной. В настоящее время известно, что иммунная система многокомпонентна и ее функционирование обеспечивается сложной сетью взаимосвязанных сигналов. Эндогенные опиоидные пептиды являются одними из важнейших посредников во взаимодействии нервной и иммунной систем, кроме этого, они представляют собой группу факторов, играющих ключевую роль в процессах адаптации организма [8, 14]. Несмотря на то что изучению влияния эндогенных опиоидных пептидов на процессы пролиферации уделено достаточно много внимания [1,2, 11], вопрос о механизмах реализации эффектов опиоидов, в частности р-эндорфина, способного действовать через несколько типов опиатных рецепторов, остается актуальным. Также недостаточно изученной остается проблема влияния опиоидных пептидов на продукцию ряда ключевых цитокинов (у- IFN, IL-4, IL-10, 1L-12), являющихся маркерными для регуляторных Т-лимфоцитов 1-го и 2-го типа (ТМ/Тп2) и определяющих выбор типа иммунного ответа [4, 12, 13]. Цель работы - оценка влияния p-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов и селективных 5- и р- агонистов на пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro и установка взаимосвязи пролиферативных процессов с продукцией IL-lp, y-IFN и IL-4.

Материалы и методы

Объектом исследования служили лейкоциты периферической венозной крови здоровых мужчин-добровольцев в возрасте 22—30 лет. Лейкоциты культивировали с фитогемагглютинином Р — ФГА ("Sigma"; конечная концентрация в культуре составляла 2,5 мкг/мл) в 96-луноч- ных круглодонных планшетах. Каждая культура содержала 2* 10⁵ клеток в 0,2 мл полной питательной среды, которую готовили на основе среды 199 с добавлением 10 мм HEPES ("Sigma"), 2 мМ L-глутамина ("Sigma"), 100 мкг/мл гентамицина и 10% аугоплазмы. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО₂ при 37*С в течение 72 ч. За 18 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи ³Н-метил- тимидина ("Изотоп", Санкт-Петербург) в объеме 10 мкл. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Guardian" ("Wallac", Финляндия).

В эксперименте использовали р-эндорфин ("Sigma") в концентрации 10“⁷ М; ц-агонист DAMGO (]d-Ala₂, N- Me-Phe₄, С1у₅-о1]-энкефалин; "Sigma") - Ю~* M; 5-агонист DADLE ([d-Ala₂, d-LeUjl-энкефалин; "Sigma") - 10“⁷ M; налоксона гидрохлорид ("DuPont", CILIA) - 10^-6 M. Выбор концентрации опиоидов и ФГА основывался на исследованиях, проведенных ранее [1]. При оценке пролиферации все исследуемые соединения вносили в культуру в двух вариантах: одномоментно с митогеном и за 1 ч до внесения митогена (клетки обрабатывали опиоидами в течение 1 ч при 37*С, затем в культуры вносили 2,5 мкг/мл ФГА).

Концентрацию IL-ip, IL-4 и y-IFN определяли при одномоментном внесении опиоидов и ФГА в супернатантах 48-часовых культур параллельно оценке пролиферативной активности. Применяли метод ELISA с использованием наборов "РгоСоп" ("Протеиновый контур", Санкт-Петербург). Определение проводили в соответствии со стандартной методикой, предложенной производителем.

Все полученные в работе данные представлены в виде средней и ее стандартной ошибки (Л/ ± т). Использовали корреляционный, факторный анализ для парных данных с p-эндорфином и налоксоном в качестве факторов и парный t-критерий для межгруппового сравнения.

Результаты и их обсуждение

Анализ влияния p-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов налоксоном гидрохлоридом показал наличие статистически значимого самостоятельного влияния как p-эндорфина (F = 7,53; р = 0,025), так и налоксона (F = 9,27; р = 0,016) на пролиферацию лимфоцитов в присутствии ФГА. Статистически значимого воздействия между собой (F = 0,439; р = 0,526) Р-эндорфин и налоксон не проявили. Оценка направленности их эффектов показала (рис. 1) стимулирующее влияние р- эндорфина на выраженность реакции бласттрансформа- ции лимфоцитов (РБТЛ) по сравнению с контрольными культурами. Блокада опиатных рецепторов налоксоном не отменяла стимулирующего эффекта Р-эндорфина а напротив, приводила к статистически достоверному усилению пролиферации по сравнению как с контролем так и с эффектом одного Р-эндорфина. Аналогичное р’-эн- дорфину влияние на выраженность пролиферативного ответа оказывали налоксон, а также селективные ц и ₅- агонисты В культуре без митогена статистически досто верных эффектов исследуемых опиоидовне выявлено

^Не было зарегистрировано ответа на включение ³Н- тимидина при предварительной обработке^течение ^{1 4} Х^™вГьЗ^^ИИ_иг™^орфино“'^{нмоксон}™"™' же селективными ц- и 8-агонистами как в стимулирован- ных ФГА, так и в нестимулироинных культур^Црис 2).

Оценку уровня IL-ip, y-IFN и IL-4 проводили параллельно определению пролиферативной активности с целью исследования взаимосвязи между пролиферативными процессами и направлением дифференцировки Т- лимфоцитов (Thl/Th2). Как видно из таблицы, уровень y-IFN в супернатантах под воздействием Р-эндорфина, его комбинации с налоксоном и селективных ц- и 8-агонистов не отличался от контроля как в спонтанных, так и в стимулированных ФГА культурах. Анализ влияния р- эндорфина и налоксона на ФГА-индуцированную продукцию IL-4 показал их статистически достоверное взаимодействие (F = 36,5; р < 0,0003). p-Эндорфин значительно активировал синтез 1L-4. Аналогичный р-эндор- фину эффект давал налоксон. В то же время при одновременном внесении в культуру p-эндорфина и налоксона усиления продукции IL-4 по сравнению с контролем не зарегистрировано. Активирующее влияние на синтез IL-4 в присутствии ФГА оказывал 5-агонист DADLE. При анализе влияния опиоидов на спонтанную продукцию IL-4 был выявлен статистически значимый эффект налоксона (F = 6,61; р < 0,05). Антагонист опиатных рецепторов угнетал синтез этого цитокина по сравнению с контрольными культурами. p-Эндорфин, его комбинация с налоксоном, а также селективные агонисты ц- и 8- рецепторов в нестимулированных митогеном культурах влияния на уровень IL-4 не оказывали. Анализ продукции IL-ip показал отсутствие влияния исследуемых опиоидов на этот показатель как в спонтанных, так и в стимулированных ФГА образцах.

Проведенный корреляционный анализ выявил статистически достоверную отрицательную зависимость между интенсивностью пролиферации и уровнем IL-4 в культурах с совместным внесением p-эндорфина и налоксона в присутствии ФГА (г = -0,68; р < 0,05).

Ранее в литературе уже была описана возможность как супрессивного, так и активирующего влияния р-эн- дорфина на выраженность РБТЛ преимущественно в присутствии низких концентраций митогена [1, 2]. Отсутствие влияния Р-эндорфина, налоксона и селективных ц- и 8-агонистов на спонтанную пролиферативную активность может служить свидетельством того, что опиоидные пептиды являются важными факторами регуляции уже активированных иммунокомпетентных клеток.

Стимулирующая направленность влияния р-эндор- фина, налоксона и селективных агонистов 8- и ц-опиат- ных рецепторов на РБТЛ, на наш взгляд, опосредована прежде всего системой IL-1, поскольку этот цитокин играет ключевую роль в запуске иммунного ответа как in vivo, так и in vitro. Показано, что Р-эндорфин способен стимулировать синтез IL-ip [3] и его антагониста IL-lpa моноцитами-макрофагами на фоне их стимуляции липополисахаридом [6]. Способность модулировать систему IL-1 была показана и для ФГА [5]. Отсутствие в нашем случае влияния опиоидов на IL-ip объясняется, с одной стороны, сроками измерения, поскольку пик синтеза IL- 1Р наступает через 12 часов культивирования, а с другой — увеличением концентрации IL-4, подавляющего экспрессию IL-1Р и активирующего экспрессию гена антагониста IL-lpa [10].

Известно, что Р-эндорфин способен усиливать синтез 1L-4 СО4⁺-лимфоцитами [4]. Кроме прямого влияния опиоидов на Т-лимфоциты, увеличение уровня IL-4, как и усиление пролиферативного ответа, может быть опосредовано системой IL-1, поскольку для реализации эффекта IL-1 р требуется присутствие ТЬ2-клеток [9]. Таким образом, p-эндорфин, налоксон и селективный агонист 5-рецепторов DADLE, усиливая пролиферацию, способствуют изменению соотношения Т-хелперов в сторону ТЪ2-клеток.

Ранее было показано отсутствие отмены влияния р- эндорфина на пролиферативный ответ на фоне блокады опиатных рецепторов [8]. Суммация действия р-эндор- фина и налоксона на пролиферативный ответ связана с наличием у налоксона самостоятельного стимулирующего влияния, а также с существованием в пределах ц-опи- атного рецептора различных доменов связывания для опиоидных алкалоидов и пептидов [7]. В то же время при выраженном изолированном влиянии p-эндорфина и налоксона на синтез IL-4 их совместное применение не дало эффекта, что может свидетельствовать о различных механизмах влияния опиоидов на пролиферацию и ци- токиновый синтез.

Сравнительный анализ действия p-эндорфина и селективных агонистов 8- и ц-рецепторов пептидной природы не показал существенной разницы в выраженности и направленности их влияния как на РБТЛ, так и на ФГА-индуцированную продукцию IL-ip, y-IFN и IL-4.

Таким образом, полученные в настоящей работе данные указывают на то, что опиоидергическая регуляция пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток является сложным многофакторным процессом, в котором как агонисты, так и антагонисты опиатных рецепторов способны давать самостоятельные модулирующие эффекты.

Выводы

1. β-эндорфин, налоксон и селективные ц- и 8-агонисты оказывали активирующее влияние на ФГА-индуцированную пролиферативную активность лимфоцитов, не влияя на спонтанный пролиферативный ответ.
2. На фоне блокады опиатных рецепторов наблюдалась суммация стимулирующего влияния β-эндорфина и налоксона на выраженность пролиферативного ответа лимфоцитов.
3. β-эндорфин, налоксон и селективный агонист 8- рецепторов усиливали продукцию IL-4, способствуя переключению направления дифференцировки Т-лимфоцитов в сторону Т112-клеток.